Антитело против опухолеспецифичных антигенов в качестве мишени

Антитело против опухолеспецифичных антигенов в качестве мишени

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам, которые могут использоваться при лечении рака, к фармацевтической композиции для лечения рака, характеризующейся тем, что она содержит антитело в качестве активного ингредиента, к способу обнаружения рака и к набору для обнаружения рака.

Уровень техники

Известно, что опухолевые клетки экспрессируют антигенные белки, которые присущи конкретному типу опухолевых клеток (здесь иногда называемые «опухолеспецифичными антигенами»). Были предприняты попытки разработать новые способы лечения опухолей путем воздействия на опухолеспецифичные антигены. Известно, что моноклональные антитела, которые индуцируют реакцию антиген-антитело, специфичную для таких опухолеспецифичных антигенов, индуцируют различные типы иммунных реакций in vivo (антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и т.д.) для атаки на раковые клетки, индуцируя, таким образом, клеточную смерть. Были разработаны моноклональные антитела, которые могут использоваться при лечении опухолей.

Однако разнообразие моноклональных антител, которые могут использоваться при лечении опухолей, ограничено. Доступные в настоящее время моноклональные антитела могут использоваться для лечения только немногих типов опухолей, включающих метастатический рак молочной железы, острый лейкемический миелоз, хроническую лимфому, трудно поддающуюся лечению, неходжкинскую лимфому и множественную миелому. Разработка моноклональных антител для лечения других опухолей является желательной.

Для получения моноклональных антител, которые могут использоваться для лечения рака, необходимо идентифицировать белок, специфически экспрессируемый в опухолевой клетке, и получить моноклональное антитело против этого белкового антигена.

Человеческий белок окулоспанина был получен в качестве клона маркерных экспрессирующих последовательностей (EST) гена, экспрессируемого на пигментном эпителии сетчатки и хороидальной мембране глаза (Molecular Vision (2002) 8, 25-220). Ген человеческого белка окулоспанина имеет открытую рамку считывания 1068 п.о. Человеческий белок окулоспанина состоит из 355 аминокислот и имеет вычисленную на основе последовательности ДНК молекулярную массу 36,4 кДа. Однако взаимосвязь между человеческим белком окулоспанина и опухолями до сих пор не известна.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения рака посредством нахождения гена, специфически экспрессируемого в раковой клетке, и определения экспрессии этого гена, к набору для обнаружения рака, используемого в способе обнаружения, к антителу, которое специфически связывает продукт экспрессии гена, к антителу, обладающему цитотоксической активностью, и к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей указанное антитело в качестве активного ингредиента.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали ген, специфически экспрессируемый в опухолевой ткани человека, и обнаружили, что уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина с неизвестной функцией значительно выше в клетках меланомы. На основании этого обнаружения удалось разработать способ обнаружения рака, используя указанный ген, набор для обнаружения рака и фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую антитело против человеческого белка окулоспанина, которые являются объектом настоящего изобретения.

Более конкретно настоящее изобретение относится:

(1) к антителу, которое специфически связывается с человеческим белком окулоспанина и обладает цитотоксической активностью в отношении клетки, экспрессирующей этот белок;

(2) к антителу, которое специфически связывается с белком, содержащим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, и/или аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 из списка последовательностей, и которое обладает цитотоксической активностью в отношении клетки, экспрессирующей этот белок (эти белки);

(3) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью;

(4) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является комплемент-зависимой цитотоксичностью;

(5) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является комплемент-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью;

(6) к антителу по пункту (1) или (2), отличающемуся тем, что цитотоксическая активность является индукцией апоптоза;

(7) к антителу по любому из пунктов (1)-(6), отличающемуся тем, что антитело является моноклональным антителом;

(8) к антителу по пункту (7), отличающемуся тем, что антитело продуцируется мышиной гибридомой О3В8-2С9-4F3 (FERM BP-08627);

(9) к антителу по любому из пунктов (1)-(8), отличающемуся тем, что антитело является гуманизированным;

