Смеси олигосахаридов, являющихся производными гепарина, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции

Смеси олигосахаридов, являющихся производными гепарина, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к смесям олигосахаридов, являющихся производными гепарина, имеющим среднюю молекулярную массуот 1800 до 2400 Дальтон, отличающихся высокой активностью анти-Ха (аХа) и отсутствием активности анти-IIa (aIIa), к способу их получения и к содержащим их фармацевтическим композициям.

Гепарин представляет собой смесь сульфатсодержащих мукополисахаридов животного происхождения и используется, в частности, благодаря своим антикоагулирующим и антитромботическим свойствам.

Однако гепарин имеет недостатки, которые ограничивают условия его применения. В частности, его высокая антикоагулирующая активность (aIIa) может явиться причиной кровотечений. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol.5 sup. 3 (1999)).

Низкомолекулярные гепарины, полученные, в частности, щелочной деполимеризацией сложных эфиров гепарина и выпускаемые в настоящее время под наименованием Эноксапарин, также имеют высокую активность aIIa.

В более поздних публикациях уровня техники описаны гепарины с очень низкой молекулярной массой. Например, в патенте США 6384021 описаны продукты, имеющие активность анти-Ха в интервале от 100 до 120 М.ед./мг и активность анти-IIa в интервале от 2 до 8 М.ед./мг. В международных заявках WO02/08295 и WO2004/033503 описаны продукты, имеющие активность анти-Ха, равную, в частности, 100-190 М.ед./мг при активности анти-IIa ниже 5 М.ед./мг. Однако ни один из указанных гепаринов с очень низкой молекулярной массой фактически не обладает активностью анти-Ха выше 190 М.ед./мг и нулевой или практически нулевой активностью анти-IIa. (UI - международная единица)

Под практически нулевой активностью анти-IIa (или иными словами, практически не обладающие активностью анти-IIa) понимают активность ниже 0,2 М.ед./мг.

Изобретение относится к смесям олигосахаридов, имеющим очень высокую селективную активность в отношении активированного фактора Х (фактора Ха) и при этом не обладающим или практически не обладающим активностью анти-IIa.

Таким образом, изобретение относится к смесям олигосахаридов, имеющим общую формулу конститутивных полисахаридов гепарина и обладающим следующими характеристиками:

- они имеют среднюю молекулярную массуот 1800 до 2400 Дальтон, активность анти-Ха, равную 190-450 М.ед./мг и не имеют или практически не имеют активности анти-IIa;

- при этом конститутивные олигосахариды смесей:

- содержат 2-16 сахаридных звеньев,

- имеют звено 2-О-сульфат-4,5-ненасыщенной уроновой кислоты на одном из их концов,

- и содержат гексасахарид следующей формулы:

в форме соли щелочного или щелочноземельного металла.

Гексасахарид ΔIIa-IIs-Is, содержащийся в смеси олигосахаридов, описываемой в настоящем изобретении, является последовательностью, обладающей сильным сродством к ATIII и характеризующейся активностью аХа выше 740 М.ед./мг.

В качестве соли щелочного или щелочно-земельного металла предпочтительны соли натрия, калия, кальция и магния.

Среднюю молекулярную массу определяют методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с использованием двух последовательно установленных колонок, например, колонок, выпускаемых в продажу под наименованиями TSK G3000 XL и TSK G2000 XL. Определение проводят методом рефрактометрии. Используемым элюентом является нитрат лития и элюционный расход составляет 0,6 мл/мин. Систему откалибровывают с помощью стандартов, полученных путем фракционирования Эноксапарина методом хроматографии на агар-полиакриламидном геле (IBF). Этот метод получения осуществляют в соответствии с методикой, описанной Barrowcliffe et al, Thromb.Res., 12, 27-36 (1977-78) или D.A.Lane et al, Tromb.Res., 12, 257-271 (1977-78). Результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения GPC6 (Perkin Elmer). Активность анти-Ха измеряют амидолитическим методом на хромогенном субстрате согласно принципу, описанному Tein et al, Thromb.Res., 10, 399-410 (1977). Количественный анализ был осуществлен методом, описанным в монографии по низкомолекулярным гепаринам действующей фармацевтической фармакопеи, за исключением восстанавливающего буфера: альбумин в буфере Tris-NaCl с pH 7,4 был заменен на полиэтиленгликоль 6000(ПЭГ 6000).

Измерение активности анти-Ха осуществлялось относительно стандартного гепарина очень низкой молекулярной массы (HTBPM) с концентрацией 140-180 U/мг (на сухой вес). Активность стандартного НТВРМ измерялась по отношению к международному стандартному эталону низкомолекулярного гепарина.

