Лечение заболеваний, связанных с дефектной коммуникацией посредством щелевых контактов

Лечение заболеваний, связанных с дефектной коммуникацией посредством щелевых контактов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам их применения, содержащим полифенолы, такие как процианидины, например, полифенолы какао, такие как процианидины какао, для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечных аритмий. Настоящее изобретение относится также к композициям и способам их применения, содержащим полифенолы, такие как процианидины, например полифенолы какао, такие как процианидины какао, для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения прогрессирования нейродегенеративных и других заболеваний, связанных с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов, например расстройства познавательной способности.

Предпосылки к созданию изобретения

Полифенолы какао, такие как флаванолы и родственные им олигомеры, как было показано, оказывают благоприятное действие при гипертензии, атеросклерозе и сердечно-сосудистом заболевании. Данные эффекты показаны, например, в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497, и в примерах, представленных в данной заявке. Было показано, что полифенолы какао можно использовать для лечения или профилактики состояний, о которых известно, что на них влияет введение нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, например аспирина. Однако применение полифенолов какао, а не аспирина, для лечения и профилактики имеет преимущества, поскольку полифенолы какао не имеют побочных эффектов аспирина, таких как желудочное кровотечение.

В настоящее время неожиданно было открыто новое применение полифенолов какао, таких как флаванолы и родственные им олигомеры. Композиции и продукты, описанные в настоящем документе, можно применять для лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечных аритмий. Кроме того, указанные композиции и продукты можно применять для лечения, профилактики, уменьшения риска или замедления прогрессирования любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, такого как злокачественная опухоль, сердечная аритмия и нейродегенеративные и другие заболевания, связанного с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов.

Краткое описание существа изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, продуктам и способам для лечения, профилактики, уменьшения встречаемости или уменьшения риска сердечной аритмии у млекопитающего, страдающего сердечной аритмией или входящего в группу риска возникновения сердечной аритмии, человека или животного, являющегося объектом ветеринарной практики, такого как лошадь, кошка или собака. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам и продуктам для лечения, профилактики, уменьшения риска или замедления прогрессирования любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, такого как злокачественная опухоль, сердечная аритмия и нейродегенеративные заболевания и расстройство познавательной способности, связанного с дефектной коммуникацией между клетками посредством щелевых контактов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, такой как пищевой продукт, пищевая добавка, дополнение к диете или лекарственное средство, включающей в себя полифенол какао. Композиция необязательно может содержать L-аргинин и/или агент, понижающий уровень холестерина.

Упакованные продукты, содержащие упомянутые выше композиции и этикетку и/или инструкции по применению, для лечения, профилактики, уменьшения риска или замедления прогрессирования сердечной аритмии, нейродегенеративных заболеваний или любого состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками, также входят в объем настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, уменьшения риска или уменьшения встречаемости сердечной аритмии у млекопитающего, такого как человек или животное, являющееся объектом ветеринарной практики, путем введения композиции, содержащей полифенол какао, такой как флаванолы какао и/или родственные им олигомеры, млекопитающему, которое в этом нуждается.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, профилактики, уменьшения прогрессирования или уменьшения риска состояния, связанного с патологией щелевого контакта между клетками у млекопитающего, такого как человек или животное, являющееся объектом ветеринарной практики, путем введения композиции, содержащей полифенол какао, такой как флаванолы какао и/или родственные им олигомеры, млекопитающему, которое в этом нуждается. Например, указанное состояние представляет собой нейродегенеративное заболевание или расстройство познавательной способности, а млекопитающее страдает нейродегенеративным заболеванием или расстройством познавательной способности или входит в группу риска по данным заболеваниям.

Краткое описание рисунков

На фиг.1A-D показан межклеточный щелевой контакт в клетках WB-F344, измеренный посредством исследования с переносом краски люцифер желтый. А: контроль (0,2% ДМСО); B: TPA 10 нМ (90 мин.); С: генистеин 40 мкМ (72 ч); D: (-)-эпикатехин 40 мкМ (72 ч).