(10) к антителу по любому из пунктов (1)-(7), отличающемуся тем, что антитело является полным человеческим антителом;

(11) к антителу по любому из пунктов (1)-(10), отличающемуся тем, что антитело является IgG-антителом;

(12) к способу обнаружения рака, который включает в себя следующие стадии 1)-4):

1) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у исследуемого индивидуума;

2) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у здорового индивидуума;

3) стадию измерения уровня экспрессии полинуклеотида, представленного в нижеприведенных пунктах а) или b), во всех фракциях общей РНК, полученных на стадиях 1) и 2):

а) полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей;

b) полинуклеотида, который гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности полинуклеотида по пункту а), в жестких условиях; и

4) стадию анализа различия уровня экспрессии полинуклеотида между фракциями общей РНК, полученными на стадии 1) и стадии 2), измеренного на стадии 3), и таким образом, определения наличия рака у исследуемого индивидуума, который указан на стадии 1);

(13) к способу обнаружения рака, который включает в себя стадии 1)-3):

1) стадию измерения уровня экспрессии белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, и/или уровня экспрессии белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4, в образце, взятом у исследуемого индивидуума;

2) стадию измерения уровня экспрессии по меньшей мере одного белка в соответствии со стадией 1) в образце, взятом у здорового индивидуума; и

3) стадию анализа различия уровня экспрессии между белком, определенным на стадии 1), и белком, определенным на стадии 2), и таким образом, определения наличия рака у исследуемого индивидуума;

(14) к способу по любому из пунктов 12 или 13, отличающемуся тем, что раком является рак кожи;

(15) к способу по любому из пунктов 12 или 13, отличающемуся тем, что раком является меланома;

(16) к способу по любому из пунктов (12), (14) или (15), отличающийся тем, что уровень экспрессии полинуклеотида измеряют Нозерн-блоттингом, дот-блоттингом, слот-блоттингом, ОТ-ПЦР, анализом рибонуклеазной защиты или «run-on»-анализом;

(17) к способу по любому из пунктов (12), (14) или (15), отличающемуся тем, что уровень экспрессии полинуклеотида измеряют с использованием генного чипа или матрицы, полученной из ДНК, содержащей комплементарные ДНК, полученные из указанного образца, или части последовательностей, комплементарных ДНК;

(18) к способу по любому из пунктов (13)-(15), отличающемуся тем, что уровень экспрессии белка измеряют с помощью антитела или лиганда, которые специфически связываются с белком;

(19) к способу по любому из пунктов (13)-(15), отличающемуся тем, что уровень экспрессии белка измеряют Вестерн-блоттингом, дот-блоттингом, слот-блоттингом или твердофазным иммуноферментным анализом (метод ELISA);

(20) к набору для обнаружения рака, содержащему по меньшей мере один компонент, выбранный из нижеследующих 1)-3):

1) олигонуклеотидного праймера с длиной 15-30 оснований для специфической амплификации полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей;

2) полинуклеотидного зонда из по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, способного гибридизоваться с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, в жестких условиях, и таким образом определять полинуклеотид; и

3) иммобилизованного образца, имеющего полинуклеотид содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, иммобилизованный на нем;

(21) к набору для обнаружения рака, содержащему по меньшей мере один из нижеследующих компонентов 1) и 2):

1) антитело, способное специфически связываться с белком, содержащим аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей, и/или аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 из списка последовательностей, и таким образом определять белок/белки;

2) вторичное антитело, способное связываться с антителом в соответствии с пунктом 1) выше;

(22) к набору в соответствии с пунктами (20) или (21), отличающемуся тем, что раком является рак кожи;

(23) к набору в соответствии с пунктами (20) или (21), отличающемуся тем, что раком является меланома;

(24) к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей по меньшей мере одно антитело в соответствии с пунктами (1)-(11);

(25) к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, или часть последовательности нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;

(26) к фармацевтической композиции в соответствии с пунктами (24) или (25), отличающейся тем, что раком является рак кожи; и

