Анти-nogo антитела ("11с7") и их фармацевтическое использование

Анти-nogo антитела ("11с7") и их фармацевтическое использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к связывающим NogoA молекулам, таким, например, как моноклональные антитела или их Fab-фрагменты.

Регенерация поврежденных нервных клеток в центральной нервной системе (ЦНС) взрослого индивидуума ограничена подавляющим эффектом со стороны миелинового окружения аксонов (или нейритов) и формирующейся рубцовой ткани. За последние несколько лет были открыты явления, важные для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе неспособности ЦНС к спонтанному самовосстановлению после повреждения. Присутствие в миелине тормозящих рост молекул является главным препятствием к регенерации аксонов, в особенности сразу после повреждения. На сегодняшний день известны и охарактеризованы такие мощные ингибиторы роста аксонов, как NogoA, миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG) и миелин-олигодендроцитный гликопротеин (Omgp). Кроме того, в миелине присутствуют и другие тормозящие регенерацию компоненты, такие как хондроитинсульфатные протеогликаны. Белок NogoA относится к семейству ретикулонов и имеет, по меньшей мере, два биологически активных и различных в фармакологическом отношении домена, которые называются Amino-Nogo и Nogo-66. Рецепторный сайт для первого из них пока неизвестен, a Nogo-66 тормозит рост нейронов in vitro и in vivo при участии нейронального рецептора NgR. Помимо Nogo-66 с рецептором NgR также связываются, подавляя рост нейритов (или аксонов), MAG и Omgp, причем это связывание отличается высокой аффинностью.

В настоящее время изучаются новые подходы к решению проблемы восстановления нервной ткани, в том числе ферментативное расщепление рубцовой ткани хондроитиназой АВС, формирование клеточного моста за счет трансплантации клеток обонятельной оболочечной глии и стволовых клеток, применение белковых факторов роста для стимуляции роста нервных клеток; блокирование действия ингибиторов роста аксонов путем модуляции медиаторов межклеточных коммуникаций, таких как Rho, связанная с мембраной гуанозин-трифосфатаза (ГТФ-аза), которая представляется ключевым звеном в подавлении роста аксонов; применение циклической аденозин-монофосфатазы (цАМФ-аза), которая может преодолевать связанное с миелином подавление регенерации in vitro и индуцировать регенерацию in vivo; использование пептидных ингибиторов рецептора NgR (NEP 1-40) для индукции роста и функционального восстановления нейронов у крыс после повреждения спинного мозга.

Помимо вышеописанных подходов привлекает внимание возможность нейтрализации молекул центральной и периферической нервной системы, тормозящих рост аксонов, моноклональными антителами, в частности нейтрализация подавляющего действия NogoA. Так, было показано, что моноклональные антитела IN-1 или Fab-фрагменты IN-1 индуцируют рост аксонов in vitro и стимулируют образование новых отростков (процесс получил название "спраутинг") и регенерацию in vivo (Schwab и др., Physiol. Rev., т.76, 1996, с.319-370). По результатам тестирования различных доменов молекулы NogoA на способность подавлять рост нейритов было описано несколько доменов, обладающих ингибирующей активностью (Chen и др. Nature, т.403, 2000, с.434-439; GrandPre и др., Nature, т.403, 2000, с.439-444; Prinjha и др., Nature, т.403, 2000, с.383-384; также см. подробный анализ в Примере 1).

Природные иммуноглобулины, или антитела, как правило, представляют собой Y-образные многомерные молекулы, имеющие антигенсвязывающий сайт на конце каждого верхнего «плеча». Остальная часть структуры, в частности ствол Y, выполняет присущие иммуноглобулинам эффекторные функции. Молекула антитела состоит из двух тяжелых и двух легких цепей. Как тяжелые, так и легкие цепи имеют вариабельный домен и константную часть. Антигенсвязывающий сайт состоит из вариабельного домена тяжелой цепи, связанного с вариабельным доменом легкой цепи. Вариабельные домены тяжелых и легких цепей имеют одинаковую общую структуру. Более конкретно, антигенсвязывающие свойства антитела по существу определяются тремя специфическими областями вариабельного домена тяжелой и легкой цепи, которые называются гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность антител к антигену (CDR). Эти три гипервариабельных участка чередуются с четырьмя каркасными участками (FR), последовательности которых имеют относительно консервативный характер; непосредственного участия в связывании каркасные участки не принимают. CDR образуют петли и удерживаются на близком расстоянии друг от друга каркасными участками, которые в значительной степени принимают конформацию β-слоя. По существу, CDR тяжелой цепи вместе с CDR ассоциированной легкой цепи и составляют антигенсвязывающий сайт молекулы антитела. Какой участок антитела является каркасным (FR), а какой определяет комплементарность антитела к антигену (CDR), обычно выясняется путем сравнения аминокислотной последовательности множества антител, полученных у животных одного вида. Общие правила идентификации областей CDR и FR хорошо известны специалисту, работающему в данной области, и могут быть найдены в интернете, например, на сайте (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