На фиг.2A-D представлена полученная методом иммунофлуоресценции картина субклеточного распределения коннексина 43. А: контроль (0,2% ДМСО); B: TPA 10 нМ; С: ТРА 10 нМ плюс (-)-эпикатехин 40 мкМ; D: ТРА 10 нМ плюс генистеин 40 мкМ. Время инкубации для всех видов воздействия составляло 90 мин.

На фиг.3 показано влияние фитостеролов, процианидинов какао и их комбинации на всасывание эпикатехина в плазму крови.

На фиг.4 показано влияние фитостеролов, процианидинов какао и их комбинации на окислительное повреждение ДНК.

На фиг.5 показано влияние фитостеролов, процианидинов какао и их комбинации на окислительное повреждение липидов.

Подробное описание изобретения

Все патенты, патентные заявки и ссылки, процитированные в настоящем документе, включены в него в качестве ссылок. В случае несовпадений приоритет имеет настоящее описание.

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей флаванол и/или родственные ему олигомеры, такие как по меньшей мере один флаванол какао и/или родственный ему процианидиновый олигомер, для введения млекопитающему, которое в этом нуждается. Композиция необязательно может содержать агент, понижающий уровень холестерина, например агент, понижающий уровень холестерина, на основе стерола и/или станола, L-аргинин, кальций, калий, магний, антиоксидант, например, витамин Е и витамин С, любой из витаминов группы В, каротиноид, гуаровую камедь или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3 жирную кислоту), витамин D3, ретиналь, ретиноиды, соевый белок и селен. Композиции могут содержать полифенолы из других источников, помимо какао, например, из кожуры арахиса, которые обладают свойствами, сходными со свойствами полифенолов какао, помимо или вместо полифенолов какао.

Используемый в настоящем документе термин «полифенол какао» (СР) относится к полифенольному веществу, такому как флаванолы и родственные им олигомеры, которые имеются в бобах какао или которые экстрагированы из бобов какао или ингредиентов какао. Термин «флаванол» включает мономеры катехин и эпикатехин. Олигомеры катехина и эпикатехина называют процианидинами. Любое упоминание в настоящем документе полифенола какао следует понимать как применимое также к флаванолам какао и процианидину, в комбинации и индивидуально.

Термин «ингредиент какао» относится к материалу, содержащему твердые вещества какао, полученному из лишенных кожуры молотых бобов какао, такому как шоколадный ликер и частично или полностью обезжиренные твердые вещества какао (например, плитка или порошок).

Фраза «агент, понижающий уровень холестерина» означает любое соединение, комбинацию соединений, экстракт или компонент растения, в натуральном виде или после обработки, которые обладают свойством понижать уровни холестерина у млекопитающего при введении в эффективном количестве. В случае, когда указанный агент, понижающий уровень холестерина, представляет собой соединение или комбинацию соединений типа стерола или станола, т.е. включает в себя производные и изомерные формы, агент, понижающий уровень холестерина, называют «агентом, понижающим уровень холестерина, на основе стерола и/или станола». В случае, когда приведенная фраза используется применительно к композиции, например, «черный шоколад, понижающий уровень холестерина», это означает, что композиция обладает свойством понижать уровень холестерина.

Полифенолы какао могут иметь природное происхождение, т.е. могут быть получены из бобов какао, или могут быть получены синтетическим путем. Специалист может выбрать натуральный или синтетический полифенол, основываясь на его доступности или стоимости. Полифенолы какао можно включать в композицию в форме ингредиента какао, содержащего полифенолы какао, например шоколадного ликера, включенного в шоколад, или можно добавлять независимо от ингредиентов какао, например, в виде экстракта, фракции экстракта, выделенного и очищенного отдельного соединения, объединенных фракций экстракта или соединения, полученного синтетическим путем.