(27) к фармацевтической композиции в соответствии с пунктом (24) или (25), отличающейся тем, что раком является меланома.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 верхняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в различных типах клеток; и нижняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах кожи здорового человека и в пробах меланомы;

На фиг.2 верхняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах кожи здорового человека и в пробах меланомы, полученных из ткани кожи; и нижняя фигура является диаграммой, показывающей уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах кожи здорового человека и в пробах меланомы, взятых из ткани лимфатического узла;

На фиг.3 представлена диаграмма, показывающая уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в пробах, взятых из лимфатического узла здорового человека, и пробах меланомы, взятых из ткани лимфатического узла;

На фиг.4 представлена экспрессия продуктов гена человеческого белка окулоспанина в клетках NIH3T3; и

На фиг.5 представлена диаграмма, на которой показана антитело-зависимая цитотоксическая активность антитела в отношении человеческого белка окулоспанина в клетке, экспрессирующей человеческой белок окулоспанина.

Наилучший способ осуществления изобретения

В описании изобретения соединением, обладающим терапевтическим действием на рак, является соединение, обладающее активностью, подавляющей рост раковой опухоли и/или активностью, уменьшающей раковую опухоль. В описании изобретения термины "рак" и "опухоль" имеют одно и то же значение. Термин "ген", используемый в данном описании, включает в себя не только ДНК, но также мРНК, кДНК и кРНК. Таким образом, термин "ген человеческого белка окулоспанина", используемый в данном описании, включает в себя ДНК, мРНК, кДНК и кРНК гена человеческого белка окулоспанина. Термин "полинуклеотид", используемый в данном описании, имеет значение, аналогичное значению нуклеиновой кислоты, и, следовательно, включает в себя ДНК, РНК, зонд, олигонуклеотид и праймер. Термины "полипептид" и "белок" используются в данном описании взаимозаменяемо. Термин "фракция РНК", используемый в данном описании, относится к фракции, содержащей РНК. Кроме того, под термином "клетка" понимают клетку организма животного и культивируемую клетку. Термин "малигнизация клетки", используемый в данном описании, относится к патологической пролиферации клеток, которая вызвана отсутствием чувствительности к контактному ингибированию и их пролиферации, зависимой от независимой пролиферации. Клетка с такой патологической пролиферацией называется «раковой клеткой». В данном описании белок, обладающий такой же функцией, как и человеческой белок окулоспанина, например способностью к малигнизации, также называют «человеческим белком окулоспанина». Следует обратить внимание на то, что используемый термин «онкоген», включает в себя предраковый ген и протоонкоген, иной чем онкоген.

Термин «цитотоксичность», используемый в данном описании, относится к патологическому изменению в клетке, вызванному любой причиной. Таким образом, цитотоксичность включает в себя не только непосредственное повреждение извне, но также различные структурные и функциональные изменения, которые могут возникнуть внутри клетки и которые включают в себя расщепление ДНК, димеризацию оснований, хромосомное расщепление, нарушение функции митотического аппарата клетки и снижение ферментативной активности. Термин «цитотоксическая активность» относится к любой активности, которая вызывает цитотоксичность, как указано выше.

Термин «гибридизуется в жестких условиях» относится к гибридизации, которую осуществляют при 68°С в коммерчески доступном растворе для гибридизации, а именно, в ExpressHyb (производимом Clontech), или к гибридизации, которую осуществляют при 68°С в присутствии NaCl, от 0,7 до 1,0М, используя фильтр с иммобилизованной на нем ДНК, с последующей промывкой при 68°С 0,1-2Х раствором SSC (1Х раствор SSC содержит 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрат натрия), что приводит к гибридизации. Приведенный выше термин включает в себя также гибридизацию в условиях, эквивалентных вышеуказанным.