Этот стандартный НТВРМ был получен в соответствии со сведениями, имеющимися в международных заявках на патент WO02/08295, в частности, в заявке WO2004/033503. Активность стандартного НТВРМ измерялась по отношению к международному стандартному эталону низкомолекулярного гепарина.

Активность анти-IIa измерялась амидолитическим методом на хромогенном субстрате согласно методу, описанному в монографии по низкомолекулярным гепаринам действующей фармацевтической фармакопеи. Измерение активностей aIIa осуществлялось по отношению к стандартному гепарину очень низкой молекулярной массы (HTBPM) с измеренной активностью 2,1 М.ед/мг. Активность стандартного НТВРМ измерялась по отношению к международному стандартному эталону низкомолекулярного гепарина.

Согласно предпочтительному варианту смесь олигосахаридов согласно изобретению содержит 20-100% гексасахаридной фракции. В частности, эта смесь содержит 30-60% гексасахаридной фракции.

Кроме того, смеси согласно изобретению содержат 20-70% гексасахарида ΔIIa-IIs-Is в гексасахаридной фракции смеси олигосахаридов. В частности, эта фракция ΔIIa-IIs-Is в гексасахаридной фракции составляет 25-50%.

Процентное содержание гексасахаридной фракции может быть определено методом анализа с помощью жидкостной хроматографии при высоком давлении на колонках TSK G3000 XL и TSK G2000 XL или методом препаративного разделения гексасахаридной фракции.

В этом случае хроматографию проводят на колонках, заполненных гелем агар-полиамидного типа. Смесь элюируют раствором бикарбоната натрия. Предпочтительно, раствор бикарбоната натрия представляет собой раствор с концентрацией от 0,1 мол/л до 1 мол/л. Более предпочтительно, разделение осуществляют с концентрацией 1 мол/л. Измерение осуществляют путем спектрометрии в УФ-области (254 нм). После фракционирования гексасахаридную фракцию, растворенную в бикарбонате натрия, нейтрализуют ледяной уксусной кислотой. Раствор затем концентрируют под пониженным давлением так, чтобы концентрацию ацетата натрия была выше 30 мас.%. Гексасахаридную фракцию осаждают добавлением 3-5 объемов метанола. Гексасахаридную фракцию отделяют путем фильтрации через фриттированное стекло n^o3. Полученную смесь гексасахаридов анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и определяют содержание гексасахарида ΔIIa-IIs-Is. Гексасахарид ΔIIa-IIs-Is можно выделить путем препаративной ВЭЖХ или аффинной хроматографией на колонке с антитромбин III-сефарозойсогласно методам, известным специалисту (m.Hook, I.Bjork, J.Hopwood and U.Lindahl, F.E.B.S letters, vol 656(1)(1976)).

Предпочтительно, смеси согласно изобретению имеют среднюю молекулярную массу от 1900 до 2200 Дальтон и, в частности, от 1950 до 2150 Дальтон.

Согласно предпочтительному варианту смесь олигосахаридов согласно изобретению характеризуется тем, что она обладает активностью анти-Ха, равной 190-410 М.ед./мг, и активностью анти-IIa, равной нулю или практически равной нулю. Более конкретно, активность анти-Ха составляет величину от 200 до 300 М.ед.

Таким образом, более конкретно, изобретение относится к смесям, имеющим следующие характеристики:

- средняя молекулярная масса составляет от 1950 до 2150 Дальтон,

- активность анти-Ха равна 190-410 М.ед./мг и активность анти-IIa равна нулю или практически равна нулю;

- они включают 30-60% фракции гексасахаридов, которые содержат 25-55% фракции ΔIIa-IIs-Is.

Активность смесей олигосахаридов согласно изобретению обусловлена особым способом получения, описанным ниже. Специалисту хорошо известно, что физико-химические характеристики полисахаридных смесей, а также активность, вытекающая из этих характеристик, связана со способом их получения (J.Med.Chem. 33(6) 1639-2093 (1990)).

Смеси олигосахаридов согласно изобретению получают деполимеризацией четвертичной соли аммония сложногобензилового эфира гепарина очень низкой молекулярной массы (НТВРМ) в органической среде, причем этот гепарин (НТВРМ) получен в свою очередь согласно сведениям, раскрытым в заявках на патент WO02/08295 и WO2004/033503. В целом, речь идет о повторной деполимеризации гепарина очень низкой молекулярной массы, который сам был получен специфическим образом путем деполимеризации этерифицированного гепарина в присутствии сильного основания, предпочтительно, в дихлорметане, и при содержании воды менее 3%.

НТРВМ, используемые в данном изобретении как сырьевой продукт, были получены, в частности, согласно способам, раскрытым в заявках на патент WO02/08295 и WO2004/033503.

