Диаминотриазолы, пригодные в качестве ингибиторов протеинкиназ

Диаминотриазолы, пригодные в качестве ингибиторов протеинкиназ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии 35 U.S.C. § 119 предварительных заявок США под номером 60/426681, зарегистрированной 15 ноября 2002 и озаглавленной «Compositions Useful as Inhibitors of Protein Kinase», и номером 60/447705, зарегистрированной 11 февраля 2003 и озаглавленной «Compositions Useful as Inhibitors of Protein Kinase», причем полное содержание каждой из этих заявок, таким образом, включено в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к ингибиторам протеинкиназ. Изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим соединения изобретения и способам применения композиций при лечении различных заболеваний.

Поиску новых терапевтических агентов значительно помогло в последние годы лучшее понимание структуры ферментов и других биомолекул, ассоциированных с заболеваниями. Одним важным классом ферментов, которые были предметом экстенсивного исследования, являются протеинкиназы.

Протеинкиназы составляют большое семейство структурно близких ферментов, которые являются ответственными за контроль различных процессов сигнальной трансдукции в клетке. (См. Hardie G. and Hanks, S. The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, CA: 1995). Считается, что протеинкиназы возникли из обычного предкового гена вследствие консервации их структуры и каталитической функции. Почти все киназы содержат похожий каталитический домен из 250-300 аминокислот. Киназы могут быть группированы на классы по субстратам, которые они фосфорилируют (например, протеинтирозин, протеинсерин/треонин, липиды и тому подобное). Идентифицированы мотивы последовательности, которые обычно соответствуют каждому из этих семейств киназ (см., например, Hanks, S.K. Hunter, T., FASEB J. 1995, 9, 576-596; Knighton et al., Science, 1991, 253, 407-414; Hiles et al., Cell 1992, 70, 419-429, Kunz et al., Cell 1993, 73, 585-596; Carcia-Bustos et al., EMBO J. 1994, 13, 2352-2361).

В общем, протеинкиназы опосредуют внутриклеточную передачу сигнала действием переноса фосфорила от нуклеозидтрифосфата к акцептору-белку, который принимает участие в пути переноса сигнала. Эти явления фосфорилирования действуют в качестве молекулярных включений/выключений, которые могут модулировать или регулировать биологическую функцию целевого белка. Эти события фосфорилирования в конце концов запускаются в ответ на различные внеклеточные и другие стимулы. Примеры таких стимулов включают в себя сигналы стрессов окружающей среды и химических стрессов (например, осмотического шока, теплового шока, ультрафиолетового излучения, бактериального эндотоксина и Н₂О₂), цитокинов (например, интерлейкина-1 (IL-1) и фактора α некроза опухолей (TNF-α)) и факторов роста (например, кофактора колониеобразования гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и фактора роста фибробластов (FGF)). Внеклеточные стимулы могут действовать на одну или несколько клеточных реакций, относящихся к росту, миграции, дифференциации клеток, секреции гормонов, активации факторов транскрипции, сокращению мышц, метаболизму глюкозы, регуляции синтеза белков и регуляции клеточного цикла.

Многие заболевания ассоциируются с аномальными клеточными реакциями, запускаемыми опосредованными протеинкиназами событиями, как описано выше. Эти заболевания включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, костные заболевания, метаболические заболевания, неврологические и нейродегенеративные заболевания, рак, сердечно-сосудистые заболевания, аллергии и астму, болезнь Альцгеймера и гормон-связанные заболевания. В соответствии с этим значительные усилия в лекарственной химии были направлены на нахождение ингибиторов протеинкиназ, которые являются эффективными в качестве терапевтических агентов.

Семейство рецепторов типа III тирозинкиназ, включающее в себя Flt3, c-Kit, PDGF-рецептор и c-Fms, играет важную роль в сохранении, росте и развитии гемопоэтических и негемопоэтических клеток [Scheijen, B, Criffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333 and Reille, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757]. FLT-3 и с-Kit регулируют сохранение пулов стволовых клеток/ранних клеток-предшественников, а также развитие зрелых лимфоидных и миелоидных клеток [Lyman, S. Jacobsen, S, Blood, 1998, 91, 1101-1134]. Оба рецептора содержат присущий домен киназы, который активируется при опосредованной лигандом димеризации рецепторов. При активации домен киназы индуцирует аутофосфорилирование рецептора, а также фосфорилирование различных цитоплазмических белков, которые помогают распространяться сигналу активации, приводящему к росту, дифференциации и выживанию. Некоторые передающие сигнал негативные регуляторы FLT-3 и с-Kit включают в себя PLCγ, PI3-киназу, Grb-2, SHIP и родственные Sre киназы [Scheijen, B. Griffin, JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Обнаружено, что обе рецепторные тирозинкиназы играют роль в различных гемопоэтических и негемопоэтических злокачественных образованиях. Мутации, которые индуцируют лиганднезависимую активацию FLT-3 и c-Kit, участвуют в остром миелогенном лейкозе (AML), остром лимфоцитном лейкозе (ALL), мастоцитозе и опухоли желудочно-кишечной стромы (GIST). Эти мутации включают в себя одно аминокислотное изменение в домене киназы или внутренние тандемные дупликации, точечные мутации или делеции в рамке считывания, расположенные рядом с регионом мембраны рецепторов. Кроме активирующих мутаций лигандзависимая (аутокринная или паракринная) стимуляция сверхэкспрессированной FLT3 дикого типа или c-Kit может способствовать злокачественному фенотипу [Scheijen, B. Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333].