1. Человеческой белок окулоспанина

(1) Подтверждение специфической экспрессии гена человеческого белка окулоспанина

В результате анализа уровней экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в различных типах клеток человека было обнаружено, что значительная экспрессия указанного гена наблюдается в меланоцитах по сравнению с другими тканями. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина в меланоме значительно выше, чем экспрессия в нормальных меланоцитах. Более конкретно, было обнаружено следующее: при сравнении уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в меланоцитах, лимфобластах и глиальных клетках и эпителиальных клеток было обнаружено, что уровень экспрессии в меланоцитах является значительно более высоким. Кроме того, при сравнении уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в нормальных клетках кожи и уровня экспрессии окулоспанина в клетках меланомы оказалось, что уровень экспрессии значительно выше в меланоме. На основании этого обнаружения был сделан вывод, что человеческий белок окулоспанина может быть вовлечен в малигнизацию клеток и/или в пролиферацию раковых клеток. Это предполагает, что состояние малигнизации и/или состояние пролиферации раковых клеток, вызванное избыточной экспрессией человеческого белка окулоспанина, может быть определено измерением уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в отдельных клетках и/или тканях. Примером такого рака является рак кожи, в частности меланома. Однако этот факт применим к другим типам рака, кроме рака кожи, при условии что экспрессия человеческого белка окулоспанина в этих раковых клетках значительно выше в других тканях.

Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена человеческого белка окулоспанина представлена SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, и его аминокислотная последовательность представлена SEQ ID NO:2. Кроме того, кДНК гена человеческого белка окулоспанина зарегистрирована в GenBank как мРНК окулоспанина Homo sapiens (OCSP) под инвентарным номером No. NM_031945. Нуклеотидная последовательность кДНК, зарегистрированная в GenBank, представлена SEQ ID NO:3 из списка последовательностей. ORF представлена нуклеотидами с номерами 65-1129 SEQ ID NO:3. Кроме того, аминокислотная последовательность человеческого белка окулоспанина, зарегистрированная в GenBank, представлена SEQ ID NO:4 из списка последовательностей. Белок, содержащий аминокислотную последовательность с одной или несколькими заменами, делециями или добавлениями аминокислот в аминокислотную последовательность человеческого белка окулоспанина и проявляющий такую же биологическую активность, как и активность человеческого белка окулоспанина, также включен в данное описание как человеческий белок окулоспанина.

2. Способ обнаружения рака

Полагают, что человеческий белок окулоспанина из-за своей высокой степени экспрессии в раковых клетках, в частности в меланоме, участвует в малигнизации клеток, в частности клеток кожи, и/или в пролиферации раковых клеток. Термин «образец» относится к пробе, взятой у исследуемого индивидуума, или к клиническому образцу и включает в себя образец тканей, экскрементов или тому подобное, например образцы крови, воды в организме, предстательной железы, яичек, полового члена, мочевого пузыря, почки, полости рта, глотки, губы, языка, десен, носоглотки, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, ободочной кишки, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, носа, легкого, кости, мягкой ткани, кожи, молочной железы, матки, яичника, головного мозга, щитовидной железы, лимфатического узла, мышцы и жировой ткани. В настоящем изобретении предпочтительными пробами ткани являются кожа и лимфатический узел.

(1) Способ обнаружения рака, используя уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина.

Способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина включает в себя, конкретно, следующие стадии, от 1) до 4):

1) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у исследуемого индивидуума;

2) стадию экстрагирования фракции общей РНК из образца, взятого у здорового индивидуума;

3) стадию измерения уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина во фракциях общей РНК в соответствии со стадиями 1) и 2) и

4) стадию анализа различия в уровне экспрессии гена между фракциями общей РНК, полученными из стадий 1) и 2), измеренном на стадии 3), и таким образом, определения наличия рака у исследуемого индивидуума стадии 1).

Отдельные стадии будут объяснены более конкретно ниже.

а) Стадия 1): Экстрагирование фракции общей РНК из образца, взятого у исследуемого индивидуума.

