Способ получения основного вещества
Патент 2350655
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Способ получения основного вещества
Иллюстрации
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-лизина или L-аргинина ферментацией, который включает культивирование бактерии, обладающей способностью продуцировать основную аминокислоту в жидкой среде, находящейся в ферментере, для продуцирования и аккумулирования основной аминокислоты в среде, где количество ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов основной аминокислоты, уменьшают, регулируя концентрацию общего аммиака в среде в течение периода времени, выбранного из группы, состоящей из периода, в течение которого значение рН среды увеличивается вследствие недостатка противоионов основной аминокислоты, вызываемого аккумулированием основных аминокислот, и периода времени, в течение которого значение рН увеличивается в результате добавления катионов в среду, при этом концентрация ионов аммония в среде находится на таком уровне, при котором сумма ионных эквивалентов ионов бикарбоната и/или карбоната и других анионов, растворенных в среде, больше ионного эквивалента основной аминокислоты, ионизированной из основной аминокислоты, аккумулированной в среде, и где указанная концентрация общего аммиака в среде находится на уровне, не ингибирующем продуцирование основной аминокислоты бактерией, которую определяют заранее. Изобретение позволяет получать L-лизин или L-аргинин с высокой степенью эффективности. 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл.
Реферат
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу промышленного применения микроорганизмов, в частности к способу получения основного вещества ферментацией. В качестве основных веществ, получаемых ферментацией, можно указать, например, L-лизин, используемый в виде добавки в корм для животных, L-аргинин и L-гистидин, используемые для приготовления фармацевтических препаратов, таких как препараты для инфузий.
Уровень техники
Способы получения основных веществ ферментацией предполагают культивирование микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать и аккумулировать основное вещество в среде, из которой указанное основное вещество затем собирают. При осуществлении таких способов культивирование выполняют в виде периодического культивирования, культивирования с подпиткой или непрерывного культивирования.
В процессе получения основных веществ ферментацией в среду обычно добавляют ионы сульфата или хлорида в качестве противоанионов для целевого вещества, которые диссоциируют в среде в катионы для сохранения рН среды на нейтральном уровне (выложенные патенты Японии (Kokai) № 5-30985 и 5-244969).
Во многих случаях, когда необходимо произвести очистку вещества, основные вещества собирают из среды путем ионного обмена. Например, при получении L-лизина ферментационный бульон слегка подкисляют, L-лизин адсорбируют на ионообменной смоле и элюируют из смолы при помощи ионов аммония. Элюированный L-лизин используют в виде основного лизина или кристаллизуют хлористоводородной кислотой с образованием гидрохлорида L-лизина.
При введении в среду ионов хлорида в качестве противоанионов вышеуказанную очистку L-лизина или гидрохлорида L-лизина можно производить путем концентрирования среды. Однако, поскольку ионы хлорида вызывают коррозию металлических ферментеров и другого оборудования, в процессе производства нежелательно использовать высококонцентрированные среды.
С другой стороны, в тех случаях, когда основное вещество не подвергают очистке, ферментационный бульон концентрируют в том виде, как есть, или слегка подкисляют хлористоводородной или серной кислотой и затем гранулируют распылением. В данном случае остаточные компоненты содержат противоанионы, добавленные в среду, вследствие чего сокращается количество основного вещества в полученном продукте ферментации.
В выложенном патенте Японии № 2002-65287 (заявка на патент США № 2002/025564) описан способ применения в процессе ферментации основной аминокислоты ионов карбоната и бикарбоната в качестве противоанионов основной аминокислоты для замены части ионов сульфата или хлорида. Ионы карбоната или бикарбоната можно сравнительно легко удалить из культуральной среды, делая показатель рН среды кислым или концентрируя среду либо тем и другим способами вместе. В вышеуказанной публикации описан способ создания положительного внутреннего давления в ферментере во время ферментации или введения в среду газообразного диоксида углерода или газовой смеси, содержащей диоксид углерода, для добавления в среду ионов карбоната и бикарбоната. Однако в стандартных условиях культивирования при нейтральном показателе рН в среде растворяется лишь небольшое количество доксида углерода, если такое растворение вообще имеет место. Поэтому для введения в культуральную среду ионов бикарбоната и карбоната и уменьшения концентрации ионов сульфата или хлорида культивирование необходимо производить при щелочном показателе рН. Однако при высоком значении рН скорость роста бактерий и продуцирование целевого вещества обычно уменьшаются.