С-fms кодирует рецептор колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF-1R), который экспрессируется преимущественно в линии дифференцировки моноцитов/марофагов [Dai, XM et al., Blood, 2002, 99, 111-120]. M-CSF-1R и его лиганд регулируют линию роста и дифференцировки макрофага. Подобно другим членам семейства M-CSF-1R содержит присущий домен киназы, который активируется при лиганд-индуцированной димеризации рецептора. M-CSF-1R экспрессируется также в негемопоэтических клетках, включающих эпителиальные клетки молочной железы и нейроны. Мутации в этом рецепторе потенциально связаны с миелоидным лейкозом и его экспрессия коррелирует с метастатической карциномой молочной железы, яичников и эндометрия [Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757 and Kacinski, BM, Mol. Reprod. and Devel., 1997, 46, 71-74]. Другим возможным показанием для антагонистов M-CSF-1R является остеопороз [Teitelbaum, S., Science 2000, 289, 1504-1508].

PDGF-рецептор (PDGFR) имеет две субъединицы, PDGFR-α и PDGFR-β, которые могут образовывать гомо- или гетеродимеры при связывании лиганда. Имеется несколько лигандов PDGFR: АВ, ВВ, СС и DD. PDGFR экспрессируется на ранних стволовых клетках, тучных клетках, миелоидных клетках, мезенхимальных клетках и клетках гладких мышц [Scheijen, B. Griffin, JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Только PDGFR-β участвует в миелоидных лейкозах, обычно в качестве партнера транслокации с Tel, белком взаимодействия Хантингтона (HIP1) или рабаптином 5. Недавно было обнаружено, что активация мутации в домене киназы PDGFR-α происходит в опухолях желудочно-кишечной стромы (GIST) [Heinrich, MC et al., Sciencexpress, 2003].

Циклинзависимые киназы (CDKs) являются серин/треонинпротеинкиназами, состоящими из обогащенной β-складкой аминоконцевой долей и большой карбоксиконцевой долей, которая в основном является α-спиральной. CDKs обнаруживает 11 субдоменов, участвующих во всех протеинкиназах и имеющих диапазон молекулярных масс от 33 до 44 кД. Это семейство киназ, которое включает в себя CDK1, CDK2, CDK4 и CDK6, требует фосфорилирования у остатка, соответствующего Thr 160 CDK2, чтобы быть полностью активным [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].

Каждый комплекс CDK образован из регуляторной субъединицы циклина (например, циклина А, В1, В2, D1, D2, D3 и Е) и субъединицы каталитической киназы (например, CDK1, CDK2, CDK4, CDK5 и CDK6). Каждая разная пара киназа/циклин функционирует для регуляции разных и специфических фаз клеточного цикла, известных как фазы G1, S, G2 и М [Nigg, E., Nature Reviews 2001, 2, 21-32; Flatt, P., Pietenpol, J. Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305].

CDKs принимают участие в нарушениях пролиферации клеток, особенно при раке. Клеточная пролиферация является результатом прямой или косвенной дерегуляции цикла деления клетки, и CDKs играет критическую роль в регуляции различных фаз этого цикла. Например, сверхэкспрессия циклина D1 обычно ассоциируется с различными раковыми заболеваниями человека, включающими карциномы и глиомы молочной железы, толстой кишки и гепатоклеточные карциномы и глиомы [Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Rewiews 2000, 32, 283-305]. Комплекс CDK2/циклин Е играет ключевую роль в развитии от ранней фазы G₁ до фазы S клеточного цикла, и сверхэкспрессия циклина Е была ассоциирована с различными солидными опухолями. Следовательно, ингибиторы циклинов D1, E или ассоциированных с ними CDKs являются пригодными целями для терапии рака [Kaubisch, A. Schwartz, G., The Cancer Journal 2000, 6, 192-212].

CDKs, особенно CDK2, также играет роль в апоптозе и развитии Т-клеток. CDK2 был индентифицирован как ключевой регулятор апоптоза тимоцита [Williams, O., et al., European Journal of Immunology 2000, 709-713]. Стимуляция активности CDK2-киназы ассоциируется с развитием апоптоза в тимоцитах в ответ на специфические стимулы. Ингибирование активности CDK2-киназы блокирует этот апоптоз, что приводит к защите тимоцитов.

Кроме регуляции клеточного цикла и апоптоза CDKs непосредственно принимают участие в процессе транскрипции. Различные вирусы требуют CDKs для их процесса репликации. Примеры, в которых ингибиторы CDK ограничивают вирусную репликацию, включают в себя цитомегаловирусы человека, вирус герпеса и вирус ветряной оспы [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].

Ингибирование CDK также является пригодным для лечения невродегенеративных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера. Появление спаренных спиральных нитей (PHF), связанное с болезнью Альцгеймера, вызывается гиперфосфорилированием белка Tau CDK5/р25 [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 2000, 3, 83-88].

Другим особенно интересным семейством киназ является семейство киназ Src. Эти киназы принимают участие в раковом заболевании, дисфункции иммунной системы и ремоделирующих кости заболеваниях. Для общих обзоров см. Thomas and Brugge, Annu. Rtv. Cell Dev. Biol. 1997, 13, 513; Lawrence and Niu, Pharmacol. Ther. 1998, 77, 81; Tatosyan and Mizenina, Biochemistry (Moscow) 2000, 65, 49; Boschelli et al., Drugs of The Future 2000, 25(7), 717, (2000).

Члены семейства Src включают в себя следующие восемь киназ в организме млекопитающих: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck и Blk. Эти нерецепторные протеинкиназы имеют диапазон молекулярной массы от 52 до 62 кД. Все они характеризуются общей структурной организацией, которая состоит из шести определенных функциональных доменов: домен гомологии Src 4 (SH4), уникальный домен, домен SH3, домен SH2, каталитический домен (SH1) и С-концевая регуляторная область. Tatosyan et al. Biochemistry (Moscow) 2000, 65, 49-58.

На основе опубликованных исследований киназы Src рассматривают в качестве потенциальных терапевтических мишеней для различных заболеваний человека. Мыши, которые имеют дефицит в Src, характеризуются развитием остеопороза или построением костей вследствие пониженной резорбции костей остеокластами. Это позволяет предположить, что остеопороз, возникающий вследствие аномально высокой резорбции костей, можно лечить ингибированием Src. Soriano et al., Cell 1992, 69, 551 and Soriano et al., Cell 1991, 64, 693.

Подавление деструкции артритных костей достигалось сверхэкспрессией CSK в ревматоидных синовиоцитах и остеокластах. Takayanagi et al., J. Clin Invest. 1999, 104, 137. CSK или С-концевая Src-киназа фосфорилирует и тем самым ингибирует каталитическую активность Src. Это значит, что ингибирование Src может предотвратить деструкцию сустава, которая является характеристикой у пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Boschelli et al., Drugs of Future 2000, 25(7), 717.

Src играет также роль в репликации вируса гепатита В. Кодированный вирусом фактор транскрипции НВх активирует Src в стадии, требуемой для размножения вируса. Klein et al., EMBO J. 1999, 18, 5019 and Klein et al., Mol. Cell. Biol. 1997, 17, 6427.

В ряде исследований связывали экспрессию Src с раковыми заболеваниями, такими как рак толстой кишки, молочной железы, печени и поджелудочной железы, некоторые В-клеточные лейкозы и лимфомы. Talamonti et al., J. Clin. Invest. 1993, 91, 53; Lutz et al., Biochem. Biophys. Res. 1998 243, 503; Rosen et al., J. Biol. Chem. 1986, 261, 13754; Bolen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 2251; Masaki et al., Hepatology 1998, 27, 1257; Biscardi et al., Adv. Cancer Res. 1999, 76, 61; Lynch et al., Leukemia, 1993, 7, 1416. Кроме того, было обнаружено, что антисмысловая Src, экспрессированная в опухолевых клетках яичников и прямой кишки, ингибирует рост опухоли. Wiener et al., Clin Cancer Res., 1999, 5, 2164; Staley et al., Cell Growth Diff., 1997, 8, 269.

Другие киназы семейства Src также являются потенциальными терапевтическими целями. Lck играет роль в передаче сигнала Т-клеток. Мыши, у которых отсутствует ген Lck, обладают слабой способностью к развитию тиомоцитов. Функция Lck в качестве позитивного активатора передачи сигнала Т-клеток подтверждает, что ингибиторы Lck могут быть применимыми для лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит. Molina et al., Nature, 1992, 357, 161. Hck, Fgr и Lyn были идентифицированы в качестве важных медиаторов передачи сигнала интегрина в миелоидных лейкоцитах. Lowell et al., J. Leukoc. Biol., 1999, 65, 313. Ингибирование этих медиаторов киназ может быть, следовательно, полезным для лечения воспаления. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.

Syk является тирозинкиназой, которая играет критическую роль в опосредованной FcεRI дегрануляции тучных клеток и активации эозинофилов. В соответствии с этим киназа Syk принимает участие в различных аллергических нарушениях, в частности, астме. Было обнаружено, что Syk связывается с фосфорилированной гамма-цепью рецептора FcεRI через N-концевые домены SH2 и является существенным для передачи последующего сигнала [Taylor et al., Mol. Cell. Biol. 1995, 15, 4149].

Ингибирование апоптоза эозинофилов было предложено в качестве ключевого механизма развития эозинофилии крови и тканей при астме. IL-5 и GM-CSF позитивно регулируются при астме и предлагаются для индуцирования эозинофилии крови и тканей ингибированием апоптоза эозинофилов. Ингибирование апоптоза эозинофилов было предложено в качестве ключевого механизма для развития эозинофилии крови и тканей при астме. Указывается, что киназа Syk требуется для предотвращения апоптоза эозинофилов цитокинами (использование антисмысловых последовательностей) [Yousefi et al., J. Exp Med 1996, 183, 1407].

Роль Syk в FcγR-зависимой и -независимой реакции в полученных из костного мозга макрофагов определяли с использованием облученных мышиных химер, реконструированных клетками фетальной печени из Syk-/-эмбрионов. SYK-дефицитные макрофаги были дефективными при фагоцитозе, индуцированном FcγR, но проявили нормальный фагоцитоз в ответ на комплемент [Kiefer et al., Mol Cell Biol. 1998, 18, 4209]. Указывалось также, что антисмысловая последовательность аэролизированного Syk подавляет экспрессию Syk и высвобождает медиатор из макрофагов (Stenton et al., Immunology 2000, 164, 3790].