Полифенолы какао включают в себя флаванолы какао и их олигомеры. Флаванолы включают в себя (+)-катехин, (-)-эпикатехин и соответствующие им эпимеры (например, (-)-катехин и (+)-эпикатехин) и имеют следующую структуру:

Процианидиновые олигомеры могут иметь приблизительно от 2 до 18, предпочтительно, примерно от 2 до 12, а наиболее предпочтительно, примерно от 2 до 10 мономерных единиц. Например, олигомеры могут представлять собой димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры, гептамеры, октамеры, нонамеры и декамеры. В олигомере мономеры соединяются между собой посредством интерфлавановых связей (4→6) и/или (4→8). Олигомеры, имеющие исключительно (4→8) связи, являются линейными, в то время как наличие по меньшей мере одной (4→6) связи дает разветвленный олигомер. В случае полифенолов кожуры арахиса имеются также такие связи как С2→О→С7.

Таким образом, в композициях и способах согласно изобретению можно использовать полимерное соединение формулы A_n или его фармацевтически приемлемую соль:

где

n представляет собой целое число от 2 до 18, таким образом, что имеется по меньшей мере одна концевая мономерная единица А и одна или множество дополнительных мономерных единиц;

R представляет собой 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН;

образование связей между соседними мономерами имеет место в положениях, выбранных из группы, состоящей из 4, 6 и 8;

связь дополнительной мономерной единицы в положении 4 имеет альфа- или бета-стереохимию;

X, Y и Z выбраны из группы, состоящей из мономерной единицы А или водорода, с теми условиями, что, как и в случае по меньшей мере одной концевой мономерной единицы, образование связи с ней дополнительной мономерной единицы происходит в положении 4, и, необязательно, Y = Z = водород.

Полифенол какао можно получать экстрагированием из бобов какао, из лишенных кожуры молотых бобов какао или ингредиентов какао, таких как шоколадный ликер, частично обезжиренные твердые вещества какао и/или полностью обезжиренные твердые вещества какао. Предпочтительно, экстракт изготавливают из полностью или частично обезжиренного порошка какао. Можно использовать бобы любого из видов Theobroma, Herrania или их межвидовых или внутривидовых гибридов. Экстракт можно изготавливать из ферментированных, недоферментированных или неферментированных бобов; при этом ферментированные бобы содержат наименьшее количество полифенолов какао, а неферментированные - наибольшее. Выбор бобов можно осуществлять по коэффициенту ферментирования бобов, например, экстракт можно изготавливать из бобов, имеющих коэффициент ферментирования около 275 или менее. Оптимизацию уровня полифенолов в ингредиенте какао и его экстракте посредством манипулирования степенью ферментирования можно осуществлять, как описано в международной заявке № PCT/US97/15893, опубликованной как WO98/09533, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса.

Полифенолы какао можно экстрагировать из ингредиентов какао, которые были обработаны традиционными способами обработки какао (описанными, например, в Industrial Chocolate Manufacture and Use, ed. Beckett, S.T., Blackie Acad. & Professional, New York, 1997, в главах 1, 5 и 6), или улучшенным способом обработки, описанным в патенте США № 6015913, выданном Kealey et al., который сохраняет полифенолы (путем предотвращения их разрушения) с ингредиентах какао, в отличие от традиционных способов. В улучшенном способе обработки какао отсутствует традиционный этап обжарки. Таким образом, можно использовать ингредиенты какао, получаемые (а) нагреванием бобов какао в течение периода времени и при температуре, достаточной для удаления кожуры какао, без обжарки лишенных кожуры молотых бобов какао; (b) отвеиванием лишенных кожуры молотых бобов какао от кожуры какао; (с) прессованием на шнековом прессе лишенных кожуры молотых бобов какао и (d) извлечением масла какао и частично обезжиренных твердых веществ какао, которые содержат сохраненные уровни полифенолов какао. Способ сохраняет гораздо более высокий уровень высших процианидиновых олигомеров по сравнению с традиционными способами обработки. Твердые вещества какао, полученные данным способом, могут содержать более 20000 мкг общего количества флаванола и/или процианидинов на грамм нежирных твердых веществ; предпочтительно, более 25000 мкг/г, более предпочтительно, более 28000 мкг/г и, наиболее предпочтительно, более 30000 мкг/г. Для целей настоящего изобретения общие количества флаванола и/или процианидинов определяют, как описано в примере 2.

Полифенолы какао можно экстрагировать из источников, указанных выше, с помощью растворителей, в которых растворяются полифенолы. Подходящие растворители включают в себя воду или органический растворитель, такой как метанол, этанол, ацетон, изопропиловый спирт и этилацетат. Можно использовать также смеси растворителей. В случае, когда в качестве растворителя используют воду, ее можно слегка подкислять, например, уксусной кислотой. Примерами некоторых растворителей являются смеси воды и органического растворителя, например, водный метанол, этанол или ацетон. Водные органические растворители могут содержать, например, приблизительно от 50% до 95% органического растворителя. Так, можно использовать приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% и приблизительно 90% органического растворителя в воде. Растворитель может также содержать малое количество кислоты, такой как уксусная кислота, например, в количестве приблизительно от 0,5% до 1,0%. Состав экстрактов, т.е. представительство (т.е. профиль олигомеров) и количество процианидиновых олигомеров, будет зависеть от выбора растворителей. Например, водный экстракт содержит главным образом мономеры, этилацетатный экстракт содержит мономеры и низшие олигомеры, главным образом димеры и тримеры, а водный метаноловый, этаноловый или ацетоновый экстракт содержит мономеры и ряд высших олигомеров. Один из растворителей для экстрагирования мономера, а также высших процианидиновых олигомеров представляет собой приблизительно 70% ацетон. Однако любой экстракт, содержащий полифенолы, является пригодным для настоящего изобретения. Способы экстрагирования полифенолов какао известны специалистам и описаны, например, в патенте США № 5554645, выданном Romanczyk et al., и в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497. Так, в одном варианте осуществления изобретения экстракт какао получают путем измельчения бобов какао до порошка какао, обезжириванием порошка, экстрагированием полифенолов какао и очистки экстракта. Порошок какао можно получать лиофильной сушкой бобов и мякоти какао, удалением мякоти и шелухи из лиофилизированных бобов какао и размалыванием лишенных шелухи бобов.

Экстракт полифенолов какао можно очищать, например, удаляя кофеин и/или теобромин и дополнительно очищая гельпроникающей хроматографией и/или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Гельпроникающую хроматографию (например, на Sephadex LH-20) можно использовать для обогащения экстракта высшими процианидиновыми олигомерами. Например, можно не собирать элюат, содержащий мономеры и низшие олигомеры, до тех пор, пока целевой олигомер (олигомеры) не начнет элюироваться с колонки. Пример подобного экстракта известен специалистам и описан в примере 5 международной заявки № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Используя препаративную ВЭЖХ, например, ВЭЖХ с нормальной фазой, экстракт можно фракционировать, например, на мономерную и олигомерную фракции, содержащие по меньшей мере 50 мас.% мономера или специфического олигомера (олигомеров). В случае, когда конкретная фракция содержит мономеры или любой из низших олигомеров (например, фракцию димеров, тримеров или тетрамеров), фракция содержит приблизительно от 90 до 95 мас.% фракции конкретного олигомера. Желаемые фракции можно объединить после разделения, чтобы получить комбинацию олигомеров выбора, например олигомеров 3-10 или 5-10. Специалист может манипулировать условиями хроматографии для достижения желаемого профиля процианидинов с точки зрения руководства данного описания, общих знаний в данной области и, например, идей патента США № 5554645, выданном Romanczyk et al., и международной заявки № PCT/US97/05693, опубликованной как WO97/36497.

Мономерная фракция обычно содержит смесь мономеров эпикатехина и катехина, а олигомерная фракция обычно содержит смесь димеров (во фракции димеров), тримеров (во фракции тримеров), тетрамеров (во фракции тетрамеров) и т.п. Смеси мономеров и олигомеров встречаются в выделенных фракциях, поскольку какао содержит более одного типа каждого из изомеров, димеров и т.п. Олигомерная вариабельность наблюдается как результат наличия двух мономеров, эпикатехина и катехина, которые являются строительными блоками процианидинов, а также химической связью, соединяющей мономеры в олигомере. Так, димеры какао представляют собой, главным образом, В2 и В5, каждый из которых содержит два мономера эпикатехина. Отдельные мономеры и олигомеры можно получить с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, например, с использованием колонки С18.