Описание изобретения
Объектом настоящего изобретения является способ уменьшения ионов сульфата и хлорида, эффективного продуцирования целевого вещества путем ферментации с использованием микроорганизма, обладающего способностью продуцировать целевое основное вещество, и использования ионов карбоната и бикарбоната в качестве противоанионов основного вещества без снижения скорости роста микроорганизма или уменьшения продуцирования целевого вещества.
При использовании коринеформных бактерий или бактерий Escherichia для получения основных веществ ферментацией скорость роста бактерий или продуцирование целевого вещества обычно уменьшаются при слишком высоком значении рН. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что основным фактором, вызывающим данное явление, является аммиак, который добавляют в среду в качестве источника азота для продуцирования основного вещества, роста бактерий или в качестве источника противоионов основного вещества, причем скорость роста микроорганизма или продуцирование целевого вещества в условиях высокого значения рН можно сохранить на должном уровне, контролируя концентрацию общего аммиака при выполнении ферментации в пределах приемлемого диапазона концентраций.
Настоящее изобретение создано на основе вышеуказанных открытий.
Таким образом, предметом настоящего изобретения являются нижеследующие способы.
(1) Способ продуцирования основного вещества ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать данное основное вещество в жидкой среде, находящейся в ферментере, и аккумулировать основное вещество в среде, при этом количество ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов основного вещества, уменьшают, регулируя концентрацию общего аммиака в среде в определенном диапазоне концентраций в течение по крайней мере части всего периода культивирования.
(2) Способ по п.(1), в котором определенный диапазон концентраций общего аммиака находится в пределах, удовлетворяющих следующим условиям:
(А) концентрация ионов аммония в среде находится на таком уровне, при котором сумма ионных эквивалентов ионов бикарбоната и/или карбоната и других анионов, растворенных в среде, больше ионного эквивалента основного вещества, ионизированного из основного вещества, аккумулированного в среде; и
(В) концентрация общего аммиака в среде находится на уровне, не ингибирующем продуцирование микроорганизмом основного вещества, который определяют заранее следующим образом:
микроорганизм культивируют в среде с разными значениями рН и разными концентрациями общего аммиака, измеряют продуцирование основного вещества при каждом значении рН и каждой концентрации общего аммиака и для каждого значения рН определяют концентрацию общего аммиака, обеспечивающую 50% или более высокое продуцирование основного вещества на основании продуцирования, достигаемого в оптимальных условиях.
(3) Способ по п.(1), в котором определенный диапазон концентраций общего аммиака определяют заранее следующим образом:
(А') культивирование выполняют в среде, содержащей ионы сульфата и/или хлорида в качестве источника противоионов целевого основного вещества, в количестве, достаточном для культивирования при значении рН, равном 7,2 или ниже, при этом значение рН сохраняют в пределах от 6,5 до 7,2, добавляя по крайней мере одно из нижеследующих веществ, включающих газообразный аммиак, водный раствор аммиака и мочевину, и измеряют продуцирование основного вещества;
(B') культивирование начинают в среде, аналогичной применяемой на стадии (А'), за исключением того, что количество ионов сульфата и/или хлорида компонентов среды уменьшают на требуемую величину, и продолжают культивирование при разных концентрациях общего аммиака в течение периода времени, когда становится невозможно сохранять значение рН среды равным 7,2 или ниже вследствие недостатка ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов основного вещества, вызываемого аккумулированием целевого основного вещества, определяя таким образом диапазон концентраций общего аммиака, обеспечивающих 50% или более высокое продуцирование на основании продуцирования, измеренной на стадии (А').
(4) Способ по п.(1), в котором по крайней мере часть общего периода времени включает по крайней мере один период, в течение которого значение рН среды увеличивается вследствие недостатка противоионов, вызываемого аккумулированием целевого основного вещества, и период времени, в течение которого значение рН увеличивается в результате добавления катионов в среду.
(5) Способ по п.(1), в котором концентрацию общего аммиака в среде регулируют, добавляя в среду аммиак или мочевину при снижении или отсутствии активности микроорганизма, определяемой на основании таких индикаторов, как концентрация растворенного кислорода в среде, скорость потребления источника углерода в среде, помутнение среды, продуцирование основного вещества и изменение значения рН в среде.
(6) Способ по п.(1), в котором использована среда, имеющая такой же состав, что и среда, содержащая ионы сульфата и/или хлорида в качестве источника противоионов основного вещества в количестве, достаточном для культивирования при значении рН, равном 7,2 или ниже, за исключением того, что количество ионов сульфата и/или хлорида уменьшено на требуемую величину; и
по крайней мере часть общего периода времени является периодом, когда значение рН среды не может быть сохранено равным 7,2 или ниже вследствие недостатка противоионов для основного вещества, аккумулированного в среде.
(7) Способ по п.(2), в котором другие анионы выбирают из ионов сульфата, ионов хлорида, ионов фосфата и ионизированных органических кислот.
(8) Способ по п.(2) или (7), в котором общее количество других анионов равно 900 мэкв/л или меньше.
(9) Способ по п.(1), в котором концентрацию общего аммиака в среде доводят до 200 мМ или меньше.
(10) Способ по п.(1), который включает стадию пролиферации микроорганизма.
(11) Способ по п.(10), в котором концентрацию общего аммиака не регулируют на стадии пролиферации микроорганизма.
(12) Способ по п.(1), в котором основное вещество выбирают из L-лизина, L-аргинина и L-гистидина.
(13) Способ по п.(12), в котором основное вещество является L-лизином.
(14) Способ по п.(12), в котором основное вещество является L-аргинином.
(15) Способ по п.(1), в котором среду или полученный продукт нагревают после ферментации для удаления ионов бикарбоната и карбоната.
(16) Способ по п.(1), в котором микроорганизм является коринеформной бактерией или бактерией Escherichia.
(17) Ферментационный бульон или продукт ферментации, содержащий основное вещество, полученное способом по п.(15).
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 показаны результаты культивирования с целью продуцирования L-лизина, выполненного с использованием стандартной питательной среды и способа культивирования.
На Фиг.2 показаны результаты культивирования с целью продуцирования L-лизина, выполненного в среде с ограниченной концентрацией аммония.
На Фиг.3 показаны результаты культивирования с целью продуцирования L-лизина, которое выполняли, контролируя только концентрацию общего аммиака и не регулируя значение рН.
На Фиг.4 показаны изменения концентрации общего аммиака и значения рН с течением времени в стандартной питательной среде и в среде без сульфата аммония и хлорида аммония.
На Фиг.5 показаны изменения роста, концентрации общего аммиака, значения рН и оставшегося количества сахара с течением времени в процессе ферментации L-аргинина в среде с ограниченной концентрацией аммония.
На Фиг.6 показаны результаты культивирования с целью продуцирования L-аргинина в среде с ограниченной концентрацией аммония.
Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Ниже приведено подробное описание настоящего изобретения.
Способ по настоящему изобретению представляет собой способ получения основного вещества ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, способного продуцировать основное вещество в жидкой среде, находящейся в ферментере, для получения и аккумулирования основного вещества в указанной среде. Способ по настоящему изобретению отличается тем, что количество ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов основного вещества, уменьшают путем регулирования концентрации аммиака в среде в определенном диапазоне концентраций в течение по крайней мере части всего процесса культивирования. То есть способ по настоящему изобретению является способом получения основного вещества в среде с меньшим содержанием ионов сульфата и хлорида, достигаемым в результате регулирования концентрации общего аммиака, используемого в качестве источника азота, в пределах, необходимых для роста микроорганизма или продуцирования целевого вещества и не ингибирующих рост микроорганизма или продуцирование целевого вещества.
Примеры конкретного диапазона концентраций общего аммиака включают диапазон, удовлетворяющий нижеследующим условиям:
(А) концентрация ионов аммония в среде находится на таком уровне, при котором сумма ионных эквивалентов ионов бикарбоната и/или карбоната и других анионов, растворенных в среде, больше ионного эквивалента основного вещества, ионизированного из основного вещества, аккумулированного в среде; и
(В) концентрация общего аммиака в среде находится на уровне, не ингибирующем продуцирование микроорганизмом основного вещества, который определяют заранее следующим образом:
микроорганизм культивируют в среде с разными значениями рН и разными концентрациями общего аммиака, измеряют продуцирование основного вещества при каждом значении рН и каждой концентрации общего аммиака и для каждого значения рН определяют концентрацию общего аммиака, обеспечивающую 50% или более высокое продуцирование основного вещества на основании продуцирования, достигаемого в оптимальных условиях.
Кроме того, в другом варианте осуществления настоящего изобретения конкретный диапазон концентраций общего аммиака определяют заранее следующим образом.
(А') (Способ 1. Оценка результатов ферментации в нейтральных условиях).
Культивирование выполняют в среде, содержащей ионы сульфата и/или хлорида в качестве источника противоионов целевого основного вещества, в количестве, достаточном для культивирования при значении рН, равном 7,2 или ниже, при этом значение рН сохраняют в пределах от 6,5 до 7,2, добавляя по крайней мере одно из нижеследующих веществ, включающих газообразный аммиак, водный раствор аммиака и мочевину, и измеряют продуцирование основного вещества.
(B') (Способ 2. Оценка результатов ферментации с меньшим количеством ионов сульфата и хлорида при разных концентрациях аммония).
Культивирование начинают в среде, аналогичной применяемой в вышеописанном способе 1 (стадия А'), за исключением того, что количество ионов сульфата и/или хлорида компонентов среды уменьшают на требуемую величину, и продолжают культивирование при разных концентрациях общего аммиака в течение периода времени, когда становится невозможно сохранять значение рН среды равным 7,2 или ниже вследствие недостатка ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов основного вещества, вызываемого аккумулированием целевого основного вещества, определяя таким образом диапазон концентраций общего аммиака, обеспечивающих 50% или более высокое продуцирование на основании продуцирования, измеренного на стадии (А').
Кроме того, в другом варианте осуществления настоящего изобретения, когда конкретный диапазон концентраций общего аммиака не определен заранее, концентрацию общего аммиака можно отрегулировать в пределах предварительно определенного диапазона. В частности, концентрацию общего аммиака в среде регулируют, добавляя аммиак или мочевину в среду при снижении или отсутствии активности микроорганизма, определяемой на основании таких индикаторов, как концентрация растворенного кислорода в среде, скорость потребления источника азота, помутнение среды, продуцирование основного вещества и изменение значения рН. Указанная среда имеет такой же состав, что и среда, содержащая ионы сульфата и/или хлорида в качестве источника противоионов основного вещества в количестве, достаточном для культивирования при рН, равном 7,2 или ниже, за исключением того, что количество ионов сульфата и/или хлорида уменьшено на требуемую величину. Примеры по крайней мере части общего периода времени включают период, когда невозможно сохранить значение рН среды равным 7,2 или ниже вследствие недостатка противоионов для основного вещества, аккумулированного в среде.
Примеры других анионов включают ионы хлорида, ионы сульфата, ионы фосфата, ионы органических кислот (уксусной кислоты, молочной кислоты, янтарной кислоты и т.д.) и тому подобные. Кроме того, ионы бикарбоната и/или карбоната, растворенные в среде, действуют в качестве противоанионов основного вещества.
В настоящем изобретении ионный эквивалент является значением, полученным в результате умножения молярной концентрации каждого иона на валентность иона, которое выражено в единицах экв/л. То есть ионный эквивалент 1 мМ одновалентного иона равен 1 мэкв/л и ионный эквивалент 1 мМ двухвалентного иона равен 2 мэкв/л.
Вышеуказанную концентрацию общего аммиака регулируют с тем, чтобы общее количество аммиака в среде соответствовало количеству, необходимому для роста микроорганизма или продуцирования основного вещества, и не ингибировало продуцирование основного вещества микроорганизмом, поэтому показатель рН среды автоматически доводят до значения, пригодного для растворения ионов бикарбоната и/или карбоната, используемых в качестве противоанионов основного вещества.