Киназы Janus (JAK) являются семейством, состоящим из JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. JAK играют критическую роль в передаче сигнала цитокинов. Последующие по ходу событий субстраты семейства киназ JAK включают в себя трансдуктор сигнала и активатор белков транскрипции (STAT). Передача сигнала JAK/STAT принимает участие в опосредовании многих аномальных иммунных реакций, таких как аллергии, астма, аутоиммунные заболевания, такие как отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, боковой амиотрофический склероз и рассеянный склероз, а также солидные и гематологические злокачественности, такие как лейкозы и лимфомы. Фармацевтическое вмешательство в путь JAK/STAT указывается в обзорах [Frank Mol. Med. 5, 432-456 (1999) & Seidel et al., Oncogene 19, 2646-2656 (2000)].

JAK1, JAK2 и TYK2 экспрессируются повсеместно, тогда как Jak3 преимущественно экспрессируется в гемопоэтических клетках. JAK3 связывается эксклюзивно с гамма-цепью (γ_c) обычного рецептора цитокина и активируется IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15. Пролиферация и выживаемость мышиных тучных клеток, индуцированных IL-4 и IL-9, фактически, как было показано, зависит от подачи сигнала JAK3 и γ_c [Suzuki et al., Blood 96, 2172-2180 (2000)].

Связывание рецепторов иммуноглобулина (Ig) Е с высокой аффинностью сенсибилизированных тучных клеток приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов, включающих ряд вазоактивных цитокинов, являющихся результатом острых аллергических или промежуточных (типа I) реакций гиперчувствительности [Gordon et al., Nature 346, 274-276 (1990) & Galli, N. Engl. J. Med., 328, 257-265 (1993)]. Была установлена критическая роль JAK3 в опосредованных рецептором IgE реакциях тучных клеток in vitro и in vivo [Malaviya, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 807-813 (1999)]. Кроме того, описано также предотвращение реакций гиперчувствительности типа I, в том числе анафилаксии, опосредованной активацией тучных клеток посредством ингибирования JAK3 [Malaviya et al., J. Biol. Chem. 274, 27028-27038 (1999)]. Нацеливание на тучные клетки ингибиторов JAK3 модулирует дегрануляцию тучных клеток in vitro и предотвращает опосредованные IgE-рецептором/антигеном анафилактические реакции in vivo.

В недавнем исследовании описано удачное «нацеливание» JAK3 для иммунной супрессии и переносимости аллотрансплантата. В исследовании показана доза-зависимая выживаемость сердечного аллотрансплантата буйвола у реципиентов Wistar Furth при введении ингибиторов JAK3, что указывает на возможность регуляции нежелательных иммунных реакций при гомологичной болезни [Kirken Transpl. Proc. 33, 3268-3270 (2001)].

IL-4-опосредованное STAT-фосфорилирование принимало участие в качестве механизма, включенного в ранние и поздние стадии ревматоидного артрита (RA). Позитивная регуляция провоспалительных цитокинов в синовиальной оболочке и синовиальной жидкости при RA является характеристикой данного заболевания. Было показано, что IL-4-опосредованная активация пути IL-4/STAT опосредуется через киназы Janus (JAK 1 & 3) и что ассоциированные с IL-4 киназы JAK экспрессируются в синовиальной оболочке RA [Muller-Ladner, et al., J. Immunol. 164, 3894-3901 (2000)].

Семейный боковой амиотрофический склероз (FALS) является фатальным нейродегенеративным нарушением, поражающим приблизительно 10% пациентов ALS. Степени выживаемости мышей с FALS повышались при лечении JAK3-специфичного ингибитора. Это подтверждает, что JAK3 играет роль в FALS [Trieu, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 22-25 (2000)].

Белки, являющиеся трансдуктором сигнала и активатором транскрипции (STAT), активируются среди прочих киназами семейства JAK. Результаты недавнего исследования подтвердили возможность вмешательства в путь передачи сигнала JAK/STAT посредством «прицеливающихся» в киназы семейства JAK специфических ингибиторов для лечения лейкоза [Sudbeck, et al., Clin. Cancer Res. 5, 2569-1582 (1999)]. Обнаружено, что JAR3-специфические соединения ингибируют клоногенный рост JAK3-экспрессирующих клеточных линий DAUDI, RAMOS, LC1; 19, NALM-6, MOLT-3 и HL-60.

На животных моделях белки слияния TEL/JAK2 вызывали миелопролиферативные нарушения и в гематопоэтических клеточных линиях введение TEL/JAK2 приводило к активации STAT1, STAT3, STAT5 и цитокин-независимому росту [Schwaller, et al., EMBO, J. 17, 5321-5333 (1998)].

Ингибирование JAK3 и TYK 2 отменяет фосфорилирование тирозина STAT3 и ингибирует рост клеток при mycosis fungoides, форме кожной лимфомы Т-клеток. Эти результаты подразумевают участие киназ семейства JAK в существенно активированном пути JAK/STAT, который присутствует при mycosis fungoides [Neilsen, et al., Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 94, 6764-6769 (1997)]. Аналогично показано, что STAT3, STAT5, JAK1 и JAK2 существенно активируются в лимфоме Т-клеток мышей, характеризующейся первоначально сверхэкспрессией LCK, таким образом далее вовлекая путь JAK/STAT в аномальный рост клеток [Yu, et al., J. Immunol. 159, 5206-5210 (1997)]. Кроме того, IL-6 опосредованная STAT3-активация блокируется ингибитором JAK, что приводит к сенсибилизации клеток миеломы к апоптозу [Catlett-Falcone, et al., Immunity 10, 105-115 (1999)].

Одним представляющим интерес семейством киназ является Rho-ассоциированная образующая суперспираль протеинсерин/треонинкиназа (ROCK), которая, как считается, является эффектором Ras-связанной небольшой GTPазой Rho. Семейство ROCK включает в себя p160ROCK (ROCK-1) (Ishizaki et al., EMBO J 1996, 15, 1885-1893) и ROKα/Rho-киназа/ROCK-II (Leung et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 29051-29054; Matsui et al., EMBO J. 1996, 15, 2208-2216; Nakagawa et al., FEBS Lett. 1996, 392, 189-193), протеинкиназа PKN (Amano et al., Science 1996, 271, 648-650; Watanabe et al., Science 1996, 271, 645-648), и цитрон и цитронкиназа (Madaule et al. Nature, 1998, 394, 491-494; Madaule et al., FEBS Lett. 1995, 377, 243-248). Обнаружено, что киназы семейства ROCK принимают участие в осуществлении различных функций, включая Rho-индуцированное образование актиновых стрессовых волокон и фокальных адгезий, (Leung et al., Mol. Cell Biol. 1996, 16, 5313-5327; Amano et al., Science, 1997, 275, 1308-1311; Ishizaki et al., FEBS Lett. 1997, 404, 118-124) и в регуляции по типу обратной связи миозинфосфатазы (Kimura et al., Science, 1996, 273, 245-248), активации тромбоцитов (Klages et al., J. Cell Biol., 1999, 144, 745-754), сокращении гладких мышц аорты под действием различных стимулов, (Fu et al., FEBS Lett., 1998, 440, 183-187), индуцированные тромбином реакции клеток гладких мышц аорты, (Seasholtz et al., Cir. Res., 1999, 84, 1186-1193), гипертрофию кардиомиоцитов (Kuwahara et al., FEBS Lett., 1999, 452, 314-318), сокращение бронхиальных гладких мышц (Yoshii et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol, 1999, 20, 1190-1200), сокращение гладких мышц и цитоскелетной реорганизации немышечных клеток (Fukata et al., Trends in Pharm. Sci 2001, 22, 32-39), активацию регулируемых объемом анионных каналов (Nilius et al., J. Physiol., 1999, 516, 67-74), невритную ретракцию (Hirose et al., J. Cell. Biol., 1998, 141, 1625-1636), хемотаксис нейтрофилов (Niggli, FEBS Lett., 1999, 445, 69-72), заживление ран (Nobes and Hall, J. Cell. Biol., 144, 1235-1244), инвазии опухоли (Itoh et. al., Nat. Med., 1999, 5, 221-225) и клеточной трансформации (Sahai et al., Curr. Biol, 1999, 9, 136-145)). Более конкретно, ROCK принимает участие в различных заболеваниях и нарушениях, включающих в себя гипертензию (Satoh et al., J. Clin. Invest. 1994, 94, 1397-1403; Mukai et al., FASEB J. 2001, 75, 1062-1064; Uehata et al., Nature 1997, 389, 990-994; Masumoto et al., Hypertension, 2001, 38, 1307-1310), церебральный вазоспазм (Sato et al., Circ. Res. 2000, 87,195-200; Miyagi et al., J. Neurosurg. 2000, 93, 471-476; Tachibana et al., Acta Neurochir (Wien) 1999, 141, 13-19), коронарный вазоспазм (Shimokawa et al., Jpn. Cir. J. 2000, 64, 1-12; Kandabashi et al., Circulation 2000, 101, 1319-1323; Katsumata et al., Circulation 1997, 96, 4357-4363; Shimokawa et al., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Utsunomiya et al., J. Pharmacol. 2001, 134, 1724-1730; Masumoto et al., Circulation 2002, 105, 1545-154), бронхиальную астму (Chiba et al., Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1995, 11, 351-357; Chiba et al., Br. J. Pharmacol. 1999, 127, 597-600; Chiba et al., Br. J. Pharmacol. 2001, 133, 886-890; Iizuka et al., Eur. J. Pharmacol. 2000, 406, 273-279), преждевременные роды (Niro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 230, 356-359; Tahara et al., Endocrinology 2002, 143, 920-929; Kupittayanant et al., Pflugers Arch. 2001, 443, 112-114), эректильную дисфункцию (Chitaley et al., Nat. Med. 2001, 7, 119-122; Mills et al., J. Appl. Physiol. 2001, 91, 1269-1273), глаукому (Honjo et al., Arch. Ophthalmol. 2001, 1171-1178; Rao et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001, 42, 1029-1037), пролиферацию клеток васкулярных гладких мышц (Shimokawa et al., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Morishige et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2001, 21, 548-554; Eto et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol 2000, 278, H1744-H1750; Sawada et al., Circulation 2000, 101, 2030-2023; Shibata et al., Circulation 2001, 103, 284-289), гипертрофию миокарда (Hoshijima et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7725-77230; Sah et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 31185-31190; Kuwahara et al. FEBS Lett. 1999, 452, 314-318; Yanazume et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 8618-8625), малигному (Itoh et al. Nat. Med. 1999, 5, 221-225; Genda et al. Hepatology 1999, 30, 1027-1036; Somlyo et al. Biochem., Biophys. Res. Commun. 2000, 269, 652-659), повреждение, вызванное ишемией/реперфузией (Ikeda et al. J. of Surgical Res. 2003, 109, 155-160; Miznuma et al. Transplantation 2003, 75, 579-586), эндотелиальную дисфункцию (Hernandez-Perera et al. Circ. Res. 2000, 87, 616-622; Laufs et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 24266-24271; Eto et al., Circ. Res. 2001, 89, 583-590), болезнь Крона и колит (Segain et al. Gastroenterology 2003, 124(5), 1180-1187), отрастание нейритов (Fournier et al. J. Neurosci. 2003, 23, 1416-1423), болезнь Рейно (Shimokawa et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2002, 39, 319-327) и атеросклероз (Retzer et al. FEBS Lett. 2000, 466, 70-74; Ishibashi et al. Biochim. Biophys. Acta 2002, 1590, 123-130). В соответствии с этим разработка ингибиторов киназ ROCK может быть применима в качестве терапевтических агентов для лечения нарушений, принимающих участие в пути киназы ROCK.

