Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции

Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции

Реферат

Изобретение относится к способу оценки качества масличной культуры - льна, применяемого в медицинской, косметической, кондитерской отраслях и комбикормовой промышленности.

Известный способ оценки качества льна [ГОСТ 10582 - 76 «Семена льна масличного. Промышленное сырье. Технические условия»] является методом определения кислотного числа жира [ГОСТ Р 52466-2005. Зерно и продукты его переработки. Метод определения кислотного числа жира. М.: Стандартинформ, 2006], который характеризует количество свободных жирных кислот, образованных при реакции окисления.

Недостатками данного способа оценки качества семян льна являются невозможность определения главных инициаторов реакции цепного окисления липидов - свободных радикалов, которые обычными методами химического анализа не могут быть определены из-за их неустойчивости в биохимических системах, а также длительность проведения испытаний и высокий расхода дорогостоящих реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому эффекту является способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции [Патент РФ №2284027, МПК⁵¹ G01N 21/76, (2006.01)], предусматривающий приготовление экстракта пшеничных зародышей, для получения которого смешивали измельченный исследуемый образец с фосфатным буфером с рН=7,5, далее с сульфатом железа (II) и перекисью водорода, и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой. Метод хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа (II), применяющийся в количественной оценке свободных радикалов для выявления перекисного окисления липидов в пшеничных зародышах, основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси с ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона; образующиеся при этом свободные радикалы (R^•, OH^•,RO^•, RO₂ ^•, О₂ ^•) вступают в процесс инициации свободно-радикального окисления в исследуемом субстрате (пшеничных зародышей), рекомбинация радикалов RO₂ ^• приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света.

Недостатком этого способа является то, что его невозможно использовать для анализа семян льна.

Технической задачей изобретения является разработка способа количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции, позволяющего своевременно обнаружить процессы, вызывающие порчу семян льна при хранении.

Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции характеризуется тем, что в качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 часа 30 минут, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин^-1 в течение 30 минут фильтрат, представляющий собой экстракт льна, и анализируют его, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна.

Технический результат заключается в своевременном обнаружении процессов, вызывающих порчу семян льна при хранении методом хемилюминесценции.

На чертеже представлена типичная кинетическая кривая развития хемилюминесценции для семян льна, сопровождающей процесс свободно-радикального перекисного окисления липидов.

Способ осуществляют следующим образом. При приготовлении исследуемого образца лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, затем просеивают через сито и смешивают с фосфатным буфером (рН=7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 1 часа 30 мин. Затем центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения ротора 6000 мин^-1. Фильтрат, представляющий собой экстракт семян льна, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-07. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл перекиси водорода и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается чертеже, где показаны максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (I_max), светосумма S(t) и тангенс угла (α) наклона кинетической кривой.

Для оценки свободно-радикального окисления в пробе наиболее значимыми являются параметры I_max - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (мВ) - характеризует перекисные процессы в продукте. Чем выше показатель I_max, тем больше свободных радикалов в продукте и интенсивнее перекисное окисление липидов. Параметр tg α - тангенс угла наклона кинетической кривой - характеризует ингибирующую способность самого продукта. Чем больше этот показатель, тем выше ингибирующая способность продукта. Параметр S - светосумма (мВ·сек) - площадь под кинетической кривой развития хемилюминесценции, коррелирует с показателями I_max и tg α.

Способ поясняется следующим примером.

Пример

Семена льна с влажностью 12,1% заложили на опытное хранение при температуре 15°С и относительной влажности воздуха 75%. Каждые 10 дней проверяли показатель кислотного числа продукта по стандартной методике и показатели хемилюминесценции, определяющиеся по методике следующим образом: при приготовлении исследуемого образца лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, затем просеивают через сито и смешивают с фосфатным буфером (рН=7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 1 часа 30 мин. Затем центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения ротора 6000 мин^-1. Фильтрат, представляющий собой экстракт семян льна, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-07. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл перекиси водорода и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается чертеже, где показаны максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (I_max), светосумма S(t) и тангенс угла (α) наклона кинетической кривой.

Каждый опыт проводили в 4-5-кратной повторности. Результаты исследований представлены в таблице.

Время хранения, сут	Показатели качества
Кислотное число, мг КОН/г	Imax,(мВ)	tg α	S,(мВ·сек)
Начало	0,3	1,282	0,732	12,552
10	0,95	1,543	0,634	13,795
20	2,26	2,151	0,521	14,325
30	4,47	2,842	0,432	18,297
40	7,54	3,931	0,354	20,324
50	8,63	4,723	0,295	25,126

При изучении изменения традиционного показателя качества семян льна установлено, что кислотное число постоянно росло, и к концу второго месяца его значение увеличилось в холодильнике на 8,33 мг КОН/г. Причем в течение первого месяца наблюдался интенсивный рост кислотного числа, т.е. за первые 30 суток значение кислотного числа увеличилось на 4,17 мг КОН/г, за следующие 20 суток - на 4,16 мг КОН/г.

Заложенный на хранение продукт исследовали на приборе биохемилюминометре БХЛ-07 для определения интенсивности перекисного окисления в семенах льна и их ингибирующей способности. При хранении семян льна интенсивность перекисного окисления (I_max) на начало составила 1,282 мВ, за полтора месяца хранения она увеличилась до 4,723 мВ. Ингибирующая способность продукта (tg α) за тот же период хранения снизилась с 0,732 до 0,295. Значение S увеличилось с 12,552 до 25,126 мВ·сек. За первые 30 суток хранения значение I_max увеличилось на 1,560 мВ, в то время как ингибирующая способность tg α снизилась на 0,300, а значение S выросло на 5,745 мВ·сек; в период с 30 суток по 60 сутки интенсивность перекисного окисления выросла на 1,881 мВ, значение S - на 6,829 мВ·сек, a tg α уменьшился на 0,137.

Таким образом, предложенный способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции является более точным, экспрессным и позволяет своевременно обнаружить процессы, вызывающие порчу продукта при хранении.

Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции, характеризующийся тем, что в качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 ч 30 мин, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин^-1 в течение 30 мин фильтрат, представляющий собой экстракт льна, и анализируют его, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна.