Модуляция уровня предшественников аромата кофе в сырых (необжаренных) кофейных зернах

Модуляция уровня предшественников аромата кофе в сырых (необжаренных) кофейных зернах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники.

Кофе содержит очень сложную смесь ароматических молекул. До настоящего времени в ходе интенсивных исследований состава напитков из быстрорастворимого и свежемолотого кофе идентифицировано свыше 850 соединений, многие из которых представляют собой активные ароматические молекулы (Flament I. (2002) Coffee Flavor Chemistry, John Wiley and Sons, UK). Однако некоторые из ароматических молекул, обнаруженных в чашке готового кофе, присутствуют в сырье, т.е. в сырых зернах (зеленых бобах) растений видов Coffea arabica или Coffea canephora (robustd). Фактически большинство ароматических соединений кофе генерируется в процессе одной или более многочисленных стадий обработки, начиная со сбора зрелых красных плодов кофейного дерева и кончая готовым продуктом из обжаренных молотых зерен кофе или экстрактами из них, например, растворимым кофе.

Различные стадии производства кофе описаны Smith A.W., in Coffee; Volume 1: Chemistry, pp.1-41, dark R.J. and Macrea R. Eds. Elsevier Applied Science, London and New York, 1985; Clarke R.J., in Coffee: Botany, Biochemistry, and Production of Beans and Beverage, pp.230-250 and pp.375-393; and Clifford M.N. and Willson K.C., Eds. Croom Helm Ltd., London. Если говорить кратко, то процесс начинается со сбора зрелых, выдержанных красных плодов (костянок) кофейного дерева. Затем может удаляться наружный слой, или перикарпий, с применением либо сухого, либо влажного способа. Сухой способ является наиболее простым и включает: 1) классификацию и мойку плодов, 2) сушку плодов после классификации (либо естественной воздушной сушкой, либо механическим способом) и 3) шелушение высушенных плодов с целью удаления сухого перикарпия. Влажный способ является несколько более сложным и обычно приводит к производству высококачественных зеленых бобов. Влажный способ чаще ассоциируется с плодами С. arabica. Влажный способ включает (1) классификацию плодов кофейного дерева, (2) удаление плодовой мякоти (пульпы), эта стадия проводится сразу после сбора плодов и обычно включает механическое удаление "пульпы", или перикарпия, из зрелых плодов, (3) "ферментацию", т.е. удаление слизи, остающейся на зернах плодов после удаления мякоти, путем инкубации их вместе с оставшейся слизью водой в танках в периодическом режиме (процесс "ферментации" может продолжаться в течение до 80 часов, хотя зачастую 24 часов бывает вполне достаточно для достижения приемлемой ферментации и снижения рН примерно с 6,8-6,9 до 4,2-4,6 под действием различной ферментной активности и метаболическим действием микроорганизмов, рост которых происходит в процессе ферментации), (4) сушку (эта стадия включает либо воздушную, либо механическую сушку нагретым воздухом ферментированного кофейного зерна) и (5) "лущение", эта стадия включает механическое удаление "пергаментной оболочки" с высушенного кофейного зерна (с так называемого высушенного кофейного зерна с пергаментной оболочкой); на этой стадии часто удаляется также и серебристая семенная оболочка. Полученное после влажной или сухой обработки сырое кофейное зерно зачастую подвергают сортировке, при этом большинство процессов сортировки основано на сортировке по размерам и/или форме зерна.

Следующая стадия обработки кофе - обжарка сырого кофейного зерна после шелушения или лущения обработанного сухим или влажным способом кофе, соответственно. Этот процесс зависит от времени и индуцирует значительные химические изменения в зерне. В первой фазе обжарки происходит выпаривание оставшейся в зерне воды за счет подачи теплоты. После испарения основной массы воды начинается собственно обжарка, когда температура повышается до 190-200°С. Степень обжарки, которая обычно регулируется по изменению цвета кофейного зерна, играет важную роль в формировании ароматических характеристик готового кофейного напитка. Поэтому время и температура обжарки строго контролируются в целях достижения требуемого ароматического профиля кофе. После обжарки проводят помол кофе с тем, чтобы облегчить экстракцию в процессе производства кофейного напитка или кофейных экстрактов (последние используются для производства быстрорастворимых кофейных продуктов). Вид помола также может влиять на конечный аромат напитка.