ERK2 (киназа, регулирующая внеклеточный сигнал) является членом семейства митоген-активированных протеинкиназ (МАР)1 млекопитающих. Киназы (МАР)1 являются серин/треонинкиназами, которые опосредуют пути внутриклеточной сигнальной трансдукции (Cobb and Goldsmith, J Biol. Chem., 1995, 270, 14843; Davis, Mol. Reprod. Dev. 1995, 42, 459) и активируются митогенами и факторами роста (Bokemeyer et al. Kidney Int. 1996, 49, 1187). Члены семейства киназ МАР подобным образом имеют общую последовательность и консервативные структурные домены и помимо ERK2 включают в себя киназы JNK (N-концевая киназа Jun) и р38. Киназы JNKs и р38 активируются в ответ на провоспалительные цитокины TNF-альфа и интерлейкин-1 и клеточным стрессом, таким как тепловой шок, гиперосомолярность, ультрафиолетовое излучение, липополисахарид и ингибиторы синтеза белка (Derijard et al., Cell 1994, 76, 1025; Han et al., Science 1994, 265, 808; Raingeaud et al., J Biol. Chem. 1995, 270, 7420; Shapiro and Dinarello, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12230). В противоположность этому ERK активируются митогенами и факторами роста (Bokemeyer et al., Kidney Int. 1996, 49, 1187).

ERK2 является широко распространенной протеинкиназой, которая достигает максимальную активность, когда Thr183 и Tyr185 фосфорилируются киназой МАР предшествующего события, МЕК1 (Anderson et al., Nature 1990, 343, 651; Crews et al., Science 1992, 255, 478). При активации ERK2 фосфорилирует многие регуляторные белки, включая протеинкиназы Rsk90 (Bjorbaek et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 18848) и МАРКАР2 (Rouse et al., Cell 1994, 78, 1027), и факторы транскрипции, такие как ATF2 (Raingeaud et al., Mol Cell Biol. 1996, 16, 1247), Elk-1 (Raingeaud et al., Mol. Cell Biol. 1996, 16, 1247), c-Fos (Chen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 1993, 90, 10952), и с-Мус (Oliver et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995, 210, 162). ERK2 является также мишенью в последующем событии Ras/Raf-зависимых путей (Moodie et al., Science 1993, 260, 1658) и может помочь заменить сигналы от этих потенциально онкогенных белков. Обнаружено, что ERK2 играет роль в негативном контроле роста раковых клеток молочной железы (Frey and Mulder, Cancer Res. 1993, 57, 628), и описана сверхэкспрессия ERK2 в раковой опухоли молочной железы человека (Sivaraman et al., J Clin. Invest. 1997, 99, 1478). Активированный ERK2 участвует также в пролиферации эндотелин-стимулированных клеток гладких мышц дыхательных путей, что подтверждает роль этой киназы при заболевании астмой (Whelchel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997, 16, 589).

Гликогенсинтаза киназа-3 (GSK-3) является серин/треонинпротеинкиназой, состоящей из α- и β-изоформ, каждая из которых кодируется определенными генами (Coghlan et al., Chemistry & Biology 2000, 7, 793-803; and Kim and Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 2000 10, 508-514). GSK-3 принимает участие в различных заболеваниях, включающих в себя болезнь Альцгеймера, нарушения деятельности ЦНС, такие как маниакальное депрессивное нарушение и невродегенеративные заболевания, и кардиомиоцитная гипертрофия [PCT Application Nos.: WO 99/65897 and WO 00/38675; and Haq et al., J. Cell Biol. 2000, 151, 117-130]. Эти заболевания ассоциируются с аномальной операцией некоторых путей передачи сигналов клеток, в которых GSK-3 играет роль. Обнаружено, что GSK-3 фосфорилирует и моделирует активность ряда ругуляторных белков. Эти белки включают в себя гликогенсинтазу, которая является ограничивающим скорость ферментом, необходимым для синтеза гликогена, связанным с микротрубочками белком Tau, фактором транскрипции гена β-катенином, фактор инициации транскрипции е1F2B, а также цитратлиазой АТФ, аксином, фактором-1 теплового шока, с-Jun, c-myc, c-myb, CREB и СЕРВАα. Эти разнообразные белковые цели вовлекают GSK-3 во многие аспекты клеточного метаболизма, пролиферации, дифференциации и развития.