Неожиданно обнаружилось, что новые моноклональные мышиные антитела (именуемые здесь и далее «11C7») к фрагменту полипептида NogoA крысы (SEQ ID NO:1), относящиеся к типу IgG1, обладают лучшими свойствами, чем ранее полученные антитела к NogoA, особенно в отношении аффинности связывания с NogoA различных видов, включая человека, а также в отношении более высокой активности, направленной на нейтрализацию способности NogoA подавлять рост нейритов при заданной концентрации антител. Более того, сейчас уже возможно сконструировать другие связывающие NogoA молекулы, имеющие такие же гипервариабельные участки, как и вышеупомянутые антитела.

Таким образом, в настоящем изобретении представлены молекулы, связывающие определенные области или эпитопы NogoA (именуемые в настоящем описании «связывающие молекулы по изобретению» или просто «связывающие молекулы»). Связывающие молекулы по изобретению предпочтительно связывают NogoA_623-640 человека (ортологичный фрагмент, к которому получены антитела 11С7; = SEQ ID NO: 6), NiG-D20 человека (ортологичен самому маленькому фрагменту NogoA, сохраняющему способность подавлять рост нейритов, SEQ ID NO: 24), NogoA человека (SEQ ID NO: 5) или NiG человека (который является наиболее мощным по степени подавления роста нейритов фрагментом NogoA, начинающимся с аминокислоты в положении 186 и заканчивающимся аминокислотой в положении 1004 последовательности NogoA человека, SEQ ID NO: 5) с константой диссоциации (Kd)<1000 нМ, более предпочтительно с Kd<100 нМ, а наиболее предпочтительно с Kd<10 нМ. Реакция связывания может быть продемонстрирована с использованием стандартных методов (качественные методы), включая, например, метод ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), описанный в Примере 6, и метод определения аффинности комплементарных взаимодействий с использованием биосенсора, описанный в Примере 7. Кроме того, связывание с человеческим NogoA и, что еще более важно, его эффективность может быть продемонстрирована в тесте роста нейритов, например, как описано ниже.

Так, в другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения связывающие молекулы (в концентрации 1 мг/мл или, что более предпочтительно, в концентрации 0,1 мг/мл, но наиболее предпочтительно в концентрации 0,01 мг/мл культуральной среды) увеличивают количество нейритов у гранулярных клеток мозжечка крысы, растущих на субстрате, представляющем собой белковый экстракт спинного мозга крысы, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно на 50%, а наиболее предпочтительно на 100%, по сравнению с количеством нейритов у гранулярных клеток мозжечка крысы, которые обрабатываются контрольными антителами, которые не связываются с NogoA человека, NiG человека, NiG-D20 человека или полипептидом NogoA_623-640 (т.е. имеют константу диссоциации >1000 нМ).

В другом предпочтительном варианте связывающие молекулы по изобретению имеют, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, который включает последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11C7, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10; и их прямые эквиваленты.

В другом объекте изобретения предложены связывающие молекулы по изобретению, имеющие, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, который содержит или

а) последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11С7, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, или

б) последовательно гипервариабельные области CDR1'-11С7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11C7, где CDR1'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и CDR3'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или

в) их прямые эквиваленты.

Другим объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы по изобретению, содержащие, по меньшей мере,

а) первый домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11С7, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

б) второй домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1'-11С7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11С7, где CDR1'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 и CDR3'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или

в) их прямые эквиваленты.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагаются связывающие молекулы по изобретению, содержащие, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, включающий

а) или вариабельную часть тяжелой цепи 11С7 (SEQ ID NO:2); или

б) вариабельную часть легкой цепи 11С7 (SEQ ID NO:3), или их прямые эквиваленты.

Когда антигенсвязывающий сайт включает оба домена - и первый, и второй - они могут находиться на одной и той же полипептидной молекуле или, что более предпочтительно, на разных, при этом первый домен является частью тяжелой цепи иммуноглобулина или его фрагмента, а второй домен является частью легкой цепи иммуноглобулина или его фрагмента.

Примеры связывающих молекул по изобретению включают антитела, продуцируемые В-клетками или клетками гибридомы, гибридные или гуманизированные антитела или любые их фрагменты, например F(ab')2; и Fab-фрагменты, а также одноцепочечные антитела или антитела, имеющие единственный домен.

Одноцепочечные антитела состоят из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, ковалентно связанных линкерным пептидом, как правило, состоящим из 10-30 аминокислот, предпочтительно от 15 до 25 аминокислот. Так что такая структура не включает константные части тяжелой и легкой цепи, а антигенность пептидного спейсера небольшого размера считается более низкой, чем антигенность целой константной части. Под «гибридным антителом» понимают антитело, в котором константная область тяжелой цепи или константная область легкой цепи, или константные области обеих цепей имеют человеческое происхождение, тогда как вариабельные домены и тяжелой цепи, и легкой цепи являются по своему происхождению не человеческими, а, например, мышиными. Под «гуманизированным антителом» понимают антитело, в котором гипервариабельные области (CDR) являются по своему происхождению не человеческими, а, например, мышиными, тогда как все или по существу все остальные части иммуноглобулина, т.е. константные области и высококонсервативные части вариабельных доменов, например каркасные области, имеют человеческое происхождение. Гуманизированное антитело, однако, может сохранять несколько аминокислот мышиной последовательности в частях каркасных областей, прилежащих к гипервариабельным областям.

Гипервариабельные области могут быть связаны с любого рода каркасным участком, предпочтительно мышиного или человеческого происхождения. Пригодные для этой цели каркасные области описаны Kabat и др. в книге Sequences of proteins of immunological interest (Департамент здравоохранения и социального обеспечения США, Служба общественного здравоохранения, Национальный институт здоровья). Константная часть человеческой тяжелой цепи связывающих молекул предпочтительно относится к типу IgG4, включая субтипы, константная часть человеческой легкой цепи предпочтительно относится к типу κ или λ, но более предпочтительно к типу κ.

Моноклональные антитела к человеческому белку могут быть получены, например, у мышей, но прямым следствием такого способа получения будет то, что ксеногенное антитело при попадании в организм человека вызовет нежелательную иммунную реакцию, которая осуществляется главным образом при участии константной части ксеногенного иммуноглобулина. Такие антитела не могут вводиться в течение длительного времени, что естественным образом ограничивает их применение. Поэтому особенно предпочтительны для применения одноцепочечные антитела, антитела с единственным доменом, гибридные антитела или гуманизированные антитела, которые с низкой вероятностью вызовут существенный аллогенный ответ при введении людям.

В свете всего вышесказанного более предпочтительный вариант связывающих молекул по изобретению выбирают из гибридных антител, которые содержат, по меньшей мере,

а) одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент с (1) вариабельным доменом, включающим последовательно гипервариабельные области CDR1-11С7, CDR2-11С7 и CDR3-11С7, и (2) константной частью тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее фрагментом, где CDR1-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

б) одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент с (1) вариабельным доменом, включающим последовательно гипервариабельные области CDR1'-11С7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11С7, и (2) константной частью человеческой легкой цепи или ее фрагментом, где CDR1'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11С7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 и CDR3'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, или

их прямые эквиваленты.

Альтернативно, связывающие молекулы по изобретению могут представлять собой одноцепочечную связывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий сайт, содержащий

а) первый домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1-11C7, CDR2-11C7 и CDR3-11C7, где CDR1-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, CDR2-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 и CDR3-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, и

б) второй домен, включающий последовательно гипервариабельные области CDR1'-11C7, CDR2'-11C7 и CDR3'-11C7, где CDR1'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, CDR2'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 и CDR3'-11C7 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и

в) линкерный пептид, который связывается или с N-концом первого домена и С-концом второго домена, или с С-концом первого домена и N-концом второго домена; или

их прямые эквиваленты.