НТРВМ, используемые в данном изобретении в качестве исходного продукта, обладают, в частности, активностью аХа выше 140 М.ед./мг, активностью aIIa ниже 5 М.ед./мг и имеют средние молекулярные массы от 2000 до 3000 Дальтон. Измерение активностей аХа осуществлялось относительно стандартного НТВРМ с измеренной активностью 158 М.ед./мг. Активность стандартного НТВРМ измерялась относительно международного стандартного эталона низкомолекулярного гепарина.

Исходные НТВРМ, полученные согласно способу, который описан выше, повторно деполимеризуют посредством сильного органического основания с pka, предпочтительно, выше 20 (со свойствами, предпочтительно, близкими свойствам семейства фосфазенов, описанных, например, R.Schwesinger et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987) или R.Schwesinger et al, Angew. Chem. 105, 1420 (1993)). Затем превращают четвертичную аммониевую соль сложного бензилового эфира деполимеризованного НТВРМ в соль натрия, омыляют остаточные сложноэфирные функции и, возможно, очищают полученный продукт. Следующая схема реакций иллюстрирует настоящее изобретение:

Изобретение касается таким образом способа получения смесей олигосахаридов, таких, которые описаны выше, отличающегося тем, что гепарин очень низкой молекулярной массы, имеющий активность аХа выше 140 М.ед./мг, активность aIIa ниже 5 М.ед./мг и среднюю молекулярную массу 2000-3000 Дальтон, подвергают следующим химическим реакциям:

а) превращению одной соли в другую при действии хлорида бензетония для получения гепарината бензетония,

b) этерификации полученного гепарината бензетония под действием бензилхлорида и обработке спиртовым раствором ацетата натрия для получения соли натрия сложного бензилового эфира гепарина очень низкой молекулярной массы,

с) превращению соли полученного сложного бензилового эфира и получению соли четвертичного аммония, предпочтительно, соли бензетония, соли цетилпиридиния или соли цетилтриметиламмония,

d) деполимеризации посредством сильного органического основания с pka, предпочтительно, выше 20 для получения деполимеризованного гепарина очень низкой молекулярной массы,

е) превращению соли четвертичного аммония деполимеризованного гепарина очень низкой молекулярной массы в соль натрия

f) омылению остаточных сложноэфирных функций и, возможно, очистке.

В настоящем изобретении используют, в более конкретном случае, высокоселективное фосфазеновое основание на стадии деполимеризации (стадия d), которое обогащает, неожиданным образом, смесь олигосахаридов последовательностями, имеющими сродство к ATIII. Предпочтительно, мольное соотношение сильное основание/сложный эфир составляет 0,2-5, более конкретно, 0,6-2.

Для достижения оптимальной селективности и максимального сохранения последовательностей, имеющих сродство к ATIII, предпочтительно работают при содержании воды ниже 0,3%, если используют 1 мольный эквивалент фосфазенового основания по отношению к соли бензетония сложного бензилового эфира НТВТМ.

Основания, относящиеся к семейству фосфазенов, предпочтительно, представляют собой основания формулы:

в которой радикалы R₁-R₇, одинаковые или различные, означают алкильные линейные, разветвленные или циклические радикалы, содержащие 1-6 атомов углерода, при этом R₃ и R₄ могут, при желании, образовывать с группой -N-P-N-, с которой они связаны, 6-ти членный гетероцикл. В частности, изобретение относится к способу, описанному выше, отличающемуся тем, что основание, используемое на стадии деполимеризации d) представляет собой 2-трет.бутилимино-2-диэтиламино-1,3-диметилпергидро-1,3,2-диаза-фосфорин (по официальной номенклатуре: 1,3,2-диазафосфорин-2-амин-2-[(1,1-диметилэтил)имино]-N,N-диэтил-1,2,2,2,3,5,6-октагидро-1,3-диметил).

Реакцию на стадии а) превращения одной соли в другую,предпочтительно осуществляют путем воздействия избытка хлорида бензетония на соль натрия НТВРМ при температуре около 15-25°С. Преимущественно, молярное соотношение соль/гепарин, соль натрия, составляет от 2,5 до 3,5.

Этерификацию на стадии b) осуществляют, предпочтительно, в среде хлорсодержащего органического растворителя (такого как хлороформ или дихлорметан) при температуре от 25 до 45°С, предпочтительно, от 30 до 40°С. Сложный эфир в форме соли натрия затем выделяют осаждением при помощи 10% (по массе) раствора ацетата натрия в спирте, таком как метанол. Обычно используют 1-1,2 объема спирта на объем реакционной среды. Количество бензилхлорида и продолжительность реакции выбирают такими, чтобы достичь степени этерификации 40-100%, предпочтительно, 70-90%. Предпочтительно, используют 0,5-1,5 масс. частей бензилхлорида на 1 масс. часть соли бензетония гепарина. Исходя из того же, продолжительность реакции предпочтительно, составляет 10-35 часов.

Следовательно, в способе согласно изобретению достигают степени этерификации соли четвертичного аммония сложного бензилового эфира гепарина, равной 40-100%, предпочтительно, 70-90%.

Превращение соли четвертичного аммония сложного бензилового эфира деполимеризованного гепарина в натриевую соль осуществляют, как правило, обработкой реакционной среды спиртовым раствором ацетата натрия, предпочтительно, 10%-ным раствором ацетата натрия в метаноле (масса/объем) при температуре от 15 до 25°С.

Массовый эквивалентвводимого ацетата предпочтительно составляет трехкратное количество массы соли четвертичного аммония сложного бензилового эфира гепарина, вводимой в дальнейшем в реакцию деполимеризации. Солью четвертичного аммония полученного сложного бензилового эфира НТВРМ является, предпочтительно, соль бензетония, соль цетилпиридиния или цетилметиламмония.

Превращение одной соли в другую на стадии с) осуществляют при помощи хлорида четвертичного аммония, предпочтительно, хлорида бензетония, хлорида цетилпиридиния или хлорида цетилтриметиламмония, в водной среде при температуре от 10 до 25°С. Преимущественно, мольное соотношение хлорид четвертичного аммония/соль натрия сложного бензилового эфира гепарина составляет от 2,5 до 3,5.

Омыление осуществляют, как правило, с помощью гидроксида щелочного металла, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, в водной среде при температуре от 0 до 20°С, предпочтительно, от 0 до 10°С. Обычно используют 1-5 мольных эквивалента гидроксида щелочного металла. Предпочтительно, омыление осуществляют в присутствии 1-2 мольных эквивалента гидроксида щелочного металла.

Конечный продукт может быть, при необходимости, очищен любым известным методом очистки деполимеризованных гепаринов (например, ЕР 0037319В1). Предпочтительно, очищают посредством перекиси водорода в водной среде при температуре 10-50°С. Предпочтительно, эту операцию осуществляют при температуре 20-40°С.

Согласно изобретению смеси в форме соли натрия могут быть превращены в смеси другой соли щелочного металла или щелочно-земельного металла. Переход от одной соли к другой возможен при использовании метода, описанного в патенте Франции 7313580.

Настоящее изобретение позволяет, в частности, значительно увеличить содержание гексасахарида ΔIIa-IIs-Is. Если повторно деполимеризуют низкомолекулярный гепарин способом, которым онполучен, то хорошо известно специалисту, что активность анти Ха полученного продукта значительно снижается и доходит до нуля. В случае, когда используют способы, позволяющие получить Эноксапарин, Фраксипарин, Фрагмин, Иннохеп (или Логипарин), Нормифло, Эмболекс (или Сандопарин), Флюксум (или Минидальтон), Кливарин и Хибор, то можно наблюдать это явление, если повторно деполимеризуют эти НВРМ способом их получения. Следствием этого является низкая селективность этих способов в отношении сохранения областей ATIII.

В настоящем изобретении, если используют в качестве исходного продукта НТВРМ, полученный способом фосфазеновой деполимеризации, то наблюдается как раз обратное явление. Активность аХа смеси олигосахаридов увеличивается и даже превышает активность гепарина, который был исходным при получении НТВРМ. Такое явление возможно является следствием значительной селективности фосфазеновых оснований в отношении сохранения последовательностей, имеющих сродство к ATIII.

Эта особенность способа наблюдается также при анализе средних молекулярных масс смесей полученных олигосахаридов. Например, если деполимеризуют НТВРМ со средней молекулярной массой 2400 Дальтон, то получают смесь олигосахаридов со средней молекулярной массой 2000 Да. Вывод делается такой, что последовательности, имеющие сродство к ATIII (гексасахариды и октасахариды), не подвергаются воздействию фосфазенового основания, но которое приводит к деструкции и элиминированию других последовательностей, и, следовательно, к средней молекулярной массе, которой приближается к средней молекулярной массе не подвергаемого деполимеризации компонента, т.е. гексасахарида ΔIIa-IIs-Is (1834 г/мол). Следует подчеркнуть, что на стадии деполимеризации гепарина фосфазеновым основанием средняя молекулярная масса изменяется от 15000Да до 2400 Да.

Альтернативой способу согласно изобретению, позволяющему увеличить активность и селективность в отношении фактора Ха, является способ, использующий низкомолекулярные гепарины в целом. Например, ими могут быть, в частности, Эноксапарин, Фраксипарин, Фрагмин, Иннохеп (или Логипарин), Нормифло, Эмболекс (или Сандопарин), Флюксум (или Минидальтон), Кливарин и Хибор. Речь может также идти о некоторых гепаринах с очень низкой молекулярной массой, таких, которые описаны в документах US 6384021 (2000-4000 Да) или WO 02/08295 (1500-3000 Да), обладающих активностью анти-Ха ниже 140 М.ед./мг (в частности, от 100 до 140 М.ед./мг).

Указанная особенность способа выражена в достижении величин активностей анти-Ха, неожиданных при средней молекулярной массе смесей олигосахаридов (190 М.ед./мг < аХа < 450 М.ед./мг; 1800 Да <РМ <2400 Да).

Согласно конкретному варианту изобретения селективность в отношении фактора Ха смесей олигосахаридов может быть еще более увеличена путем удаления дисахаридных и тетрасахаридных фракций (фракций, не связанных специфически с ATIII). Смесь в этом случае хроматографируют на колонках, заполненных гелем агар-полиакриламидного типа или полиакриламидным гелем. Смесь элюируют раствором бикарбоната натрия. Предпочтительно, раствор бикарбоната натрия представляет собой раствор с концентрацией 0,1-1 мол/л. Еще более предпочтительно, разделение осуществляют с концентрацией 1 мол/л. Измерение проводят путем спектрометрии в УФ части спектра (254 нм). После удаления дисахаридных и тетрасахаридных фракций смесь олигосахаридов, растворенную в бикарбонате натрия, нейтрализуют ледяной уксусной кислотой. Раствор затем концентрируют под пониженным давлением так, чтобы концентрация ацетата натрия была выше 20% масс. Смесь олигосахаридов осаждают добавлением 3-5 объемов метанола. Смесь олигосахаридов с высоким сродством выделяют фильтрацией. Если необходимо, смесь можно очистить путем удаления солей на соответствующей колонке. Пример 6 иллюстрирует этот альтернативный метод и позволяет получить гепарины очень низкой молекулярной массы, у которых активность анти-Ха превышает 400 М.ед./мг.

Таким образом, изобретение относится также к описанному выше способу получения смесей олигосахаридов, обладающих повышенной селективностью в отношениио фактора Ха смесей олигосахаридов, отличающемуся тем, что дополнительно осуществляют удаление дисахаридных и тетрасахардных фракций путем хроматографии, в частности, на колонках, заполненных гелем агар-полиакриламидного типа.

Смеси согласно изобретению могут быть использованы в качестве лекарственных средств.

Смеси олигосахаридов согласно изобретению могут быть использованы в качестве антиромботических агентов. В частности, они пригодны для лечения или профилактики венозных или артериальных тромбозов, глубокого венозного тромбоза, эмболии легких, нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, окклюзивных заболеваний периферических артерий и мерцательной аритмии. Они также пригодны для профилактики и лечения пролиферации клеток гладкой мускулатуры, атеросклероза и артериосклероза, для лечения и профилактики рака путем модулирования ангиогенеза и факторов роста и для лечения и профилактики нарушений диабетического происхождения, таких как диабетические ретинопатии и нефропатии.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного начала смесь формулы (I), возможно, в сочетании с одним или несколькими инертными эксципиентами.

Фармацевтические композиции представляют собой, например, растворы для инъекций, вводимые подкожным путем или внутривенно. Другие фармацевтические композиции согласно изобретению находятся в форме для введения через легкие (ингаляция) или для приема внутрь через рот.

Дозировка может меняться в зависимости от возраста, веса и состояния здоровья пациента. Для взрослых доза обычно составляет 20-100 мг в день при внутримышечном или подкожном введении.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение:

Приготовление 1: Получение исходного гепарина очень низкой молекулярной массы с активностью аХа, равной 158,8 М.ед./мг.

Гепарин очень низкой молекулярной массы (НТВРМ), используемый в качестве исходного продукта в примере 1, получают согласно заявке на патент WO 2004/033503 исходя из гепарина натрия, осуществляя стадии от а) до f), описанные выше, причем стадию деполимеризации осуществляют в присутствии 2-трет.бутилимино-2-диэтиламино-1,3-диметилпергидро-1,3,2-диаза-фосфорина и при процентном содержании воды ниже 0,6%.

Характеристики полученного гепарина очень низкой молекулярной массы:

Характеристики полученного деполимеризованного гепарина следующие:

Средняя молекулярная масса: 2400 Дальтон

Активность анти-Ха: 158,8 М.ед/мг

Активность анти-IIa: 3,1 М.ед/мг

Соотношение активность анти-Ха/активность анти-IIa: 51

Приготовление 2: Получение исходного гепарина очень низкой молекулярной массы, имеющего активность аХа, равную 158 М.ед./мг

Гепарин очень низкой молекулярной массы (НТВРМ), используемый в качестве исходного продукта в примерах 2, 3, 4, 5, получают согласно заявке на патент WO 2004/033503 исходя из гепарина натрия, осуществляя стадии от а) до f), которые описаны выше, причем стадию деполимеризации осуществляют в присутствии 2-трет.бутилимино-2-диэтиламино-1,3-диметилпергидро-1,3,2-диаза-фосфорина и при процентном содержании воды ниже 0,6%.