В то время как по проблеме идентификации ароматических молекул в кофе проводилось значительное число научных исследований, вопросам изучения физических и химических реакций, происходящих внутри кофейных зерен на каждой из стадий их обработки, посвящено намного меньше исследовательских работ. В большей степени это относится к обжарке, в ходе которой большое количество компонентов зерен подвергается чрезвычайно сложной серии индуцируемых нагревом реакций (Homma S. 2001, in "Coffee: Recent Developments", R.J. dark and O.G. Vitzthum, Eds. Blackwell Science, London; Yeretzian C., et al. (2002) Eur. Food Res. Technol. 214, 92-104; Flament I. (2002) Coffee Flavor Chemistry, John Wiley and Sons, UK; Reineccius G.A., "The Maillard Reaction and Coffee Flavor", Conference Proceedings of ASIC, 16^th Colloque, Kyoto, Japan 1995).

Хотя подробности большинства реакций, происходящих на различных стадиях обработки кофе, остаются относительно не изученными, предполагается, что наиболее важной, генерирующей аромат реакцией, ответственной за многие оттенки, связанные с ароматом кофе, является реакция Майяра (Maillard reaction) в ходе обжарки кофе. Интенсивная реакция Майяра происходит между содержащимися в кофейном зерне продуктами распада сахаров/полисахаридов и содержащими аминогруппу молекулами (в частности, белками, пептидами и аминокислотами) в процессе обжарки.

Очевидно, что реакция Майяра вносит важный вклад в формирование кофейного аромата и образование ароматических молекул в процессе обжарки кофе, постольку существует взаимосвязь между уровнем первичных реагентов-участников реакции Майяра в сыром кофейном зерне и качеством аромата, формирующегося после обжарки.

Как отмечалось выше, важной группой субстратов в реакции Майяра являются аминокислоты, пептиды и белки. С использованием двумерного (2-D) электрофореза было показано, что существуют различия в уровнях и количествах основных запасных белков в сыром (необжаренном) кофейном зерне между сортами арабика (arabica) и робуста (robusta), однако взаимосвязи между указанными различиями в содержании запасных белков и качеством аромата установить не удалось (Rogers et al., 1999, Plant Physiol. Biochem. Vol.37, 261-272). В последнее время было обнаружено, что небольшие различия существуют и между запасными белками незрелых и зрелых кофейных зерен, обладающих различным качеством аромата (Montavon Р. et al., 2003, J. Agric. and Food Chemistry Vol.51, 2328-2334). Поскольку в процессе созревания зерен происходит много изменений, в этой последней работе высказывается предположение о возможном существовании связи между улучшением качества, вызываемым созреванием зерен, и различиями в миграции основных запасных белков кофейных зерен в 2-D геле.

В последнее время было установлено, что существуют различия и в профилях пептидов, выделенных из сырых кофейных зерен сортов арабика и робуста (Ludwig et al., 2000, Eur. Food Res. Technol., Vol.211, 111-116). Хотя результаты указанных авторов показали, что пептидные экстракты из арабики и робусты различаются профилем предшественников аромата, данные, представленные в их работе, не идентифицируют, какой компонент (компоненты) в экстрактах является/являются ответственными за указанные различия в профилях предшественников аромата. Эти ученые обнаружили также, по меньшей мере, две различные протеазные активности в неочищенных экстрактах из сырого (необжаренного) кофейного зерна, которые, однако, не коррелировали ни с какой специфической активностью, связанной с качеством аромата (Ludwig et al., 2000, Eur. Food Res. Technol., Vol.211, 111-116). И, наконец, также выдвинуто предположение о том, что очень высокие температуры на поздних стадиях обжарки сырого кофейного зерна вызывают значительный распад белков, присутствующих в кофейном зерне (Homma S. 2001, в "Coffee: Recent Developments". R.J. dark and O.G. Vitzthum, Eds. Blackwell Science, London; Montavon, P., et al., 2003, "Changes in green coffee protein profiles during roasting = Изменения белковых профилей сырого кофейного зерна в процессе его обжарки", J. Agric. Food Chem. 51, 2335-2343). Однако общая схема этого распада белков очень плохо изучена, но предположительно она зависит, помимо прочего, от определенного состояния основных белков кофе в сырье до начала обжарки. Насколько известно авторам настоящей заявки, других значительных публикаций о возможном участии пептидного профиля кофе в формировании аромата кофе не имеется.