В настоящем изобретении термин "общий аммиак" означает сумму недиссоциированного аммиака (NH3) и ионов аммония (NH4 +). При регулировании концентрации общего аммиака можно измерить недиссоциированный аммиак или ионы аммония либо те и другие вместе.
В среду обычно добавляют сульфат аммония и хлорид аммония в качестве источников противоанионов основного вещества и источника азота в целом. Кроме того, так как для регулирования значения рН среды обычно используют аммиак и мочевину, в среде имеет место высокая концентрация аммиака и ионов аммония. При уменьшении количества сульфата аммония или хлорида аммония для сокращения количества ионов сульфата или хлорида, добавляемых в среду, источник азота, такого как аммиак, пополняют в количестве, соответствующем уменьшаемому количеству. Для выполнения данной операции необходим способ введения аммиака, который должен учитывать баланс между катионами, включающими катионы, продуцируемые бактериями, количество которых увеличивается в процессе культивирования с образованием целевого основного вещества, катионы, ионизируемые из добавляемого аммиака, катионы, добавляемые в среду, такие как катионы натрия и калия, и тому подобные, и анионами, количество которых увеличивается в среде в результате дыхания бактерий или добавления в среду. При нарушении указанного баланса ферментация не будет увеличиваться, так как концентрация аммиака или значение рН станут чрезмерно высокими или, наоборот, аммиака окажется слишком мало. Созданный в соответствии с настоящим изобретением способ добавления аммиака для регулирования концентрации общего аммиака в пределах определенного диапазона позволяет эффективно сохранять вышеуказанный баланс между катионами и анионами, поэтому благоприятный рост микроорганизма и эффективное образование основного вещества могут происходить даже в условиях уменьшения количества ионов сульфата и хлорида.
Концентрацию общего аммиака в среде регулируют путем добавления в среду по крайней мере одного нижеследующего вещества, включающего газообразный аммиак, раствор аммиака и мочевину, с таким расчетом, чтобы концентрация общего аммиака в среде находилась на приемлемом уровне. Кроме того, можно также добавлять соль аммония, такую как хлорид аммония или сульфат аммония, если она не ухудшает эффект, достигаемый настоящим изобретением. Можно также использовать соль аммония, содержащую ион бикарбоната или карбоната в качестве противоиона, которую можно легко удалить в виде газа после окончания культивирования. Концентрацию общего аммиака можно регулировать, используя в качестве индикатора измеренные значения концентрации иона аммония или аммиака в среде или выделяемого газа. Кроме того, концентрацию общего аммиака можно отрегулировать путем предварительного определения значения рН, обеспечивающего приемлемую концентрацию общего аммиака, при регулировании рН с помощью аммиака, и добавлять аммиак до достижения такого значения рН. В данном случае значение рН, определенное вышеописанным способом, при необходимости можно изменить во время культивирования.