В опосредованном GSK-3 пути, который является приемлемым для лечения диабета типа II, индуцированная инсулином передача сигнала приводит к клеточному поглощению глюкозы и синтезу гликогена. Наряду с этим путем GSK-3 является негативным регулятором инсулин-индуцированного сигнала. Обычно присутствие инсулина вызывает ингибирование опосредованного GSK-3 фосфорилирования и деактивации гликогенсинтазы. Ингибирование GSK-3 приводит к повышенному синтезу гликогена и поглощению глюкозы [Klein et al., PNAS 1996, 93, 8455-8459; Cross et al., Biochem. J. 1994, 303, 21-26; Cohen, Biochem. Soc. Trans. 1993, 21, 555-567; and Massillon et al., Biochem J. 1994, 299, 123-128]. Однако у диабетического пациента, у которого инсулиновая реакция ослаблена, синтез гликогена и поглощение глюкозы не повышается несмотря на присутствие относительно высоких уровней инсулина в крови. Это приводит к аномально высоким уровням в крови глюкозы с острыми и продолжительными эффектами, которые могут в конце концов привести к сердечно-сосудистому заболеванию, почечной недостаточности и слепоте. У таких пациентов нормальное, индуцированное инсулином ингибирование GSK-3 не имеет места. Описано также, что у пациентов с диабетом типа II GSK-3 сверхэкспрессируется [см. заявку РСТ: WO 00/38675]. Терапевтические ингибирования GSK-3, следовательно, являются потенциально применимыми для лечения диабетических пациентов, страдающих ослабленной реакцией на инсулин.

Активность GSK-3 связана также с болезнью Альцгеймера. Это заболевание характеризуется хорошо известным β-амилоидным пептидом и образованием внутриклеточных нейрофибриллярных клубков. Пептиды Аβ образуются из амилоидного белка-предшественника (АРР) последовательным протеолизом, катализируемым аспартилпротеазой ВАСЕ2, с последующим расщеплением презенелин-зависимой γ-секретазой. Было показано, что антитела против β-амилоидных бляшек могут медленно снижать познавательную способность у пациентов с болезнью Альцгеймера (Hock et al., Neuron, 2003, 38, 547-554) и, таким образом, другие снижающие β-амилоид стратегии (например, разработка агентов, способных ингибировать β-амилоидный пептид) могут быть применимыми при лечении болезни Альцгеймера и других психотических и нейродегенеративных нарушений. Кроме того, нейрофибриллярные клубки содержат гиперфосфорилированный белок Tau, который фосфорилируется на аномальных сайтах, и эти агенты, способные ингибировать гиперфосфорилирование белка Tau, могут быть применимыми при лечении болезни Альцгеймера и других психотических и нейродегенеративных нарушений.

Известно, что GSK-3 фосфорилирует эти аномальные сайты в клетках на моделях животных. Кроме того, обнаружено, что ингибирование GSK-3 предотвращает гиперфосфорилирование Tau в клетках [Lovestone et al., Current Biology 1994, 4, 1077-86; and Brownlees et al., Neuroreport 1997, 8, 3251-55]. Следовательно, активность GSK-3 стимулирует генерацию нейрофибриллярных клубков и развитие болезни Альцгеймера. Обнаружено также, что GSK-3 облегчает процессинг АРР и что ингибитор GSK-3 (литий) ингибирует генерацию Аβ-пептидов посредством ингибирования GSK-3 (Phiel et al. Nature 2003, 423, 435-439). Таким образом, разработка ингибиторов GSK-3 может быть применимой для снижения образования амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, патологических отличительных признаков болезни Альцгеймера, и может быть применимой для лечения других психотических и нейродегенеративных нарушений.

Другим субстратом GSK-3 является β-катенин, который деградирует после фосфорилирования GSK-3. Пониженные уровни β-катенина обнаружены у шизофренических пациентов и были ассоциированы с другими заболеваниями, относящимися к увеличению гибели нейронных клеток [Zhong et al., Nature 1998, 395, 698-702; Takashima et al., PNAS 1993, 90, 7789-93; and Pei et al., J. Neuropathol. Exp 1997, 56, 70-78].

Активность GSK-3 ассоциируется также с ударом [Wang et al., Brain Res 2000, 859, 381-5; Sasaki et al., Neurol Res 2001, 23, 588-92; Hashimoto et al., J. Biol. Chem 2002, 277, 32985-32991].

Подсемейство киназ AGC фосфорилирует их субстраты у остатков серина и треонина и принимает участие в различных хорошо известных процессах передачи сигналов, включающих в себя, но не ограничивающихся перечисленным, передачу сигнала циклического АТФ, реакцию на инсулин, защиту апоптоза, передачу сигнала диацилглицерина и регулирование трансляции белка (Peterson et al., Curr. Biol. 1999, 9, R521). Это подсемейство включает в себя РКА, РКВ (с-Akt), PCK, PRK1, 2, p70^S6K и PDK.