В процессе обжарки ферментированных семян Theobroma cacao (какао-бобов), как предполагается, содержащиеся в семенах аминокислоты и пептиды вовлекаются в формирование аромата с помощью реакции Майяра. В сравнении с семенами других растений, семена Т. cacao обладают, как было показано, необычайно высоким уровнем специфичной к аспарагиновой кислоте протеазной активности (Biehl В., Voigt J., Voigt G., Heinrichs H., Senyuk V. and Bytof G. (1994) "pH dependent enzymatic formation of oligopeptides and amino acids, the aroma precursors in raw cocoa beans = рН-зависимое ферментативное образование олигопептидов и аминокислот - предшественников аромата в сырых какао-бобах"; в The Proceedings of the 11^th International Cocoa Research Conference, 18-24 July 1993, Yamoussoukro, Ivory Coast). Для получения какао-бобов с высоким уровнем предшественников аромата какао необходимо проводить стадию естественной ферментации (при обжарке неферментированных какао-бобов формируется очень слабый аромат). Во время этой стадии ферментации сахара плодовой мякоти ферментируются, генерируя высокий уровень кислот, в частности, уксусной кислоты (Carr J.G. (1982) Cocoa. В Fermented Foods. Economic Microbiology. Vol.7, pages 275-292, A.H. Rose ed., Academic Press). По мере продолжения ферментации рН в семенах снижается, и клеточные структуры разрушаются. Низкий рН инициирует мобилизацию и/или активацию специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы, содержащейся в большом количестве в семенах какао, что приводит к массовому распаду клеточного белка (Biehl В., Passem D. and Sagemann W. (1982) "Effect of Acetic Acid on Subcellular Structures of Cocoa Bean Cotyledons = Влияние уксусной кислоты на субклеточные структуры семядолей какао-бобов". J. Sci. Food Agric. 33, 1101-1109; Biehl В., Brunner E., Passem D., Quesnel V.C. and Adomako D. (1985) "Acidification, proteolysis and flavour potential in fermenting cocoa beans = Подкисление, протеолиз и ароматический потенциал в ферментированных какао-бобах". J. Sci. Food Agric. 36, 583-598). Пептиды и аминокислоты, как было показано, являются предшественниками аромата какао (Rohan Т., 1964, "The precursors of chocolate aroma: a comparative study of fermented and unfermented cocoa beans = Предшественники шоколадного аромата: сравнительное исследование ферментированных и неферментированных какао-бобов". J. Food Sci., 29, 456-459; Voigt J. and Biehl В., 1995, "Precursors of the cocoa specific aroma components are derived from the vicilin-class (7S) globulin of the cocoa seeds by proteolytic processing = Предшественники компонентов специфического аромата какао образуются из глобулина класса викилина (7S) какао-бобов путем протеолиза". Bot. Acta, 108, 283-289). Таким образом, специфичная к аспарагиновой кислоте протеаза семян Т. cacao вместе с содержащейся в семенах серин-карбоксипептидазой являются, как предполагается, критическими для образования предшественников аромата какао в процессе ферментации (Voigt J. and Biehl В., 1995, "Precursors of the cocoa specific aroma components are derived from the vicilin-class (7S) globulin of the cocoa seeds by proteolytic processing". Bot. Acta 108, 283-289; Voigt J., Heinrichs H., Voigt G. and Biehl В., 1994, "Cocoa-specific aroma precursors are generated by proteolytic digestion of the vicilin-like globulin of cocoa seeds = Предшественники специфического аромата какао образуются в результате протеолиза глобулина класса викилина (7S) какао-бобов". Food Chemistry, 50, 177-184). Идентифицирован ген, кодирующий специфичную к аспарагиновой кислоте протеазу, содержащуюся в большом количестве в семенах какао, а совсем недавно в опубликованной заявке на Международный патент №02/04617, включенной в полном объеме в перечень ссылок к настоящей заявке, описан метод сверхэкспрессии указанного белка в семенах какао, который может генерировать повышенный уровень аминокислот и пептидов -предшественников аромата какао в ферментированных какао-бобах. Однако содержание опубликованной заявки на Международный патент №02/04617 направлено на семена какао, которые подвергаются специфической длительной стадии кислотной ферментации, в отличие от кофейных зерен, которые не подвергаются такой ферментации.

Важной цистеинпротеазой (СР, cysteine proteinase) вакуолей является KDEL-содержащая цистеинпротеаза. Этот тип протеазы был охарактеризован в нескольких растениях. В последнее время были обнаружены три гена, кодирующие цистеинпротеазы с С-концевыми KDEL последовательностями в arabidopsis (Gietl С. and Schmid M., 2001, Naturwissenschaften, 88, 49-58). Один экспрессируется в стареющих семяпочках, второй - в сосудах, а третий - в зрелых стручках. Однако более подробные исследования этого белка были проведены в других растениях. Например, СР, называемая сульфгидрильной эндопротеазой (SH-EP), была охарактеризована в семядолях семян Vigna mungo (Toyooka К., Okamoto Т. and Minamikawa Т., 2000, J. Cell Biol. 148, 453-463). SH-EP экспрессируется de novo в прорастающих семядолях V. mungo', предполагается, что она вовлекается в распад запасных белков, аккумулированных в запасающих белки вакуолях (Okamoto Т. and Minamikawa Т. J. Plant Physiol. 152, 675-682). Ключевым отличием SH-EP полипептида является то, что он обладает специфической СООН-концевой последовательностью KDEL, которая управляет транспортом этого белка из эндоплазматического ретикулума (ER) в запасающие белки вакуоли (Toyooka et al., 2000). В последнее время выдвинуто также предположение о том, что SH-EP белок действительно вовлекается, благодаря наличию в нем KDEL последовательности, в образование специфических везикул, называемых KV (KDEL Vesicles), в ранее не описанной в литературе везикулярной транспортной системе (Okamoto Т., Shimada Т., Hara-Nishimura I., Nishimura M. and Minamikawa Т., 2003, Plant Physiology, 132, 1892-1900).