Характеристики полученного гепарина очень низкой молекулярной массы

Характеристики полученного деполимеризованного гепарина следующие:

Средняя молекулярная масса: 2450 Дальтон

Активность анти-Ха: 158 М.ед./мг

Активность анти-IIa: 2,1 М.ед./мг

Соотношение активность анти-Ха/активность анти-IIa: 75

Приготовление 3: НТВРМ, соль бензетония

Превращение одной соли НТВРМ в соль бензетония(соответствующее стадии а) способа):

В колбу Эрленмейера А объемом 500 мл загружают 12,53 г (20,7 ммол) соли натрия НТВРМ, полученной согласно приготовлению 1, и растворяют в 85 мл воды (желтый раствор).

В колбу Эрленмейера В объемом 100 мл загружают 31,62 г (70,5 ммол) хлорида бензетония вместе с 250 мл воды (раствор бесцветный).

Содержимое колбы В выливают в колбу А и смесь перемешивают около 1 часа при комнатной температуре. Оставляют отстаиваться около 1 часа. Надосадочную часть удаляют и заменяют таким же объемом воды (250 мл). Перемешивают около 15 минут и оставляют отстаиваться приблизительно 30 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют таким же объемом воды (250 мл). Смесь перемешивают около 15 минут и оставляют отстаиваться приблизительно 30 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом воды (250 мл). Смесь перемешивают около 15 минут, затем фильтруют. Осадок на фильтре промывают 3 раза при помощи 200 мл воды. Твердое влажное вещество бежевого цвета центрифугируют, затем сушат при 80°С около 18 часов в сушильном щкафу под пониженным давлением (6 кПа). Получают 35,56 г соли бензетония НТВРМ. Полученный выход составляет 89%.

Приготовление 4: Превращение соли НТВРМ в соль бензетония (соответствующее стадии а) способа):

В колбу Эрленмейера А объемом 1 л загружают 17,93 г (30,2 ммол) соли натрия НТВРМ, полученной согласно приготовлению 2, и растворяют в 120 мл воды (желтый раствор).

В колбу Эрленмейера В объемом 500 мл загружают 45 г (0,1 мол) хлорида бензетония вместе с 360 мл воды (раствор бесцветный).

Содержимое колбы В выливают в колбу А и смесь перемешивают около 1 часа при комнатной температуре. Оставляют отстаиваться около 1 часа. Надосадочную часть удаляют и заменяют таким же объемом воды (500 мл). Перемешивают около 15 минут и оставляют отстаиваться приблизительно 30 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют таким же объемом воды (500 мл). Смесь перемешивают около 15 минут, затем фильтруют. Осадок на фильтре промывают 3 раза при помощи 200 мл воды. Твердое влажное вещество бежевого цвета центрифугируют, затем сушат при 80°С около 48 часов в сушильном щкафу под пониженным давлением (6 кПа). Получают 49,5 г соли бензетония НТВРМ.

Полученный выход составляет 87%.

Пример 1:

Гепарин очень низкой молекулярной массы (НТВРМ), полученный способом согласно изобретению, включающим стадию этерификации до 77%, и стадию деполимеризации основанием, являющимся производным фосфазена, в безводной среде.

Этерификация НТВРМ (стадия b) способа):

35,39 г (18,3 ммол) соли бензетония НТВРМ, полученной согласно приготовлению 3 (при содержании воды 0,20%), растворяют в 183,3 г сухого дихлорметана и загружают в трехгорлую колбу объемом 500 мл. Добавляют 29,5 мл (25,7 ммол) бензилхлорида при температуре 30°С. После приблизительно 23 часов реакции при 30°С степень этерификации составляет 77%. После охлаждения до комнатной температуры (22±3°С) реакционную смесь выливают в 490 мл 10%-ного раствора ацетата натрия в метаноле. Смесь перемешивают в течение приблизительно 1 часа, затем оставляют отстаиваться приблизительно 1 час. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом метанола (250 мл). Перемешивают приблизительно 30 минут, затем оставляют отстаиваться около 45 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом метанола (250 мл). Оставляют отстаиваться около 16 часов. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом метанола (350 мл). Перемешивают около 5 минут и суспензию фильтруют. Осадок на фильтре промывают 2 раза при помощи 50 мл метанола, центрифугируют и сушат при 40°С под пониженным давлением (6 кПа) в течение около 18 часов. Получают 34,48 г неочищенной соли сложного бензилового эфира НТВРМ со степенью этерификации 77%.