Полифенол какао можно использовать в композициях согласно изобретению в форме экстракта какао, например экстракта, полученного с использованием растворителя, фракции какао, выделенных соединений, или в форме ингредиента какао или шоколада, содержащих эффективное количество флаванолов и/или процианидинов какао. Ингредиенты какао можно изготавливать с помощью традиционных технологий переработки какао, но предпочтительно с помощью способа, описанного в патенте США № 6015913, выданном Kealey et al. Альтернативно, для повышения уровня полифенолов какао можно использовать шоколадный ликер и твердые вещества какао, изготовленные из бобов какао, имеющих коэффициент ферментирования около 275 или менее. Указанные ингредиенты имеют содержание полифенолов какао, превышающее то, которое может быть получено с использованием традиционных способов обработки какао (например, с обжаркой) и полностью ферментированных бобов. Шоколад можно изготавливать с помощью обычных технологий из ингредиентов, описанных выше, или с помощью улучшенного процесса для сохранения полифенолов какао во время изготовления шоколада, как описано в международной заявке № PCT/US99/05414, опубликованной как WO99/45788, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Шоколад, изготовленный с помощью по меньшей мере одного из следующих нетрадиционных процессов, называется в настоящем документе «шоколад, имеющий сохраненное количество полифенолов какао»: (i) изготовление ингредиентов какао из недоферментированных или неферментированных бобов какао; (ii) сохранение полифенолов какао во время процесса изготовления ингредиентов какао и (iii) сохранение полифенолов какао во время процесса изготовления шоколада.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции содержат по меньшей мере один олигомер, такой, например, как димер. Указанные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один мономер или комбинацию мономеров, например катехина и эпикатехина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения изготавливают и используют также композиции, содержащие комбинацию мономеров, катехина и эпикатехина, например, в форме мономерной фракции, выделенной из какао.

Синтетические процианидины также можно использовать и изготавливать с помощью способов, известных специалистам, и как описано в международной заявке № PCT/US98/21392, опубликованной как WO99/19319, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в тех ее частях, которые касаются рассматриваемого вопроса. Также могут быть пригодны производные полифенолов какао. Указанные производные включают в себя галлатированные мономеры и олигомеры, гликозилированные мономеры и олигомеры и их смеси, метаболиты процианидиновых мономеров и олигомеров, такие как сульфатированные, глюкуронидированные и метилированные формы, и продукты ферментативного расщепления процианидинов, произведенные в результате метаболизма микрофлоры толстого кишечника или метаболизма организма млекопитающего. Производные могут происходить из натуральных источников или могут быть изготовлены синтетическим путем.

Композиция необязательно может включать в себя агент, понижающий уровень холестерина. Можно использовать любой агент, понижающий уровень холестерина, независимо от механизма его действия. Подходящие агенты могут действовать путем уменьшения всасывания холестерина с желчью млекопитающего или путем уменьшения синтеза холестерина. Примерами подходящих агентов являются фитостеролы, фитостанолы и их производные и изомеры, соевый белок, растворимые волокна, например, бета-глюкан, например, из овса и psyllium, орехи, масло из рисовых отрубей, каждый из которых является особенно пригодным для использования в пищевых продуктах, в добавочных диетических композициях и пищевых добавках. Можно использовать также известные лекарственные средства, понижающие уровень холестерина; они являются менее предпочтительными для использования в пищевых продуктах и композициях пищевых добавок, но могут быть использованы в лекарственных средствах. Для специалиста будет очевидно, что выбор агента, понижающего уровень холестерина, зависит от планируемого носителя для доставки (например, в пищевом продукте, в дополнении к диете, в лекарственном средстве) и способа введения. Так, агент, который уменьшает всасывание холестерина с желчью, не будет предпочтительным для внутривенного введения. Подобно этому, если носителем для доставки является продукт питания, агент, понижающий уровень холестерина, который имеет сильный лекарственный вкус или запах, может быть нежелательным.