Аналогичное предположение было сделано и в отношении KDEL-содержащего СР белка, обнаруженного в прорастающих семядолях касторового боба (Ricinus communis). В этом растении, как подразумевают авторы, указанная KDEL-содержащая протеаза в рамках запрограммированной гибели клеток (алоптоза) эндосперма продолжает поставлять питательные вещества для прорастающего зародыша касторового боба (Gietl С. and Schmid M., 2001, Naturwissenschaften, 88, 49-58). Указанные авторы предполагают, что в касторовом бобе KDEL протеаза образуется в ER прорастающих семян до наступления 3-их суток. Когда семенная оболочка сбрасывается, примерно на 3 сутки, KDEL-содержащий СР оказывается упакованным в специфическую везикулу, называемую рициносомой. Позднее, когда эндосперм становится мягким (между 4 и 5 сутками), от KDEL-CP отщепляется прикрепившаяся последовательность (KDEL), и эта протеаза мигрирует в цитоплазму, где она участвует в основном распаде клеточного белка.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является модификация пула белковых/пептидных/аминокислотных предшественников аромата в кофе.

Если говорить более конкретно, то целью настоящего изобретения является модификация уровня предшественников аромата в сырье (сыром кофейном зерне) таким образом, чтобы в процессе последующей послеуборочной обработки и обжарки мог достигаться измененный аромат. Не останавливаясь на теории, авторы заявки выдвинули предположение, что, если между сортами кофе с совершенно разным ароматом существуют различия в уровне пептидов и распада белка, то эти различия скорей всего обусловлены разной эндогенной протеазной активностью в указанных сортах кофейного зерна. Эти различия могут быть обнаружены по различию в уровне экспрессии мРНК при экспрессии определенных генов протеазы кофейного зерна.

Таким образом, настоящее изобретение включает идентификацию последовательностей генов, кодирующих специфичные протеазы кофейного зерна (семян), и доказательство того, что различия в экспрессии этих генов в арабике и робусте существуют на самом деле.

Если говорить более конкретно, то настоящее изобретение раскрывает две основные цистеинпротеазы кофе (СсСР-1 и СсСР-4), четыре ингибитора основных цистеинпротеаз кофе (CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3 и CcCPI-4) и две специфичные к аспарагиновой кислоте протеазы кофе (СсАР-1 и СсАР-2), все из которых экспрессируются в кофейном зерне. Авторы заявки показывают, как сверхэкспрессия этих белков, особенно на поздней стадии развития зерна, или пониженная экспрессия указанных белков, особенно на поздней стадии развития зерна, может изменить аминокислотный/пептидный/белковый профиль зрелого зерна. Используя одну или более раскрытых последовательностей и генных конструкций для изменения аминокислотного/пептидного/белкового профиля зрелых кофейных зерен, авторы заявки открыли новый способ изменения профиля предшественников аромата в зрелом кофейном зерне.

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий цистеинпротеазной активностью, в котором аминокислотная последовательность полипептида и аминокислотная последовательность, выбираемая из SEQ ID No 2 или 16, идентичны, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, при этом идентичность последовательностей основывается на методе выравнивания ClustalW; или комплемент нуклеотидной последовательности, в которой комплемент содержит такое же число нуклеотидов, что и нуклеотидная последовательность, и комплемент и нуклеотидная последовательности являются на 100% комплементарными. Предпочтительно аминокислотная последовательность полипептида и аминокислотная последовательность SEQ ID No 2 или 16 идентичны, по меньшей мере, на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и необязательно, по меньшей мере, на 95%, при этом идентичность последовательностей основывается на методе выравнивания ClustalW. Предпочтительно нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID No 1 или 15. Предпочтительно полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 2 или 16.