При экстрагировании фракции общей РНК из образца ткань человека получают подходящим способом, соответствующим этическим стандартам в отношении экспериментирования. Полученную ткань растворяют непосредственно в растворителе для экстракции РНК (содержащем ингибитор рибонуклеаз, такой как фенол). Альтернативно клетки полученной ткани собирают выскабливанием при помощи скребка так, чтобы не разрушить клетки, или мягким экстрагированием из ткани с использованием протеолитического фермента, такого как трипсин, и затем немедленно подвергают полученные клетки стадии экстрагирования РНК.

Примеры способов экстрагирования РНК, которые могут быть использованы, включают в себя: способы с использованием гуанидинтиоцианата/ультрацентрифугирования в хлориде цезия, способы с использованием гуанидинтиоцианата/горячего этанола, способы с использованием гуанидингидрохлорида и способы с использованием кислого гуанидинтиоцианата/фенола/хлороформа (Chomczynski, P. and Sacci, N., Anal. Biochem. (1987), 162, 156-159). Из них особенно предпочтительными являются способы с использованием кислого гуанидинтиоцианата/фенола/хлороформа. Альтернативно коммерчески доступный реагент для экстрагирования РНК, такой как реагент ISOGEN (производимый Nippon Gene Co., Ltd.) или TRIZOL (производимый Gibco BRL), может быть использован в соответствии с протоколом, поставляемым вместе с реагентом.

Из полученной фракции общей РНК, если необходимо, предпочтительно очищать и использовать только мРНК. Может быть использован любой подходящий способ очистки. Например, мРНК может быть очищена адсорбцией мРНК на биотинилированный олиго(dT)-зонд, присоединением мРНК к парамагнитным частицам, имеющим иммобилизованный на них стрептавидин, промыванием этих частиц и элюированием мРНК. Альтернативно мРНК может быть очищена адсорбцией мРНК на олиго(dT)-целлюлозной колонке и элюированием из нее мРНК. Однако стадия очистки мРНК не является обязательной в способах настоящего изобретения. При условии определения экспрессия желаемого полинуклеотида может использоваться фракция общей РНК, как это может быть выполнено на более поздних стадиях.

b) Стадия 2): Экстрагирование фракции общей РНК из образца, взятого у здорового индивидуума.

В настоящем изобретении под здоровым индивидуумом понимают индивидуума, который не имеет злокачественного новообразования. Определение, является или нет индивидуум здоровым, может быть осуществлено путем измерения концентрации человеческого белка окулоспанина и определения, находится или нет измеренная величина концентрации в заранее определенном для здорового индивидуума диапазоне. Альтернативно корреляция между уровнем экспрессии человеческого белка окулоспанина и степенью образования рака может быть исследована заранее, и затем можно определить, является или нет исследуемый индивидуум здоровым индивидуумом, путем измерения уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у указанного исследуемого индивидуума. Получение фракции общей РНК у здорового индивидуума может выполняться таким же образом, как описано на стадии 1) выше.

с) Стадия 3): Измерение уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина во фракции общей РНК в соответствии со стадиями 1) и 2).

Уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина представлен уровнем экспрессии полинуклеотида, который может гибридизоваться с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, или полинуклеотида, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1 из списка последовательностей, в жестких условиях.

Уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина может быть определен с помощью иммобилизованного образца, этот и другие способы описаны ниже.

(а) Анализ с использованием иммобилизованных проб

(i) Иммобилизованные пробы

Ниже приведены примеры иммобилизованных проб.

(i) Чипы генов

Может быть использован чип гена, на котором иммобилизован либо антисмысловой олигонуклеотид, который синтезирован на основе EST-последовательности (маркерной экспрессирующей последовательности) из базы данных, либо мРНК-последовательность. Примеры таких чипов генов включают в себя чипы генов, производимые Affymetrix (Lip Shutz, R.J. et al., Nature Genet. (1999), 21, supplement, 20-24), но не ограничиваются ими, и они могут быть получены любым известным способом. При анализе мРНК, полученной из клетки человека, предпочтительно используют чип генов, полученный из последовательностей человека. Например, могут быть использованы набор последовательностей человека U95 или набор U133, производимые Affymetrix. Однако подходящие чипы генов не ограничиваются ими, и может быть использован чип генов, например, из вида животного, родственного человеку.

ii) Матрицы или мембранные фильтры, на которых иммобилизованы кДНК или продукт ОТ-ПЦР, полученные из общей РНК человека или общей РНК, выделенной из специфической ткани человека.