Концентрацию общего аммиака в среде можно также отрегулировать, добавляя в среду аммиак или мочевину при уменьшении или отсутствии активности микроорганизма, определяемой на основании таких индикаторов, как концентрация растворенного кислорода в среде, скорость потребления источника углерода в среде, помутнение среды, продуцирование основного вещества и изменение значения рН в среде. То есть при сокращении или истощении источника азота в среде уменьшается или прекращается пролиферация микроорганизма или активность микроорганизма, такая как продуцирование целевого вещества. Активность микроорганизма обычно проявляется в потреблении растворенного кислорода и источника углерода в среде, увеличении мутности среды, сокращении продуцирования целевого вещества и уменьшении значения рН среды вследствие потребления аммиака или высвобождения диоксида углерода в результате дыхания. Таким образом, в случае уменьшения или прекращения активности микроорганизма концентрация растворенного кислорода в среде увеличивается при постоянной скорости аэрации и перемешивания в единицу времени, при этом значение рН среды возрастает вследствие меньшего потребления аммиака и секреции диоксида углерода. Кроме того, уменьшается скорость потребления источника углерода, замедляется помутнение среды и продуцирование целевого вещества. Поэтому сокращение активности микроорганизма, определяемой на основании вышеуказанных индикаторов в условиях достаточного количества других компонентов в среде помимо источника азота, свидетельствует об недостаточном источнике азота или его полном истощении. В таком случае в среду добавляют аммиак или мочевину в количестве, необходимом для роста микроорганизма или продуцирования целевого вещества. В результате повторного выполнения данной операции общая концентрация аммиака в среде сохраняется в пределах определенного диапазона. Если культивирование выполняют с добавлением мочевины в среду, при потреблении микроорганизмом мочевины в среду высвобождается аммиак. При повторном добавлении аммиака или мочевины в соответствии с вышеизложенным показатель рН среды постепенно увеличивается. Количество аммиака или мочевины, добавляемое в каждый период времени, может составлять, например, 300 мМ, предпочтительно 200 мМ, более предпочтительно 100 мМ, в виде конечной концентрации общего аммиака в среде. Альтернативно аммиак или мочевину можно добавлять так, чтобы значение рН после добавления аммиака или мочевины увеличивалось на 0,3 или меньше, предпочтительно на 0,15 или меньше, более предпочтительно на 0,1 или меньше.
Концентрацию растворенного кислорода в среде можно измерить, например, при помощи электрода для растворенного кислорода.
То, что сумма ионных эквивалентов ионов бикарбоната и/или карбоната и других анионов, растворенных в среде, выше ионного эквивалента основного вещества, аккумулированного в среде, можно определить путем измерения концентраций ионов бикарбоната, ионов карбоната и других анионов, а также концентрации основного вещества. Кроме того, вышеуказанные условия могут быть также удовлетворены в результате выполнения предварительного эксперимента с целью определения значения рН и/или дополнительного количества аммиака, соответствующего указанным условиям, и осуществления культивирования при заранее определенном значении рН и/или добавлении заранее определенного количества аммиака.
В настоящем изобретении значение рН культуры может быть постоянным или непостоянным. Кроме того, значения рН среды можно регулировать, используя сам показатель рН в качестве индикатора, или косвенным путем, контролируя концентрацию общего аммиака, не прибегая к прямому регулированию значения рН. При добавлении аммиака или мочевины, когда индикатором служит активность микроорганизма в соответствии с приведенным выше описанием, концентрацию общего аммиака в среде регулируют так, чтобы данный показатель находился в пределах приемлемого диапазона концентраций, при этом значение рН постепенно увеличивается по мере аккумулирования основного вещества. Если в процессе культивирования концентрацию общего аммиака регулируют в пределах определенного диапазона, значение рН изменяется в результате изменения баланса аккумулирования разных катионов и анионов в среде. Независимо от выбранного способа концентрация общего аммиака в среде остается в пределах определенного диапазона концентраций, что позволяет сократить количество ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов основного вещества.
В настоящем изобретении выражение "не ингибирующий продуцирование основного вещества" означает, что созданы благоприятные условия для роста микроорганизма по настоящему изобретению и продуцирования основного вещества. В том случае, если рост микроорганизма является недостаточным или не достигается эффективное продуцирование основного вещества несмотря на благоприятный рост микроорганизма, считается, что имеет место ингибирование продуцирования основного вещества.
В частности, микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, культивируют при разных значениях рН и концентрациях общего аммиака в среде, измеряя продуцирование основного вещества, аккумулируемого в среде, при этом концентрации общего аммиака, которые обеспечивают продуцирование основного вещества на уровне, равном предпочтительно 50% или выше, более предпочтительно 70% или выше, особенно предпочтительно 90% или выше, по сравнению с количеством основного вещества, получаемого в оптимальных условиях, например, в стандартных условиях с нейтральным значением рН, считаются концентрациями, "не ингибирующими продуцирование основного вещества". В настоящем изобретении термин "продуцирование" означает выход продукта, скорость продуцирования или общее продуцированное количество. Термин "выход" означает количество продуцированного основного вещества в расчете на источник углерода, присутствующий в среде, который может потребляться микроорганизмом, и термин "скорость продуцирования" означает количество продукта, продуцируемого в единицу времени. Кроме того, когда термин "количество продукта" или "продуцированное количество" используется отдельно, он означает количество основного вещества, аккумулированного в среде, после полного потребления источника углерода.