Во втором аспекте обеспечивается изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью ингибитора цистеинпротеазы, в котором аминокислотная последовательность полипептида и аминокислотная последовательность, выбираемая из SEQ ID No 4, 10, 12 и 14, идентичны, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, при этом идентичность последовательностей основывается с помощью метода выравнивания ClustalW; или комплемент нуклеотидной последовательности, в котором комплемент содержит такое же число нуклеотидов, что и нуклеотидная последовательность, и комплемент и нуклеотидная последовательность являются на 100% комплементарными. Предпочтительно аминокислотная последовательность полипептида и аминокислотная последовательность SEQ ID No 4, 10, 12 и 14 идентичны, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и необязательно, по меньшей мере, на 95%, при этом идентичность последовательностей основывается на методе выравнивания ClustalW. Предпочтительно нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, выбираемую из SEQ ID No 3, 9, 11 или 13, необязательно из SEQ ID No 9, 11 или 13, также необязательно из SEQ ID No 9 или 13, либо, что тоже необязательно, из SEQ ID No 9. Предпочтительно полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID No 4, 10, 12 и 14, необязательно из SEQ ID No 10, 12 и 14, также необязательно из SEQ ID No 10 или 14, либо, что тоже необязательно, из SEQ ID No 10.

В третьем аспекте обеспечивается изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий специфичной к аспарагиновой кислоте эндопротеазной активностью, в котором аминокислотная последовательность полипептида и аминокислотная последовательность, выбираемая из SEQ ID No 6 или 8, предпочтительно из SEQ ID No 8, идентичны, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, при этом идентичность последовательностей основывается на методе выравнивания ClustalW; или комплемент нуклеотидной последовательности, в котором комплемент содержит такое же число нуклеотидов, что и нуклеотидная последовательность, и комплемент и нуклеотидная последовательность являются на 100% комплементарными. Предпочтительно аминокислотная последовательность полипептида и аминокислотная последовательность, выбираемая из SEQ ID No 6 или 8, предпочтительно из SEQ ID No 8, идентичны, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и, необязательно, по меньшей мере, на 95%, при этом идентичность последовательностей основывается на методе выравнивания ClustalW. Предпочтительно нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5 или 7, предпочтительно SEQ ID No 7. Предпочтительно полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No 6 или 8, предпочтительно SEQ ID No 8.

В следующем аспекте обеспечивается вектор, содержащий полинуклеотид согласно любому из предшествующих (с первого по третий) аспектов изобретения.

В следующем аспекте обеспечивается конструкция чужеродной рекомбинантной ДНК, содержащая полинуклеотид согласно любому из предшествующих (с первого по третий) аспектов изобретения, оперативно связанный с регуляторной последовательностью. Важно, чтобы в чужеродной конструкции либо полинуклеотид был чужеродным, либо регуляторная последовательность была чужеродной, либо оба они были чужеродными.

В следующем аспекте обеспечивается метод трансформации клетки, предусматривающий трансформацию клетки полинуклеотидом согласно любому из предшествующих (с первого по третий) аспектов настоящего изобретения.

В следующем аспекте обеспечивается клетка, содержащая вышеупомянутую конструкцию чужеродной рекомбинантной ДНК, в которой клетка предпочтительно является прокариотической клеткой, эукариотической клеткой или растительной клеткой, предпочтительно клеткой кофейного дерева.

В следующем аспекте обеспечивается трансгенное растение, содержащее такую трансформированную клетку.

В контексте настоящего описания термин "плод кофейного дерева" (coffee cherry) обозначает костянку (плод) кофейного дерева; целый плод; экзокарпий (кожица); перикарпий (мясистый основной наружный слой плода); кофейное зерно. Более подробное разъяснение указанного термина см. Clarke R.J., Coffee: Botany,Biochemistry, and Production of Beans and Beverage, pp.230, Clifford M.N. and Willson K.C. eds, Croom Helm Ltd., London (указанный источник в полном объеме включен в перечень ссылок к настоящей заявке).

Изобретение можно лучше понять из нижеследующего подробного описания и сопровождающего его Перечня последовательностей, который является частью настоящей заявки.

В приведенной ниже таблице 1 перечислены описанные в настоящем изобретении полипептиды вместе с идентификатором соответствующих последовательностей (SEQ ID No).