Обнаружено, что АКТ (известная также как РКВ или Rac-PK бета), серин/треонинпротеинкиназа, сверхэкспрессируется в нескольких типах раковых заболеваний и является медиатором функций нормальных клеток [(Khwaja, A., Nature 1999, 401, 33-34); (Yuan, Z.Q., et al., Oncogene 2000, 19, 2324-2330); (Namikawa, K., et al., J Neurosci. 2000, 20, 2875-2886)]. АКТ содержит домен N-концевой гомологии плекскина (РН), домен киназы и С-концевую «хвостовую» область. До сих пор обнаружены три изоформы АКТ-киназы человека (АКТ-1, -2 и -3) [(Cheng, J.Q., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 9267-9271); (Brodbeck, D. et al., J. Biol. Chem. 1999, 274, 9133-9136)]. Домен РН связывает 3-фосфоинозитиды, которые синтезируются фосфатидилинозит-3-киназой (PI3K) при стимуляции факторами роста, такими как полученный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), фактор роста нервов (NGF) и инсулиноподобный фактор роста (IFG-1) [(Kulik et al., Mol Cell. Biol, 1997, 17, 1595-1606,); (Hemmings, B.A., Science, 1997, 275, 628-630)]. Связывание липида с доменом РН стимулирует транслокацию АКТ на мембранах плазмы и облегчает фосфорилирование другими РН-доменсодержащими протеинкиназами, PDK1 у Thr308, Thr309 и Thr305 для изоформ АКТ 1, 2 и 3 соответственно. Вторая до сих пор неизвестная киназа требуется для фосфорилирования Ser473, Ser474 или Ser472 в С-концевых «хвостах» АКТ-1, -2 и -3 соответственно для создания полностью активированного фермента АКТ.

После расположения на мембране АКТ опосредует несколько функций в клетке, включающих метаболические действия инсулина (Calera, M.R. et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7201-7204), индуцирование дифференциации и/или пролиферации, синтез белка и стрессовые реакции (Alessi, D.R. et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 1998, 8, 55-62).

Проявления регуляций измененной АКТ появляются как при повреждении, так и при заболевании, причем наиболее важным является проявление его при раке. Первая оценка АКТ была связана с карциномой яичников человека, когда было обнаружено, что экспрессия АКТ амплифицирует в 15% случаев (Cheng, J.Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89, 9267-9271). Было также обнаружено, что она сверхэкспрессируется в 12% случаев панкреатических раковых заболеваний (Cheng, J. Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 3636-3641). Было показано, что АКТ-2 сверхэкспрессируется в 12% карцином яичников и что амплификация АКТ особенно частой была у 50% недифференцированных опухолей, подтверждая, что АКТ может также быть ассоциирована с агрессивностью опухоли (Bellacosa, et al., Int. J. Cancer 1995, 64, 280-285).

Обнаружено, что РКА (известная также как цАМФ-зависимая протеинкиназа) регулирует многие жизненные функции, включая метаболизм энергии, генную транскрипцию, пролиферацию, дифференциацию, репродуктивную функцию, секрецию, нейронную активность, память, сократительную способность и двигательную функцию (Beebe, S.J., Semin. Cancer Biol. 1994, 5, 285-294). РКА представляет собой тетрамерный гомофермент, который содержит две каталитические субъединицы, связанные с гомодимерной регуляторной субъединицей (которая действует для ингибирования каталитических субъединиц). При связывании цАМФ (активация фермента) каталитические субъединицы диссоциируют из регуляторных субъединиц с образованием активной серин/треонинкиназы (McKnight, G.S. et al., Recent Prog. Horm. Res. 1988,44, pp. 307). На сегодняшний день обнаружены три изоформы каталитической субъединицы (С-α, С-β и С-γ) (Beebe, S.J. et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 25505-25512), причем С-α-субъединица является наиболее экстенсивно изученной в основном благодаря ее повышенной экспрессии в первичных и метастатических меланомах (Becker, D. et al., Oncogene 1990, J, 1133). На сегодняшний день стратегии для модуляции активности С-α-субъединицы включают в себя использование антител, молекул, которые блокируют активность РКА посредством «нацеливания» на регуляторные димеры и экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов.

Рибосомные протеинкиназы р70^S6K -1 и -2 также являются членами подсемейства AGC протеинкиназ и катализируют фосфорилирование и последующую активацию рибосомного белка S6, который принимал участие в трансляционной позитивной регуляции мРНК, кодирующих компоненты аппаратуры синтеза белков. Эти мРНК содержат олигопиримидиновый тракт у их 5'-транскрипционного начального сайта, названного 5ТОР, который, как было обнаружено, является существенным для их регуляции на трансляционном уровне (Volarevic, S. et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001, 65, 101-186). Р70^S6K-зависимое фосфорилирование S6 стимулируется в ответ на различные гормоны и факторы роста в основном через путь PI3K (Coffer, P.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1994 198, 780-786), который может быть под регуляцией mTOR, поскольку рапамицин действует с ингибированием активности Р70^S6K и блокированием протеи