Хорошо известно, что минимальные изменения в аминокислотной последовательности, такие как делеции, добавления или замены одной или нескольких аминокислот, могут приводить к образованию аллельных форм исходного белка, которые имеют по существу те же самые свойства. Таким образом, термин «их прямые эквиваленты» означает или любую связывающую молекулу по изобретению с единственным доменом (молекула X),

(1) в которой каждая из гипервариабельных областей CDR1, CDR2 и CDR3 связывающей молекулы по меньшей мере на 50 или 80% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99% гомологична эквивалентным гипервариабельным областям CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9) CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10), тогда как CDR1 эквивалентен CDR1-11C7, CDR2 эквивалентен CDR2-11C7 и CDR3 эквивалентен CDR3-11C7; и

(2) которая способна связываться с NogoA человека, NiG человека, NiG-D20 человека или NogoA_623-640 человека, предпочтительно с константой диссоциации (Kd)<1000 нМ, более предпочтительно с Kd<100 нМ, но наиболее предпочтительно с Kd<10 нМ, или

любую связывающую молекулу по изобретению, имеющую, по меньшей мере, два домена в каждом сайте связывания (молекула X'),

(1) в которой каждая из гипервариабельных областей CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' и CDR3' связывающей молекулы, по меньшей мере, на 50 или 80% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологична, но наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98, 99% гомологична эквивалентным гипервариабельным областям CDR1-11С7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9), CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10), CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13), тогда как CDR1 эквивалентен CDR1-11C7, CDR2 эквивалентен CDR2-11C7, CDR3 эквивалентен CDR3-11C7, CDR1' эквивалентен CDR1'-11C7, CDR2' эквивалентен CDR2'-11C7, CDR3' эквивалентен CDR3'-11C7; и

(2) которая способна связываться с NogoA человека, NiG человека, NiG-D20 человека или NogoA_623-640 человека, предпочтительно с константой диссоциации (Kd)<1000 нМ, более предпочтительно с Kd<100 нМ, но наиболее предпочтительно с Kd<10 нМ.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения в них, например, предлагается связывающая молекула, которая способна связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640 с константой диссоциации <1000 нМ и имеет, по меньшей мере, один антигенсвязывающий сайт, который включает или

- последовательно гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9) и CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10); или

- последовательно гипервариабельные области CDR1', CDR2' и CDR3', каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13).

Кроме того, связывающая молекула способна связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640 с константой диссоциации <1000 нМ и содержит

- первый антигенсвязывающий сайт, содержащий последовательно гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1-11C7 (SEQ ID NO:8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO:9) и CDR3-11C7 (SEQ ID NO:10); и

- второй антигенсвязывающий сайт, содержащий последовательно гипервариабельные области CDR1', CDR2' и CDR3', каждая из которых гомологична, по меньшей мере, на 50%, а предпочтительно на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% соответствующей эквивалентной гипервариабельной области CDR1'-11C7 (SEQ ID NO:11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO:12) и CDR3'-11C7 (SEQ ID NO:13).

Константа диссоциации может быть легко проверена различными методами, включая, например, метод определения аффинности связывания с использованием биосенсора, описанный в Примере 7. Кроме того, связывающий эффект и функционирование связывающих молекул могут быть продемонстрированы в биологической пробе, например, как описано ниже.

Константная часть тяжелой цепи иммуноглобулина человека может быть типа γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, δ или ε, предпочтительно типа γ, но более предпочтительно типа γ4, а константная часть легкой цепи иммуноглобулина человека может быть типа κ или λ (который включает субтипы λ1, λ2 и λ3), но предпочтительно типа κ. Аминокислотные последовательности всех этих константных частей представлены в работе Kabat и др. (см. выше).

Конъюгаты связывающих молекул по изобретению, например, с ферментами, или токсинами, или радиоизотопами также не выходят за пределы сущности и включены в объем притязаний изобретения.

Термин «полипептид», если не указан иной способ действий, относится к любому пептиду или белку, представляющему собой аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями, имеющему аминокислотную последовательность, начинающуюся на N-конце и заканчивающуюся на С-конце. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению - это моноклональное антитело, более предпочтительно гибридное (с вариабельными доменами мышиного происхождения) или гуманизированное (с CDR мышиного происхождения) моноклональное антитело. Гуманизированное моноклональное антитело необязательно имеет мутации, введенные в последовательности каркасных областей (FR) акцепторного антитела.

В контексте настоящего описания термин «функциональное производное полипептида» относится к молекуле, обладающей качественно одинаковой с полипептидом по настоящему изобретению биологической активностью, т.е. способной связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640. Функциональные производные включают фрагменты и пептидные аналоги полипептида в соответствии с настоящим изобретением. Фрагменты включают участки, входящие в состав последовательности полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например, определенной последовательности. Термин «производное» используется для обозначения вариантов аминокислотной последовательности и ковалентных модификаций полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например заданной последовательности. Функциональные производные полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например заданной последовательности, например гипервариабельной области легкой и тяжелой цепи, гомологичны аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, например заданной последовательности, по меньшей мере, примерно на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 85%, но наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95, 96, 97, 98, 99%, и по существу сохраняют способность связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640.

Термин «ковалентная модификация» относится к модификациям полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например заданной последовательности, или его фрагмента с помощью органического белкового или небелкового модифицирующего реагента, к слиянию с гетерологичными полипептидными последовательностями и к посттрансляционным модификациям. Ковалентно модифицированные полипептиды, например, заданной последовательности, сохраняют способность связываться с человеческим NogoA, человеческим NiG, человеческим NiG-D20 или человеческим NogoA_623-640 посредством образования перекрестных сшивок. Ковалентные модификации традиционно вводятся путем осуществления реакции определенных аминокислотных остатков с органическим модифицирующим реагентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми или концевыми остатками, или за счет механизмов посттрансляционных модификаций, которые функционируют в отобранных рекомбинантных клетках-хозяевах. Определенные посттрансляционные модификации являются результатом воздействия рекомбинантных клеток-хозяев на экспрессируемые полипептиды. Глутаминиловые и аспарагиниловые остатки часто подвергаются посттрансляционному дезамидированию в соответствующие глутамиловые и аспартиловые остатки. Альтернативно, эти остатки дезамидируются в слабокислых условиях. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина или лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила, тирозина или треонила, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (см., например, работу Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., Сан-Франциско, 1983, с.79-86). Ковалентные модификации включают, например, слитые гибридные (или химерные) белки, составной частью которых является полипептид в соответствии с настоящим изобретением, например заданная последовательность или варианты этой аминокислотной последовательности, такие как иммуноадгезины, и N-концевые присоединения к гетерологичным сигнальным последовательностям.

«Гомология» в контексте настоящего описания применительно к нативному полипептиду и его функциональному производному определяется как процент аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, которые идентичны остаткам соответствующего нативного полипептида после выравнивания последовательностей и при необходимости заполнения брешей для достижения максимальной процентной гомологии, причем любые консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательностей. Ни N- или С-концевые расширения, ни вставки не будут истолковываться как элементы, снижающие идентичность или гомологию. Методы сравнения и предназначенные для этого компьютерные программы хорошо известны специалистам, работающим в данной области.

Термин «аминокислота(ы)» относится ко всем природным L-α-аминокислотам, например, включая и D-аминокислоты. Для обозначения аминокислот используют хорошо известные одно- и трехбуквенные обозначения.

Термин «вариант аминокислотной последовательности» относится к молекулам с некоторыми отличиями в их аминокислотной последовательности по сравнению с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением, например с заданной последовательностью, которые все же обладают способностью связываться с NogoA человека или NiG человека, но более предпочтительно с NogoA_623-640. Варианты замещения - это те варианты, в которых в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением, например в заданной последовательности, по меньшей мере, один аминокислотный остаток удален, а на его место в том же положении вставлена другая аминокислота. Такие замены могут быть одиночными, когда в молекуле произведена замена только одной аминокислоты, или множественными, когда в одной и той же молекуле произведены замены двух или нескольких аминокислот. Инсерционные варианты представляют собой варианты, в которых в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением, например в заданной последовательности, произведена вставка одной или нескольких аминокислот в положение, непосредственно примыкающее к аминокислоте, находящейся в определенном положении. Непосредственно примыкающее к аминокислоте означает присоединение к функциональной α-карбоксильной или к α-аминогруппе аминокислоты. Делеционные варианты представляют собой варианты, в которых из полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например из заданной последовательности, удалены одна или несколько аминокислот. Обычно в делеционных вариантах произведено удаление одной или нескольких аминокислот в определенной области молекулы.

Связывающая молекула по изобретению может быть изготовлена с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Ввиду этого должны быть сконструированы одна или несколько молекул ДНК, кодирующих связывающую молекулу, далее они должны быть связаны с соответствующими регуляторными последовательностями и перенесены для экспрессии в пригодный для этих целей организм хозяина.

В самых общих чертах соответственно предлагаются:

(1) молекулы ДНК, кодирующие связывающую молекулу по изобретению, имеющую один домен, одноцепочечную связывающую молекулу по изобретению, тяжелую или легкую цепь связывающей молекулы по изобретению или их фрагменты, и

(2) применение молекул ДНК по изобретению для получения связывающей молекулы по изобретению методами рекомбинации.

Современное состояние дел в данной области таково, что при наличии представленной здесь информации квалифицированный специалист может синтезировать молекулы ДНК по изобретению, т.е. аминокислотные последовательности гипервариабельных участков и последовательности ДНК, их кодирующие. Метод конструирования вариабельных доменов гена описан, например, в ЕР 239400 и может быть коротко резюмирован следующим образом: клонируют ген, кодирующий вариабельный домен моноклонального антитела любой специфичности. Определяют сегменты ДНК, кодирующие каркасную часть и гипервариабельные области, и сегменты ДНК, кодирующие гипервариабельные области, удаляют таким образом, чтобы произошло слияние сегментов ДНК, кодирующих каркасные области, с образованием удобных сайтов рестрикции в местах соединения. Эти сайты рестрикции могут быть образованы в определенных положениях стандартными средствами мутагенеза молекулы ДНК. Синтезируют наборы двухцепочечных CDR, имеющие заданные последовательности CDR1-11C7, CDR2-11C7, CDR3-11C7, CDR1'-11C7, CDR2'-11С7 и CDR3'-11C7. Получают фрагменты с липкими концами, посредством которых они могут быть лигированы к каркасной области по стандартному протоколу получения полноразмерной молекулы ДНК, кодирующей вариабельный домен иммуноглобулина.

Кроме того, для получения рекомбинантной ДНК, кодирующей моноклональные антитела по изобретению, наличие доступа к мРНК мкАТ-секретирующей гибридомы не является обязательным. Например, заявка РСТ WO 90/07861 содержит полную инструкцию, достаточную для получения моноклонального антитела с помощью технологии рекомбинантных ДНК при наличии только письменной информации о нуклеотидной последовательности гена.

Метод включает синтез набора олигонуклеотидов, их амплификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и сплайсинг с получением искомой последовательности ДНК.

Векторы экспрессии с удобным промотором или гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи константных частей иммуноглобулинов, общедоступны. Таким образом, стоит только получить молекулу ДНК по изобретению, и она может быть легко перенесена в соответствующий вектор экспрессии.

Молекулы ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, также могут быть получены стандартными методами, например, как описано в WO 88/1649.

В частном варианте осуществления настоящего изобретения средства рекомбинантной технологии, используемые для получения некоторых из связывающих молекул по изобретению, включают конструирование первой и второй рекомбинантных ДНК, как описано ниже:

Первая рекомбинантная ДНК кодирует тяжелую цепь или ее фрагмент и содержит:

(а) первую часть, которая кодирует вариабельный домен, включающий чередующиеся каркасные и гипервариабельные области, причем гипервариабельные области представляют собой последовательно ДНК-CDR1-11С7 (SEQ ID NO:15), ДНК-СDR2-11С7 (SEQ ID NO:16) и ДНК-СDR3-11С7 (SEQ ID NO:17); эта первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

(б) вторую часть, кодирующую тяжелую цепь константной части или ее фрагмента, которая начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части тяжелой цепи, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части или ее фрагмента, за которой следует несмысловой (некодирующий) кодон.

Вторая часть предпочтительно кодирует константную часть тяжелой цепи иммуноглобулина человека, более предпочтительно константную часть γ4 цепи иммуноглобулина человека. Вторая часть может быть фрагментом геномной ДНК (включающая интроны) или фрагментом кДНК (без интронов).

Вторая рекомбинантная ДНК кодирует легкую цепь или ее фрагмент и содержит:

(а) первую часть, которая кодирует вариабельный домен, содержащий чередующиеся каркасные и гипервариабельные области, причем гипервариабельные области представляют собой последовательно ДНК-CDR1'-11C7(SEQ ID NO:17), ДНК-CDR2'-11C7(SEQ ID NO:18) и ДНК-СDR3'-11С7 (SEQ ID NO:19); эта первая часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту вариабельного домена, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту вариабельного домена, и

(б) вторую часть, кодирующую легкую цепь константной части или ее фрагмента, которая начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту константной части легкой цепи и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту константной части или ее фрагмента, за которой следует некодирующий кодон.