Фитостеролы представляют собой стеролы растительного происхождения, которые не растворяются в воде и имеют молекулярную массу и структуру, аналогичную холестерину. Фитостеролы уменьшают всасывание холестерина с желчью (как эндогенного холестерина, так и холестерина, поступающего с пищей), а также уровни холестерина в сыворотке крови (общего и ЛНП), но сами не всасываются. Идентифицировано более сорока растительных стеролов, однако в наибольших количествах в растениях содержатся бета-ситостерол, кампестерол и стигмастерол. Другими примерами полезных стеролов являются брассикастерол, десмостерол, халиностерол, пориферастерол и клионастерол. Можно использовать отдельные стеролы или смеси стеролов, выделенные из источников природного происхождения или полученные синтетическим путем, а также их изомеры и производные. Особенно полезными являются насыщенные производные стеролов, известные как станолы, в которых все углерод-углеродные связи в кольцах являются насыщенными. Подходящие станолы имеют 28 или 29 атомов углерода и включают бета-ситостанол, клионастанол, 22,23-дигидробрассикастанол и кампестанол. Фитостеролы могут иметь форму твердого вещества (например, порошок, гранулы) или жидкости (например, масла).

Стеролы и станолы обнаружены в нескольких растительных материалах, как описано, например, в международной заявке № РСТ/ЕР96/02344. Примерами источников стеролов/станолов являются сосновая кора, соевое масло, талловое масло, экстракт побегов бамбука (описанный в международной заявке № PCT/US98/12556, опубликованной как WO98/57545), кожура и масло какао и масло из рисовых отрубей. Талловое масло, побочный продукт целлюлозно-бумажной промышленности, является хорошим источником станола, т.е. бета-станола.

Растительный стерол можно получать из натуральных источников, таких как растительные масла, отстой растительных масел, дистилляты растительных масел и другие источники из растительных масел, такие как талловое масло, с помощью относительно простых и недорогих способов. Например, получение препарата стеролов из отстоя растительных масел с использованием растворителей, таких как метанол, описано в патенте США № 4420427, выданном Hamunen. Станолы обнаруживают в природе в малых количествах, но их легко получить из стеролов путем гидрогенизации стеролов любым из нескольких способов, известных специалистам. В случае, когда исходный стероловый материал получен из растительного материала, он содержит смесь нескольких различных стеролов; таким образом, после гидрогенизации полученный станол также будет представлять собой смесь различных станолов. Смеси являются пригодными для применения согласно изобретению. Однако также можно гидрогенизировать чистые препараты конкретных стеролов, чтобы получить чистые станолы, которые также можно использовать.

Масло какао, экстрагированное из кожуры какао, представляет собой хороший источник фитостеролов. Фитостеролы какао представляют собой смесь свободных и связанных стеролов; причем свободные стеролы составляют приблизительно до 90% имеющихся фитостеролов. Фитостеролы включают в себя кампестерол, β-ситостерол и стигмастерол, циклоартеноил, 24-метиленциклоартеноил, а также малые количества других фитостеролов. Связанные фитостеролы включают в себя эфиры фитостеролов с жирными кислотами или ферулатные производные фитостеролов. Масло какао также содержит токолы, которые включают в себя токоферолы (которые обладают антиоксидантными свойствами) и токотриенолы (которые могут обладать свойством понижать уровни холестерина). Масло какао получают способом, включающим в себя следующие стадии: (i) размалывание кожуры какао; (ii) экстрагирование размолотой кожуры какао растворителем для фитостеролов; (iii) удаление растворителя и (iv) получения масла какао. Кожура какао, побочный продукт обжарки бобов какао, может быть получен из высушенных ферментированных бобов какао, измельченных бобов какао, обжаренных бобов какао и, предпочтительно, из высушенных неферментированных бобов, которые содержат наибольшее общее количество стеролов. Предпочтительные бобы какао получают из Theobroma cacao. Предпочтительными растворителями являются петролейный эфир, гексан, пентан и этиловый эфир. Растворитель можно удалять путем вакуумной перегонки. В одном варианте осуществления лиофилизированную кожуру измельчают до тонкого порошка на мельнице Tekmar (Cincinatti, OH), и размолотую массу экстрагируют в течение ночи подвергнутым повторной перегонке петролейным эфиром (т.кип. 38-39,6°С) на аппарате Soxtec (Fisher Scientific, Springfield, NJ). На следующее утро растворитель тщательно удаляют медленным выпариванием под потоком азота, и полученный экстракт хранят при -40°С. Фитостеролы затем можно очищать с помощью препаративной ВЭЖХ или колоночной хроматографии.