Альтернативно микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, культивируют в оптимальных условиях, например, в стандартных условиях с нейтральным значением рН, и измеряют продуцирование основного вещества, аккумулированного в среде. Тогда культивирование осуществляют в среде, имеющей такой же состав, за исключением того, что количество ионов сульфата и/или хлорида уменьшают на требуемую величину, и измеряют продуцирование основного вещества. В данном случае имеет место период, когда значение рН среды увеличивается вследствие недостатка ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов, по мере аккумулирования целевого основного вещества. В течение указанного периода культивирование выполняют при сохранении концентрации общего аммиака в пределах определенного диапазона концентраций. Что касается диапазона, в пределах которого контролируют концентрацию, то культивирование выполняют при разных концентрациях в диапазоне от 1 до 500 мМ, при этом концентрации, обеспечивающие продуцирование основного вещества на уровне, равном предпочтительно 50% или выше, более предпочтительно 70% или выше, особенно предпочтительно 90% или выше, по сравнению с продуцированием, достигаемым в оптимальных условиях, определяются как концентрации, "не ингибирующие продуцирование основного вещества". Примеры среды, используемой для создания вышеуказанных "стандартных условий с нейтральным значением рН", включают среду, содержащую ионы сульфата и/или хлорида в количестве, достаточном для культивирования при значении рН 7,2 или ниже.
Требуемое уменьшение количества ионов сульфата и/или хлорида не имеет конкретных ограничений, если достигается необходимое продуцирование основного вещества.
Концентрацию общего аммиака, определяемую как "не ингибирующая продуцирование основного вещества", можно также охарактеризовать, например, следующим образом. Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, культивируют при разных значениях рН и концентрациях общего аммиака в среде, измеряя при этом количество основного вещества, аккумулируемого в среде. Аккумулированное количество основного вещества, получаемое в разных условиях, сравнивают с количеством, аккумулированным в оптимальных условиях. Таким образом можно определить концентрацию общего аммиака, которая не ингибирует продуцирование основного вещества. Оптимальные условия определяются как условия культивирования с использованием достаточного количества противоионов при нейтральном значении рН, как это имеет место в стандартных условиях с нейтральным значением рН.
Кроме того, существует другой способ определения концентрации общего аммиака, определяемой как "не ингибирующая продуцирование основного вещества". Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, культивируют в оптимальных условиях, например, в стандартных условиях с нейтральным значением рН, измеряя при этом продуцирование основного вещества, аккумулируемого в среде. Культивирование выполняют в среде, имеющей такой же состав, за исключением того, что количество ионов сульфата и/или хлорида уменьшают на требуемую величину, и контролируют продуцирование. В данном случае имеет место период, когда значение рН среды увеличивается вследствие недостатка ионов сульфата и/или хлорида, используемых в качестве противоионов, по мере аккумулирования целевого основного вещества. В течение указанного периода культивирование выполняют при сохранении концентрации общего аммиака в пределах определенного диапазона концентраций. Что касается диапазона регулирования концентраций, то культивирование выполняют при разных концентрациях в пределах от 1 до 500 мМ и продуцирование основного вещества сравнивают с аналогичным показателем, достигаемым в оптимальных условиях.
Концентрация, определяемая как "не ингибирующая продуцирование основного вещества" включает, например, концентрацию, которая обеспечивает продуцирование основного вещества на уровне, равном предпочтительно 50% или выше, более предпочтительно 70% или выше, особенно предпочтительно 90% или выше, по сравнению с продуцированием основного вещества в оптимальных условиях. В частности, концентрация общего аммиака в среде, например, составляет предпочтительно 300 мМ или меньше, более предпочтительно 200 мМ или меньше, особенно предпочтительно 100 мМ или меньше. Степень диссоциации аммиака уменьшается при увеличении значения рН. Недиссоциированный аммиак является более токсичным для бактерий, чем ионы аммония. Поэтому верхний предел концентрации общего аммиака зависит также от значения рН среды. То есть по мере увеличения значения рН среды приемлемая концентрация общего аммиака становится ниже. Что касается вышеуказанной концентрации общего аммиака, определяемой как "не ингибирующая продуцирование основного вещества", то диапазон концентраций общего аммиака, приемлемый для самого высокого значения рН во время культивирования, можно рассматривать как диапазон концентраций общего аммиака на протяжении всего культивирования.