Вторая часть предпочтительно кодирует константную часть легкой цепи иммуноглобулина человека, более предпочтительно константную часть к цепи иммуноглобулина человека.

Первая или вторая рекомбинантная ДНК предпочтительно имеют третью часть, которая расположена до первой части и кодирует часть лидерного пептида; эта третья часть начинается с кодона, кодирующего первую аминокислоту лидерного пептида, и заканчивается кодоном, кодирующим последнюю аминокислоту лидерного пептида. Этот пептид требуется для секреции цепей организмом хозяина, в котором они экспрессируются, после чего пептид удаляется организмом хозяина. Предпочтительно третья часть первой рекомбинантной ДНК кодирует лидерный пептид, аминокислотная последовательность которого по существу идентична аминокислотной последовательности лидерного пептида тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO:21 (начиная с аминокислоты в положении - 19 и заканчивая аминокислотой в положении - 1). Также предпочтительно, чтобы третья часть второй рекомбинантной ДНК кодировала лидерный пептид, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:23 (легкая цепь, начинающаяся с аминокислоты в положении - 18 и заканчивающаяся аминокислотой в положении - 1).

Каждая из рекомбинантных молекул ДНК помещается под контроль подходящих регуляторных последовательностей, в частности под контроль удобного промотора. Может быть использован любой промотор при условии, что он адаптирован к организму хозяина, в который будет перенесена рекомбинантная ДНК для экспрессии. Однако, если предполагается экспрессия в клетке млекопитающего, особенно предпочтительно использовать промотор гена иммуноглобулина.

Искомое антитело может быть получено в культуре клеток или в трансгенном животном. Пригодное для этих целей трансгенное животное может быть получено с помощью стандартных методов, которые включают микроинъекции в яйцеклетки первых и вторых рекомбинантных ДНК, помещенных под контроль пригодных для этой цели регуляторных последовательностей, перенос таким образом полученных яйцеклеток подходящим псевдобеременным самкам и отбор потомства, экспрессирующего искомые антитела.

Если предполагается получение антительных цепей в клеточной культуре, рекомбинантные ДНК должны быть сначала вставлены или в один вектор экспрессии, или в два различных, но совместимых вектора экспрессии, причем последний вариант является предпочтительным.

Соответственно в изобретении также предлагается вектор экспрессии, способный к репликации в прокариотической или эукариотической клетке и несущий, по меньшей мере, одну из рекомбинантных ДНК, описанных выше.

Каждый вектор экспрессии, содержащий рекомбинантную ДНК, затем переносят в пригодный для этой цели хозяйский организм. Когда рекомбинантные ДНК раздельно вставляются в два вектора экспрессии, они могут быть перенесены раздельно, т.е. каждая клетка содержит вектор одного типа, или совместно, причем последний вариант является предпочтительным. Организмом хозяина может быть бактериальная клетка, дрожжевая клетка или линия клеток млекопитающего, причем последний вариант является предпочтительным. Более предпочтительно, если клетки млекопитающего имеют лимфоидное происхождение, например клетки миеломы, гибридомы или нормальные перевиваемые В-клетки, если в них не экспрессируются тяжелые или легкие цепи эндогенных антител.

Также предпочтительно, чтобы клетка организма хозяина содержала большое количество копий вектора. Если в качестве организма хозяина используется клетка млекопитающего, эта цель может быть достигнута за счет повышения копийности стандартными средствами. Методы амплификации обычно включают селекцию по признаку повышенной резистентности к лекарственному веществу, если резистентность кодируется вектором экспрессии.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения многоцепочечных связывающих молекул по изобретению, который включает (1) культивирование организма, который трансформируется первой и второй рекомбинантной ДНК по изобретению и (2) выделение из культуры активных связывающих молекул по изобретению.

Альтернативно, тяжелые и легкие цепи могут быть выделены раздельно и восстановлены в активную связывающую молекулу в результате рефолдинга in vitro. Методы восстановления хорошо известны специалистам, работающим в этой области. Примеры мет