Можно использовать также эстерифицированные формы стеролов и станолов. Эстерификация делает стеролы/станолы более растворимыми в жирах и маслах, что может, в некоторых случаях, способствовать включению в пищевые продукты и другие средства доставки в организм. Например, стеролы можно эстерифицировать сложными эфирами жирных кислот. Примеры указанных эстерифицированных стеролов включают в себя ацетат ситостерола, олеат ситостерола и олеат стигмастерола. Сложные эфиры станолов можно получать способами, известными специалистам, и, например, как описано в патенте США № 6031118, выданном van Amerongen et al., в патенте США № 5892068, выданном Higgins, в патенте США № 5502045, выданном Miettenen et al., и в международной заявке № PCT/CA99/00655 (опубликованной как WO00/04887). В одном варианте осуществления пригодные сложные эфиры станолов получают эстерификацией по меньшей мере одного стерола сложным эфиром жирных кислот С₂-С₂₂, как описано в патенте США № 5958913, выданном Miettenen et al. Для повышения растворимости стеролов/станолов после введения млекопитающему можно использовать другие способы, известные специалистам. Один подобный способ описан в патенте США № 5932562, выданном Ostlund, в котором стерол/станол смешивают с лецитином, чтобы получить растворимый в воде порошок.

Стеролы/станолы можно добавлять в композицию в форме порошка путем смешивания с остальными ингредиентами. В случае пищевой композиции стеролы/станолы, а также другие агенты, понижающие уровень холестерина, удобно добавлять на стадии смешивания. Во время изготовления шоколада, понижающего уровень холестерина, например, стеролы/станолы можно добавлять в сухую смесь, содержащую сахар, в плавящееся масло, в молотые бобы какао перед размалыванием или в расплавленный шоколад, что менее предпочтительно. Для облегчения смешивания стеролы/станолы можно сначала растворить в солюбилизирующем агенте, таком как жир, растительное масло, моноглицериды, диглицериды, триглицериды, токоферолы и их смеси. Эффективными носителями для изготовления суспензий и эмульсий стеролов/станолов в воде являются вода, спирт, полиол, другие пищевые соединения, например, шоколадный ликер, в котором стеролы/станолы по меньшей мере частично растворимы, и их смеси.

Соевый белок можно добавлять в композицию в любой известной форме, например, она может представлять собой изолят соевого белка, концентрат соевого белка, текстурированный соевый белок или соевую муку, хлопья и муку грубого помола. Цельное зерно или его фрагмент также можно использовать, как описано, например, в примере 5. Различные формы соевого белка хорошо известны специалистам и имеются в продаже. Его свойства и способы получения описаны, например, в Soy Protein and Human Nutrition, Wilcke et al., eds., Acad. Press, NY, 1979. Соевый белок можно использовать в комбинации с любым агентом, понижающим уровень холестерина, на основе стерола и/или станола.

Растворимые растительные волокна, например, бета-глюкан, способны уменьшать содержание холестерина в плазме крови. Волокна для применения согласно изобретению можно получать из любого источника бета-глюкана, предпочтительно, из зерен овса и овсяных отрубей. Волокна можно изготавливать и добавлять в композиции в соответствии со способами, известными специалистам. Они особенно подходят для композиций, доставляемых перорально, таких как пищевые продукты и дополнение к диете. Бета-глюкан и другие растворимые растительные волокна можно использовать в комбинации с любым агентом, понижающим уровень холестерина, на основе стерола и/или станола.