кДНК или продукт ОТ-ПЦР может быть клоном, полученным в результате осуществления реакции обратной транскрипции и ПЦР с использованием праймера, полученного на основе последовательности из базы данных, например из базы данных EST человека. кДНК или продукт ОТ-ПЦР может быть выбран заранее с использованием способа вычитания (Diatchenki, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 6025-6030) или способом дифференциального дисплея (Liang, P., et al., Nucleic Acids Res., (1992) 23, 3685-3690), основанным на общей РНК, где уровень экспрессии различается между индивидуумом, имеющим опухоль, и индивидуумом, не имеющим опухоли. Матрица или фильтр может быть матрицей или фильтром, коммерчески доступным, таким как матрица или фильтры, предоставляемые IntelliGene (производимые Takara Bio). Альтернативно кДНК или продукт ОТ-ПЦР могут быть иммобилизованы с использованием коммерчески доступного устройства для нанесения пятен, такого как матрица GMS417 (производимая Takara Bio), для получения матрицы или фильтра.

(ii) Получение зонда и анализ

Всю экспрессируемую мРНК, а не конкретный клон мРНК, метят и используют в качестве меченого зонда. Неочищенная мРНК может быть использована в качестве исходного материала для получения зонда; однако используют предпочтительно поли(А⁺)-РНК, которая очищена приведенным выше способом. Способ получения меченого зонда и способ обнаружения и анализа указанного зонда с использованием различных типов иммобилизованной пробы описаны дополнительно следующим образом.

i) Чип генов, производимый Affymetrix

Меченный биотином кДНК-зонд получают в соответствии с протоколом (Affimetrix's Expression Analysis Technical Manual), прилагаемым к GeneChip, производимому Affymetrix. Затем выполняют гибридизацию и анализ для обнаружения и анализа света, испускаемого из адипиновой кислоты, с использованием анализатора Affimetrix (GeneChip Fluidics Station 400) в соответствии с протоколом (Expression Analysis Technical Manual), прилагаемым к GeneChip, производимому Affimetrix.

ii) Матрица

Для обнаружения кДНК метка должна быть присоединена к кДНК при ее получении из поли(А⁺)-РНК с использованием реакции обратной транскриптазы. Для получения флуоресцентно меченной кДНК в реакционную смесь может быть включен меченный флуоресцентным красителем d-ИТР, такой как Cy3 или Cy5. Если используемую в качестве контроля поли(А⁺)-РНК, полученную из клетки меланомы, и поли(А⁺)-РНК, полученную из клетки, метят разными красителями, то в смеси одновременно могут быть использованы оба типа поли(А⁺)-РНК. При использовании коммерчески доступной матрицы, например матрицы, поставляемой Takara Bio Co., Ltd., гибридизацию и промывку выполняют в соответствии с прилагаемым протоколом, затем флуоресцентный сигнал определяют с использованием детектора флуоресцентного сигнала (например, сканирующего устройства (сканера) для матрицы GMS418, производимой Takara Bio Co., Ltd.) и после этого анализируют. Выбор матрицы для описанного применения не ограничивается матрицами, которые являются коммерчески доступными. Могут быть использованные «самодельные» матрицы и матрицы, специально полученные в лаборатории.

iii) Мембранный фильтр

При получении кДНК из поли(А⁺)-РНК обратной транскрипцией меченый зонд может быть получен добавлением к реакционной смеси радиоактивного изотопа (например, d-CTP). Гибридизацию проводят общепринятыми способами. Более конкретно, гибридизация может быть осуществлена с использованием системы Atlas (производимой Clontech), которая является микроматрицей, полученной с использованием коммерчески доступного фильтра, после гибридизации микроматрицу промывают. Затем проводят обнаружение и анализ, используя анализатор (например, Atlas Image, производимого Clontech).