Очистка соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ, (стадия b) способа.

Растворяют 34,48 г неочищенной соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ в 350 мл 10% водного раствора NaCl. Раствор выливают в 1,57 л метанола. Суспензию перемешивают около 40 минут, затем оставляют отстаиваться в течение около 16 часов. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом метанола (1,5 л). Перемешивают около 1 часа, затем оставляют отстаиваться около 1,5 часа. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом метанола (1,2 л). Перемешивают приблизительно 15 минут и затем фильтруют. Осадок на фильтре промывают 3 раза при помощи 50 мл метанола. Твердый влажный продукт белого цвета центрифугируют и сушат при 40°С под пониженным давлением (6 кПа) в течение около 18 часов. Получают 6,07 г соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ.

Выход реакции этерификации составляет 50%.

Превращение соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ в соль бензетония (стадия с) способа):

В колбе Эрленмейера А объемом 250 мл растворяют 6 г (9,14 ммол) натриевой соли сложного бензилового эфира НТВРМ в 40 мл воды.

Одновременно в колбу Эрленмейера В объемом 250 мл загружают 13,93 г (31 ммол) хлорида бензетония и 110 мл воды.

Содержимое колбы В выливают в колбу А. Суспензию перемешивают около 1 часа при комнатной температуре (22±3°С), затем оставляют отстаиваться 1 час. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом воды (140 мл). Перемешивают около 15 минут и отстаивают 1 час. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом воды (140 мл). Перемешивают приблизительно 15 минут и отстаивают около 30 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом воды (140 мл). Перемешивают около 5 минут и затем фильтруют. Осадок на фильтре промывают 3 раза при помощи 50 мл воды, центрифугируют, затем сушат при 80°С при пониженном давлении (6 кПа) в течение приблизительно 18 часов. Получают 17,43 г соли бензетония сложного бензилового эфира НТВРМ.

Выход составляет 100%.

Деполимеризация соли бензетония сложного бензилового эфира НТВРМ в безводной среде: неопределяемое содержание воды < 0,01% (стадия d) способа)

В трехгорлую колбу объемом 250 мл загружают 17,43 г (9,14 ммол) НТВРМ, полученного согласно приготовлению 2, и 122 мл сухого дихлорметана. Добавляют 17,4 г молекулярного сита 4Е. Содержимое перемешивают около 18 часов при комнатной температуре (22±3°С) в атмосфере аргона.

Сито отделяют от смеси переносом раствора в трехгорлую колбу объемом 250 мл. Добавляют 2,64 мл (9,14 ммол) 2-трет.бутилимино-2-диэтиламино-1,3-диметилпергидро-1,3,2-диаза-фосфорина и перемешивают в течение 24 часов при температуре 22±3°С в атмосфере аргона.

Превращение четвертичной соли аммония в соль натрия (стадия е) способа)

В колбе Эрленмейера объемом 2 л получают 730 мл 10%-го раствора ацетата натрия в метаноле. Добавляют в раствор 8,71 г целита Гифло суперсель.Реакционную смесь выливают в метанольный раствор, поддерживаемый при температуре около 4°С. Суспензию перемешивают при этой же температуре в течение приблизительно 15 минут. Отстаивают приблизительно 45 минут при комнатной температуре, затем надосадочную часть удаляют и заменяют ее тем же количеством метанола (450 мл). Перемешивают около 15 минут и отстаивают приблизительно 45 минут. Надосадочную часть снова удаляют и заменяют тем же количеством метанола (420 мл). Перемешивают около 15 минут, затем фильтруют через фриттированное стекло n^o 3. Осадок на фильтре промывают 2 раза при помощи 70 мл метанола, центрифугируют и сушат в течение 18 часов при температуре 50°С и при пониженном давлении (6 кПа). Получают 4,35 г неочищенного деполимеризованного НТВРМ (соль натрия) на целите (8,71 г).

Выход составляет 72,5%.

Омыление неочищенной деполимеризованной соли натрия НТВРМ, (стадия f1) способа):

Растворяют 4,35 г (6,63 ммол) неочищенной деполимеризованной соли натрия НТВРМ на целите в 46 мл воды, затем фильтруют через фриттированное стекло n^o 3. Целит промывают двумя порциями по 30 мл воды. Фильтрат загружают в колбу Эрленмейера объемом 500 мл. Вводят 823 мкл (9,94 ммол) 35%-ного раствора щелочи натрия при температуре около 4°С. Перемешивают около 3 часов при этой же температуре. Среду нейтрализуют добавлением 1н. раствора HCl, затем добавляют 11,5 г NaCl и 80 мл метанола. После приблизительно 15 минут перемешивания добавляют 210 мл метанола. Суспензию перемешивают около 1 часа и отстаивают в течение 30 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же количеством метанола (230 мл). Перемешивают около 15 минут и отстаивают в течение 30 минут. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же количеством метанола (210 мл). Перемешивают приблизительно 15 минут, затем фильтруют. Осадок на фильтре промывают 2 раза при помощи 9 мл метанола, центрифугируют и сушат около 18 часов при температуре 50^оС под пониженным давлением (6 кПа). Получают 2,95 г неочищенного деполимеризованного НТВРМ (соль натрия).