Композиция согласно изобретению может также содержать L-аргинин, который может содержаться в композиции согласно изобретению в различных формах, например, в форме очищенного соединения, экстракта из содержащего L-аргинин растения или в форме ингредиента семян/орехов, например, ореховой муки или цельного семени/ореха. Можно использовать любой источник L-аригинина, синтетический или натуральный. Предпочтительными источниками L-аргинина являются соевые бобы и ядра орехов, такие как арахис, грецкие орехи, миндаль и фундук. Можно использовать обезжиренные и частично обезжиренные ядра орехов. Последние могут быть размолоты и могут называться ореховой мукой.

Композиция может также содержать кальций, калий, магний, антиоксидант, такой как витамин Е и витамин С, любой из витаминов группы В, каротиноид, гуаровую камедь или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3 жирную кислоту), которые можно получать в соответствии со способами, известными специалистам. Моно- или полиненасыщенные жирные кислоты можно использовать в форме оливкового масла, рыбьего жира или ореха. Примерами орехов, подходящих для данного использования, являются арахис, миндаль и грецкие орехи.

Композиция согласно изобретению является пригодной в качестве продукта питания, пищевой добавки, дополнения к диете или лекарственного средства. Композиции могут содержать носитель, разбавитель или наполнитель. В зависимости от планируемого использования, носитель, разбавитель или наполнитель можно выбирать таким образом, что он будет подходящим для использования человеком или животным, для пищевого продукта, добавки, дополнения или фармацевтического использования.

Используемый в настоящем документе термин «пища» относится к материалу, состоящему главным образом из белка, углевода и/или жира, который используется организмом для поддержания роста, восстановительных процессов и процессов жизнедеятельности, а также в качестве источника энергии. Пищевые продукты могут также содержать дополнительные вещества, такие как минералы, витамины и приправы. См. словарь Merriam-Webster Collegiate Dictionary, 10-е издание, 1993 г. Термин «пища» включает в себя напиток, адаптированный для потребления человеком или животным. Используемый в настоящем документе термин «пищевая добавка» определен FDA в 21 C.F.R. 170.3(e)(1) и включает в себя прямые и непрямые добавки. Используемый в настоящем документе термин «лекарственное средство» представляет собой медицинское лекарственное средство. См. словарь Merriam-Webster Collegiate Dictionary, 10-е издание, 1993 г. Лекарственное средство также может называться медикаментом. Используемый в настоящем документе термин «дополнение к диете» представляет собой продукт (не являющийся табаком), который предназначен для дополнения рациона и несет или содержит один или более следующих ингредиентов диеты: витамин, минерал, траву или другой растительный материал, аминокислоту, питательное вещество для использования человеком с целью дополнения рациона путем увеличения общего ежедневного приема, или концентрат, метаболит, составную часть, экстракт или комбинацию указанных ингредиентов.

Любая обычная пища, включая любой напиток, которая была улучшена присутствием полифенола какао или его производного, например, метилированных соединений или продуктов метаболического распада, и, необязательно, в комбинации с агентом, понижающим уровень холестерина, L-аргинином, кальцием, калием, магнием, антиоксидантом, таким как витамин Е и витамин С, любым из витаминов группы В, каротиноидом, гуаровой камедью и/или моно- или полиненасыщенной жирной кислотой (например, омега-3), находится в пределах объема настоящего изобретения.

Улучшение достигается (i) добавлением полифенола какао или его производного к пище, которая не содержит полифенол какао, или (ii) в случае, когда пища традиционно может содержать полифенолы какао, такая, например, как шоколад, повышением уровня полифенола по сравнению с тем уровнем, который имеется в пище, приготовленной традиционным способом. Повышение может достигаться добавлением дополнительного количества полифенолов какао, например, в форме экстракта, фракции или выделенного из них и очищенного соединения; добавлением полифенола какао в комбинации с другим ингредиентом, содержащим полифенол (например, кожуры орехов); манипулированием обработкой ингредиентов какао и отбором бобов какао, как описано выше, для сохранения полифенола какао в ингредиенте какао, используемом для производства пищевого продукта; или манипуляциями в процессе изготовления шоколада, как описано выше. Таким образ