В любом из этих способов i)-iii) зонд, полученный из ткани человека, гибридизуют с иммобилизованными пробами той же самой партии. Используемый зонд может быть заряженным, но используемые условия гибридизации сохраняют одинаковыми. При использовании флуоресцентно меченных зондов, если зонды мечены различными флуоресцентными красителями, зонды разных типов могут быть добавлены одновременно в форме смеси и гибридизованы с иммобилизованными пробами. После этого интенсивность флуоресценции можно считывать одновременно (Brown, P.O. et al., Nature Genet., (1999) 21, supplement, p. 33-37).

(b) Другие способы измерений

Кроме вышеуказанных способов измерений, имеются субтракционные способы клонирования (см. Experimental Medicine, Supplementary Volume, New Genetic Engineering Handbook, published by Yodosha Co., Ltd. (1996), p. 32-35); способы дифференциального дисплея (Basic Biochemical Experimental Method 4, nucleic acid.gene experiment, II. Applied series, Tokyo Kagakudojin (2001), p125-128) и способы с использованием репортерного гена: хлорамфениколацетилтрансферазы (например, вектора pCAT3-Basic, производимого Promega), β-галактозидазы (например, вектора pβgal-Basic, производимого Promega), секретируемой щелочной фосфатазы (например, вектора pSEAP2-Basic, производимого Clontech) или зеленого флуоресцентного белка (например, вектора pEGFP-1, производимого Clontech). Однако выбор способа измерения не ограничивается этими способами.

Стадия 4): Анализ различия уровня экспрессии гена между фракциями общей РНК, полученными на стадиях 1) и 2), измеренного на стадии 3), и обнаружение рака у исследуемого индивидуума стадии 1).

Анализируют различие уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина между образцом, взятым у здорового индивидуума, и образцом, взятым у исследуемого индивидуума. Если образец показывает значительно высокий уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина, это говорит о высокой вероятности наличия рака, в частности рака кожи, и, более конкретно, меланомы, то есть рак может быть обнаружен. Термин «значительно высокий уровень экспрессии» относится к случаю, когда анализ выполняют с использованием GeneChip (производимого Affimetrix) и микроматрицы Suite Ver. 3.0 (производимой Affimetrix), средняя величина различия гена, полученного из клетки меланомы, является значительно высокой по сравнению со средней величиной нормального меланоцита.

Альтернативно, измеряют уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина и затем оценивают для определения, находится или нет измеренная величина концентрации в заранее определенном для здорового индивидуума диапазоне. Если эта величина превышает этот диапазон, то у индивидуума имеется рак. Таким образом, может быть диагностирован рак. В другом случае предварительно исследуют взаимосвязь между уровнем экспрессии гена человеческого белка окулоспанина и степенью образования рака у здорового индивидуума и затем измеряют уровень экспрессии гена человеческого белка окулоспанина образца, взятого у исследуемого индивидуума. Этим способом также можно определить, является или нет исследуемый индивидуум здоровым индивидуумом.

(3) Способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии гена человеческого белка окулоспанина (уровня экспрессии белка).

Более конкретно способ обнаружения рака с использованием уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина может быть способом, включающим в себя нижеследующие стадии 1)-3):

1) измерение уровня экспрессии белка человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у индивидуума;

2) измерение уровня экспрессии того же самого белка, что и описанный на стадии 1), в образце, взятом у здорового индивидуума, и

3) анализ различия между уровнем экспрессии белка, измеренным на стадиях 1) и 2), и обнаружения таким образом, что у индивидуума имеется рак.

Эти отдельные стадии описаны более подробно ниже:

а) измерение уровня экспрессии белка человеческого белка окулоспанина в образце, взятом у индивидуума.

(i) Получение пробы из образца для измерения белка.

Образец подвергают высокоскоростному центрифугированию, что необходимо для удаления нерастворимых веществ, и затем получают в виде пробы для ELISA/RIA и Вестерн-блота.

Для получения пробы для ELISA/RIA ткань кожи или лимфатического узла, взятые у индивидуума, используют непосредственно или разводят подходящим образом в буферном растворе перед использованием. Для Вестерн-блоттинга (электрофореза) раствор, экстрагированный из ткани кожи или лимфатического узла, может быть использован непосредственно в качестве пробы или разведен подходящим образом буферным раствором и смешан с буферным раствором для нанесения проб (производимым Sigma), содержащим 2-меркаптоэтанол, для электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле. Для дот- или слот-блоттинга раствор, экстрагированный из ткани кожи или лимфатического узла, может быть использован непосредственно в качестве пробы или разведен подходящим образом в буферном растворе, пробы непосредственно адсорбируют на мембрану с использованием устройства для блоттинга.

(b) Иммобилизация пробы

Белок в пробе, полученной таким образом, может быть специфически определен преципитацией белка с использованием такой процедуры, как иммунопреципитация или связывание лиганда, либо без дополнительной иммобилизации, либо после его прямой иммобилизации. Для иммобилизации белка используемой мембраной может быть такая мембрана, которую используют в Вестерн-блоттинге, дот-блоттинге или слот-блоттинге. Примеры таких мембран включают в себя нитроцеллюлозные мембраны (например, производимые BioRad), нейлоновые мембраны, такие как Hybond-ECL (производимые Amersham Pharmacia), хлопчатобумажные мембраны, такие как блот-абсорбентные фильтры (например, производимые BioRad) и мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (например, производимые BioRad).

Для обнаружения количества белка с использованием метода ELISA или RIA пробу или разведенный раствор пробы (например, разведенный забуференым фосфатом солевым раствором (здесь и далее называемым «ЗФР»), содержащим 0,05% азид натрия) распределяют в 96-луночный планшет, такой как Immunoplate, Maxisorp (производимый Nunc), и инкубируют без перемешивания при температуре в диапазоне от 4°С до комнатной температуры в течение ночи или при 37°С в течение 1-3 часов, давая возможность белку адсорбироваться на поверхности дна лунок для иммобилизации белка.

Антитело против человеческого белка окулоспанина может быть получено обычным способом (см., например, New Biochemical Experimental Course 1, Protein 1, p. 389-397, 1992), который предусматривает иммунизацию животного человеческим белком окулоспанина или полипептидом, произвольно выбранным из аминокислотных последовательностей человеческого белка окулоспанина, с выделением антитела, продуцированного в организме, и его очисткой. Альтернативно моноклональное антитело может быть получено в соответствии со способом, хорошо известным в данной области (например, Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, p. 365-367, 1980, Plenum Press, N.Y.), который предусматривает слияние антитело-продуцирующей клетки, продуцирующей антитело против человеческого белка окулоспанина, с клеткой миеломы для образования гибридомной клетки.

Белок человеческого белка окулоспанина для использования в качестве антигена может быть получен введением гена человеческого белка окулоспанина в клетку-хозяина генной манипуляцией. Для более конкретного объяснения, белок человеческого белка окулоспанина может быть получен получением вектора, способного экспрессировать ген человеческого белка окулоспанина, введением этого вектора в клетку-хозяина, экспрессией гена и очисткой экспрессированного белка человеческого белка окулоспанина.

(с) Измерение уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина.

Уровень экспрессии человеческого белка окулоспанина может быть представлен уровнем экспрессии белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 из списка последовательностей.

Уровень экспрессии может быть измерен методом, известным в данной области, таким как Вестерн-блоттинг или дот/слот-блоттинг, с использованием антитела против человеческого белка окулоспанина.

b) Стадия 2: Измерение уровня экспрессии того же самого белка, как описано на стадии 1, в образце, взятом у здорового индивидуума.

Измерение уровня экспрессии человеческого белка окулоспанина в обра