Выход составляет 73,7%.

Очистка неочищенной деполимеризованной соли натрия НТВРМ, (стадия f2) способа):

В трехгорлую колбу объемом 50 мл загружают 1,5 г неочищенной деполимеризованной соли натрия НТВРМ и 16 мл воды. Раствор нагревают при 40°С в течение 10 минут. Значение рН доводят до 9,7 приблизительно путем добавления 0,1 н. раствора щелочи натрия. Раствор фильтруют через мембрану 0,45 мкм, затем добавляют 84 мкл 30%-го водного раствора перекиси водорода. Смесь перемешивают 2 часа при комнатной температуре, поддерживая постоянным значение рН на уровне 9,7±0,1 путем добавления 0,1 н. раствора щелочи натрия. Реакционную смесь нейтрализуют добавлением 0,1н. HCl, затем 2 г NaCl. После перемешивания в течение приблизительно 10 минут раствор фильтруют через мембрану 0,45 мкм. Вливают 14 мл метанола при температуре около 4°С. Раствор перемешивают приблизительно 15 минут при комнатной температуре. Добавляют затем 36 мл метанола и суспензию перемешивают около 1 часа. Перемешивание затем прекращают и оставляют отстаиваться в течение приблизительно 30 минут. Надосадочную часть отделяют и удаляют (40 мл). К выпавшему осадку добавляют 40 мл метанола и перемешивают около 10 минут. Повторно дают отстояться осадку в течение приблизительно 30 минут. Надосадочную часть отделяют и удаляют (45 мл). Добавляют 45 мл метанола и осадок в виде суспензии фильтруют. Полученный на фильтре белый осадок промывают двумя порциями по 3 мл метанола. Твердый влажный продукт центрифугируют, затем сушат под пониженным давлением (6 кПа) при температуре около 50°С. После приблизительно 18 часов сушки получают 1,303 г очищенного деполимеризованного НТВРМ (соль натрия).

Выход составляет 86,8%.

Характеристики полученного деполимеризованного НТВРМ:

Средняя молекулярная масса: 1950 Дальтон

Показатель полидесперсности: 1,1

Активность анти-Ха: 283 М.ед./мг

Активность aIIa: не обнаружена (менее 0,2 U/мг)

Пример 2:

Гепарин очень низкой молекулярной массы (НТВРМ), полученный способом согласно изобретению, включающим стадию этерификации до 49% и стадию деполимеризации основанием, являющимся производным фосфазена, в безводной среде.

Этерификация НТВРМ (стадия b) способа):

13,29 г (7,6 ммол) соли бензетония НТВРМ, полученной согласно приготовлению 4, растворяют в 70,43 г безводного дихлорметана и загружают в трехгорлую колбу объемом 100 мл (содержание воды в реакционной среде составляет 0,073%). Добавляют 12,3 мл (107 ммол) бензилхлорида при температуре 30°С. После приблизительно 7 часов реакции при 30°С степень этерификации составляет 49%. После охлаждения реакционную смесь вливают в 160 мл 12%-ного раствора ацетата натрия в метаноле. Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре, затем отстаивают приблизительно 16 час. Надосадочную часть удаляют и заменяют тем же объемом метанола (100 мл). Перемешивают приблизительно 1 час, затем оставляют отстаиваться около 1 часа. Надосадочную часть снова удаляют и заменяют тем же объемом метанола (100 мл). Перемешивают около 5 минут и суспензию фильтруют. Осадок на фильтре промывают 2 раза по 40 мл метанола, центрифугируют и сушат в сушильном шкафу при 40°С под пониженным давлением (6 кПа) в течение около 18 часов. Получают 3,90 г неочищенной соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ со степенью этерификации 49%.

Очистка соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ (этерифицированного до 49%) (стадия b) способа).

Растворяют 3,90 г неочищенной соли натрия сложного бензилового эфира НТВРМ в 39 мл 10%-го водного раствора NaCl. Раствор вливают в 176 мл метанола. Суспензию перемешивают около 15 минут, затем отстаивают в течение 2 часов. Смесь фильтруют. Осадок на фильтре суспензируют в 175 мл метанола и перемешивают в течен