Таблица 1
SEQ ID No 1 (CcCP1: цистеинпротеаза, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 2 (CcCP1: цистеинпротеаза, аминокислоты)
SEQ ID No 3 (CcCPI-1: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 4 (CcCPI-1: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
SEQ ID No 5 (CcAPl: специфичная к аспарагиновой кислоте эндопротеаза 1, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 6 (CcAP1: специфичная к аспарагиновой кислоте эндопротеаза 1, аминокислоты)
SEQ ID No 7 (СсАР2: специфичная к аспарагиновой кислоте протеаза 2, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 8 (СсАР2: специфичная к аспарагиновой кислоте протеаза 2, аминокислоты)
SEQ ID No 9 (CcCPI-2: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 10 (CcCPI-2: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
SEQ ID No 11 (CcCPI-3: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 12 (CcCPI-3: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
SEQ ID No 13 (CcCPI-4: ингибитор цистеинпротеазы, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 14 (CcCPI-4: ингибитор цистеинпротеазы, аминокислоты)
SEQ ID No 15 (СсСР-4: цистеинпротеаза, нуклеиновая кислота и соответствующие ей аминокислоты)
SEQ ID No 16 (СсСР-4: цистеинпротеаза, аминокислоты)

В перечне последовательностей однобуквенные коды обозначают нуклеотидные последовательности, а трехбуквенные коды обозначают аминокислоты, как они определяются в стандартах IUPAC-IUBMB и как они описываются в Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985), которая включена в перечень ссылок к настоящей заявке.

Краткое описание чертежей.

Фигура 1 показывает нозерн-блот анализ гена цистеинпротеазы в различных тканях Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R -корневище; S - стебель; L - молодые листочки; SG, LG, Y и Red - зерно из мелких зеленых плодов, крупных зеленых плодов, желтых плодов и красных плодов, соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку геля составила пять микрограммов. MW обозначает маркерную "лесницу" размеров РНК. Панель В представляет собой авторадиограмму через 24 часа экспозиции, показывающую появление СсСР-1 мРНК в исследуемых тканях, а панель А показывает гель, окрашенный бромистым этидием перед блоттингом.

Фигура 2 показывает нозерн-блот анализ экспрессии гена СсСР-1 цистеинпротеазы в различных тканях Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки; SG(g), LG(g), Y(g) и Red(g) соответствуют РНК, выделенной из зерна мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно, а дорожки в геле, обозначенные SG(p), LG(p), Y(p) и Red(p), соответствуют РНК, выделенной из ткани перикарпия мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку геля составила пять микрограммов. Панель А показывает окрашенные бромистым этидием большие субъединицы рибосомальной РНК перед блоттингом, которые являются контролем загрузки, а панель В представляет собой авторадиограмму, показывающую появление СсСР-1 мРНК в специфических исследуемых тканях.

Фигура 2А: Выравнивание полноразмерной последовательности белка, кодируемого СсСР-1 кДНК, по отношению к другим полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Оно выполнялось с использованием программы CLUSTAL из пакета программ MegAlign (DNASTAR). Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL указываются в круглых скобках: Arabidopsis thaliana (AY070063); Vicia sativa (Z99172); Glycine max. GMCP3 (Z32795); Glycine max GmPM33 (AF 167986); Phaseolus vulgaris Moldavain (Z99955); Solanum melongena (AF082181); Nicotiana tabacum (AJ242994); Lycopersicon esculentum (Z14028); Vicia faba (АY161277).

Фигура 3 показывает нозерн-блот анализ гена ингибитора цистеинпротеазы (CcCPI-1) в различных тканях Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; SG, LG, Y и Red - зерно из мелких зеленых плодов, крупных зеленых плодов, желтых плодов и красных плодов, соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку геля составила пять микрограммов. MW обозначает маркерную "лесницу" размеров РНК. Панель В представляет собой авторадиограмму через 24 часа экспозиции, а панель А показывает гель, окрашенный бромистым этидием перед блоттингом.

Фигура 4 показывает нозерн-блот анализ гена ингибитора цистеинпротеазы (CcCPI-1) на различных стадиях развития плодов Coffea arabica (ARA) и Coffea robusta (ROB). Дорожки вгеле обозначены следующим образом: мелкий зеленый плод (SG), крупный зеленый плод (LG), желтый плод (Y) и красный плод (Red), соответственно. Загрузка суммарной РНК в каждую дорожку геля составила пять микрограммов. MW обозначает маркерную "лесницу" размеров РНК. Панель В представляет собой авторадиограмму через 24 часа экспозиции, показывающую появление CcCPI-1 мРНК в специфических исследуемых тканях. Панель А показывает гель, окрашенный бромистым этидием перед блоттингом.

Фигура 5 показывает анализ методом полимеразной цепной реакции с матрицы кДНК, полученной с мРНК с помощью реакции обратной транскрипции (так называемый метод RT-PCR) экспрессии гена СсСР-1 в процессе прорастания зерна Coffea arabica. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием 10 мкл каждой реакционной смеси для получения кДНК, разбавленной в соотношении 1/100. Режимы циклов ПЦР: 2 мин при 94°С и затем 35 циклов: 94°С и 61°С в течение 1,5 мин, 72°С в течение 2,5 мин. Стадия конечной достройки цепей продолжалась 7 мин при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:

A4-43-Верхний: 5'-ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG-3'

А4-43-нижний: 5'-АСССТТСССССАТСАСТТСТТСА-3'.

мРНК амплифицировали методом RT-PCR с использованием специфичных праймеров (СсСР-1 верхний/СсСР-1 нижний) на различных матрицах: кДНК из стерилизованного зерна (Т₀) и зерен, отобранных спустя 2 суток (2d), 3 суток (3d), 5 суток (5d), 1 месяц (1m) и 2 месяца (2m) прорастания, соответственно. ПЦР продукты разделяли в 1% (масса/объем) агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. RPL39: амплифицированный фрагмент кДНК, кодирующий белок L39 большой субъединицы рибосом 60S.

Фигура 6 показывает вестерн-блот анализ экспрессии белка СсСР-1 (А). Общий белок экстрагировали из зерен (g) и перикарпия (р), отобранных из развивающихся плодов кофейного дерева на стадиях мелких зеленых (SG), крупных зеленых (LG), желтых (Y) и красных (Red) плодов. Панель В: Разделение 50 мкг общего белка в 12% SDS-PAGE геле и окрашивание "кумасси голубым". Панель А: Обнаружение белка проводили с использованием анти-CКР4 поликлональных антител (кролика), как описывается в методах. Приблизительный размер окрашенных полос в панели В указан стрелками слева. Большая стрелка внутри каждой панели указывает на присутствие основного запасного белка, который участвует в перекрестной реакции связывания с одним из антител.

Фигура 6А показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-1 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности приводятся в круглых скобках. Malus x domestica (AAО18638; идентичность 42,3%), Common sunflower (JE0308; идентичность 41,5%), Arabidopsis thaliana (AAM64985; идентичность 30%) и Rumex obtusifolius (CAD21441; идентичность 29,3%).

Фигура 7 показывает RT-PCR анализ экспрессии гена CcCPI-1 в различных тканях Coffea arabica CCCA2 (А) и Coffea robusta FRT-32 (В). ПЦР проводили с использованием 10 мкл каждой смеси с полученной кДНК, разбавленной в соотношении 1/1000. Режимы циклов: 2 мин при 94°С и затем 40 циклов: 94°С, 1 мин - 60°С, 1,5 мин - 72°С, 1 мин. Стадия конечной достройки цепей продолжалась 7 мин при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:

CcCPI-1 (верхний): 5'-AGGAAAGTGGGAGCAAGGGAGAAGA-3'

CcCPI-1 (нижний): 5'-TAGTATGAACCCAAGGCCGAACCAC-3'.

Дорожки в геле обозначены следующим образом: М - маркеры; +Р - разбавленная плазмида, содержащая ген CcCPI-1; R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки. SGg, LGg, Yg и Rg - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SGp, LGp, Yp и Rp - ткань перикарпия, изолированная из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно.

Фигура 8 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-2 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности приводятся в круглых скобках. Rumex obtusifolius (CAD21441; идентичность 66,7%), Dianthus caryophyllus (AAK30004; идентичность 71,7%), Manihot esculenta (AAF72202; идентичность 65,2%).

Фигура 9 показывает RT-PCR анализ экспрессии гена CcCPI-2 в различных тканях Coffea arabica CCCA2 (А) и Coffea robusta FRT-32 (В). ПЦР проводили с использованием 10 мкл каждой смеси для получения кДНК, разбавленной в соотношении 1/1000. Режимы циклов: 2 мин при 94°С и 40 циклов: 94°С, 1 мин - 57°С, 1,5 мин. - 72°С, 1 мин. Стадия конечной достройки цепей продолжалась 7 мин при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:

CcCPI-2 (верхний): 5'-GTGAAGCCATGGTTGAACTT-3'

CcCPI-2 (нижний): 5'-GTAATGATACTCAAGCCAGA-3'.

Дорожки в геле обозначены следующим образом: М - маркеры; +Р - разбавленная плазмида, содержащая ген CcCPI-2; R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки. SGg, LGg, Yg и Rg - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SGp, LGp, Yp и Rp - ткань перикарпия, изолированная из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно.

Фигура 10 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-3 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности приводятся в круглых скобках. Citrus x paradisi (AAG38521; идентичность 42,4%), Actinidia deliciosa (AAR92223; идентичность 44,4%) и Arabidopsis thaliana (AAM64661; идентичность 44%).