С другой стороны, общая концентрация аммиака, используемого в качестве источника азота, необходимого для роста микроорганизма и продуцирования основного вещества, не имеет конкретных ограничений до тех пор, пока продуцирование целевого вещества микроорганизмом не уменьшается вследствие недостатка азота в процессе культивирования, и может быть определена соответствующим образом. Например, концентрацию аммиака измеряют в процессе культивирования и при отсутствии аммиака в среде добавляют в среду небольшое количество аммиака. Хотя концентрация аммиака после его добавления не имеет конкретных ограничений, желательно, чтобы указанная концентрация была равна предпочтительно 1 мМ или выше, более предпочтительно 5 мМ или выше, особенно предпочтительно 10 мМ или выше в расчете на концентрацию общего аммиака.
Способ по настоящему изобретению может включать стадию культивирования, предназначенную для пролиферации микроорганизма, обладающего способностью продуцировать основное вещество, и стадию культивирования, предназначенную главным образом для продуцирования микроорганизмом основного вещества. Кроме того, в способе по настоящему изобретению пролиферация микроорганизма и продуцирование основного вещества могут происходить параллельно. Помимо вышеописанного культивирования, которое может быть также названо основной ферментацией, основным культивированием или тому подобным, независимо может быть выполнено предварительное культивирование.
В настоящем изобретении помимо регулирования концентрации общего аммиака в среде вышеописанным способом может быть выполнена операция, облегчающая растворение ионов бикарбоната и/или карбоната в среде. Примеры такой операции включают создание положительного давления в ферментере во время культивирования в результате введения в среду газообразного диоксида углерода или газовой смеси, содержащей газообразный диоксид углерода, ограничение аэрации в ферментере, благодаря чему ионы бикарбоната и/или карбоната растворяются в среде, увеличение значения рН среды путем добавления в среду катионов, отличных от ионов аммония, таких как ионы натрия, ионы калия и тому подобные.
Для создания положительного давления в ферментере, например, можно повысить давление воздуха, подаваемого в ферментер, по сравнению с давлением отходящего газа. В результате повышения давления в ферментере газообразный диоксид углерода, образующийся в процессе ферментации, растворяется в культуральной среде и образует ионы бикарбоната или карбоната. В частности, давление в ферментере может быть равно 0,13-0,3 МПа, предпочтительно 0,15-0,25 МПа.
Кроме того, газообразный диоксид углерода можно растворить в культуральной среде путем введения в среду газообразного диоксида углерода или газовой смеси, содержащей газообразный диоксид углерода. Альтернативно газообразный диоксид углерода, образующийся в процессе ферментации, может также растворяться в среде при ограничении аэрации ферментера. Приемлемую скорость аэрации можно определить, например, измеряя количество ионов бикарбоната или карбоната в среде или измеряя значение рН и концентрацию аммиака в среде. При введении в среду газообразного диоксида углерода, например, чистого газообразного диоксида углерода или газовой смеси, содержащей газообразный диоксид углерода в количестве 5 об.% или больше, газ можно барботировать в среду. Вышеуказанные способы растворения ионов бикарбоната и/или карбоната в среде могут быть использованы независимо или в виде комбинации двух или более способов.
Операцию регулирования концентрации общего аммиака в среде и операцию облегчения растворения ионов бикароната и/или карбоната в среде при необходимости можно выполнять в течение по крайней мере части общего периода времени процесса культивирования.
Хотя время, определяемое выражением "по крайней мере часть общего периода времени", не имеет каких-либо конкретных ограничений, пока достигается требуемое продуцирование, оно может составлять, например, 1/10 или больше, предпочт