Фигура 11 показывает оптимальное выравнивание полноразмерного белка, кодируемого CcCPI-4 кДНК, по отношению к другим гомологичным полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа в базу данных EMBL и процент идентичности даются в круглых скобках. Citrus x paradisi (AAG38521; идентичность 23,6%) и Arabidopsis thaliana (AAM64661; идентичность 20%).

Фигура 12 показывает RT-PCR анализ экспрессии гена CcCPI-4 в различных тканях Coffea arabica CCCA2 (А) и Coffea robusta FRT-32 (В). ПЦР проводили с использованием 10 мкл каждой смеси для получения кДНК, разбавленной в соотношении 1/100. Режимы циклов были следующие: 2 мин при 94°С и 40 циклов: 94°С, 1 мин - 60°С, 1,5 мин - 72°С, 1 мин. Стадия конечной достройки цепей продолжалась 7 мин. при 72°С. Используемые ПЦР праймеры:

CcCPI-4 (верхний): 5'-CTACGGTCGCAGCCAAATC-3'

CcCPI-4 (нижний): 5'-ACAACTGCACCTTCAATGTAC-3'.

Дорожки в геле обозначены следующим образом: М - маркеры; +Р - разбавленная плазмида, содержащая ген CcCPI-4; R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветы. SGg, LGg, Yg и Rg - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SGp, LGp, Yp и Rp - ткань перикарпия, изолированная из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно.

Фигура 13 показывает нозерн-блот анализ гена специфичной к аспарагиновой кислоте протеазы 2 (СсАР2) в различных тканях Coffea arabica, в котором дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F -цветки; SG (G) и (Р), LG (G) и (Р), Y (G) и (Р) и Red (G) и (Р) - соответственно зерно и перикарпий мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов; SG (G), LG (G), Y (G) и R (G) - перикарпий мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов кофейного дерева. В каждую дорожку геля загружали по пять микрограммов суммарной РНК. Панель А показывает в качестве контроля загрузки окрашенную бромистым этидием большую рибосомальную РНК перед блоттингом, а панель В представляет собой авторадиограмму, показывающую появление СсАР2 мРНК в специфических исследуемых тканях.

Фигура 14 показывает последовательность кДНК и предсказанную по ней аминокислотную последовательность СсСР-4. Строчные буквы: 5' и 3' нетранслируемые области гена. Прописные буквы: открытая рамка считывания. Жирный шрифт: аминокислотная последовательность; * - терминирующий трансляцию кодон (стоп-кодон).

Фигура 15 показывает выравнивание полноразмерной последовательности белка, кодируемого СсСР-4 кДНК, по отношению к другим полноразмерным цистеинпротеазам из базы данных NCBI. Оно выполнялось с использованием программы CLUSTAL W из пакета программ MegAlign (пакет Lasergene, DNASTAR). Зачерненные блоки показывают идентичные аминокислоты. Номера доступа даются в круглых скобках: Dacus carrota (JC7787); Ricinus communis (AF050756); Vicia sativa (Z34895); Phaseolus vulgaris (X56753); Helianthus annuus (AB109188); Glycine max Cysl (AB092555); Glycine max Cys2 (AB092557); Canavalia ensiformis (P49046); Oryza sativa (AB004648); Vigna mungo (PI 2412); Pisum sativum (AJ004985).

Фигура 16 показывает выравнивание полноразмерной кДНК последовательности СсСР-4 (KDDL) и неполной кДНК последовательности СсСР-4 (KDEL) с использованием программы ClustalW в пакете программ MegAlign.

Фигура 17 показывает выравнивание полноразмерной открытой рамки считывания СсСР-4 (KDDL) и неполной открытой рамки считывания СсСР-4 (KDEL) с использованием программы ClustalW в пакете программ MegAlign.

Фигура 18 показывает хроматограммы определения последовательностей ДНК в амплифицированной методом ПЦР геномной ДНК, кодирующей KDEL/KDDL область гена СсСР-4. "Rob" обозначает сорт робуста, "Arab" - сорт арабика.

Фигура 19 показывает нозерн-блот анализ экспрессии гена цистеинпротеазы СсСР-4 в различных тканях Coffea arabica. Дорожки в геле обозначены следующим образом: R - корневище; S - стебель; L - молодые листочки; F - цветки; SG(g), LG(g), Y(g) и Red(g) - зерно, выбранное из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов, соответственно. SG(p), LG(p), Y(p) и Red(p) - ткань перикарпия, изолированная из мелких зеленых, крупных зеленых, желтых и красных плодов кофейного дерева, соответственно. В каждую дорожку геля загружали по пять микр