Способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов

Способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов, обедненной фенольными компонентами мочи и неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями.

Эстрогены используются в медицине для заместительной гормонотерапии. Смеси эстрогенов применяют прежде всего в лечебных и профилактических целях при недомоганиях, возникающих у женщин в климактерический период после естественной или искусственно вызванной менопаузы. Для применения в подобных целях как особо эффективные и хорошо переносимые пациентами зарекомендовали себя природные смеси конъюгированных эстрогенов, содержащиеся в моче жеребых кобыл и ниже называемые природными смесями конъюгированных лошадиных эстрогенов.

Содержание твердого вещества, растворенного в моче жеребых кобыл (в последующем описании сокращенно обозначаемой как МЖК), может, как очевидно, колебаться в достаточно широких пределах и обычно составляет от 40 до 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и прочими обычными компонентами мочи в твердом веществе, содержащемся в МЖК, присутствуют также фенольные компоненты в количествах, составляющих от примерно 2 до 5 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. К числу таких фенольных компонентов относятся крезолы и дигидро-3,4-бис-[(3-гидроксифенил)метил]-2(3Н)-фуранон, сокращенно обозначаемый как ГФМФ. Эти вещества могут быть представлены в свободной или конъюгированной форме. В МЖК содержится далее природная смесь эстрогенов, которая преимущественно представлена в конъюгированной форме, например, в виде натриевой соли полуэфира серной кислоты (ниже кратко называемой как "сульфат"). Содержание конъюгированных эстрогенов (рассчитываемое в виде сульфата эстрогенов) может составлять от 0,1 до 1 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. В твердом веществе, содержащемся в МЖК, дополнительно могут присутствовать и иные липофильные соединения, количества которых могут варьироваться в широких пределах и не поддаются прогнозированию. К таким липофильным соединениям, источником которых служат преимущественно потребляемые жеребыми кобылами в пищу растения, относятся главным образом различные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные, а также сопоставимые с ними соединения, такие, например, как формононетин, генистеин, даидзеин, биоханин А, эквол и куместрол. Эти липофильные соединения изначально растительного происхождения могут присутствовать в моче в конъюгированной или в свободной (неконъюгированной) форме. К другим липофильным компонентам твердого вещества, содержащегося в МЖК, относятся также неконъюгированные стероидные производные, среди которых особо следует отметить андростановые и прегнановые стероиды, но также можно назвать неконъюгированные эстрогеновые производные.

Экстракты, содержащие природные смеси конъюгированных эстрогенов, обычно получают либо методом твердофазной экстракции, либо методом, основанным на различных процессах жидкостно-жидкостной экстракции не смешивающимися или лишь плохо смешивающимися с водой органическими растворителями. В целом же выделенная из МЖК природная смесь конъюгированных эстрогенов для возможности ее использования в качестве действующего вещества в фармацевтических препаратах должна удовлетворять определенным фармацевтическим спецификациям, например, должна соответствовать спецификациям, изложенным в фармакопее США или в европейской фармакопее. Так, в частности, содержание конъюгированных эстрогенов в такой смеси в пересчете на массу сухого вещества должно быть не ниже определенных предельных значений.

В патентах US 2551205 и US 2429398 описан способ получения водорастворимого препарата эстрогенов из МЖК, в соответствии с которым сначала путем адсорбции на активированном угле или иных пригодных адсорбентах, элюирования смешивающимся с водой органическим растворителем, например пиридином, и последующего удаления растворителя получают водный концентрат, который содержит преобладающую часть водорастворимых эстрогеновых компонентов исходной МЖК. Если согласно патенту US 2429398 концентрат путем его экстракционной обработки бензолом и/или диэтиловым эфиром подвергают дальнейшей очистке, то согласно патенту US 2551205 концентрат подкисляют до значения рН в интервале от 2 до 6, предпочтительно от 4 до 5, и затем быстро подвергают экстракционной обработке практически не смешивающимся с водой органическим растворителем из группы алифатических, ароматических или алициклических углеводородов (например, гексаном, бензолом, толуолом, циклогексаном) или хлорированных углеводородов (например, хлороформом, этилендихлоридом, трихлорэтиленом, четыреххлористым углеродом, хлорбензолом) с целью отделения нежелательных веществ, таких как жиры, масла, свободные фенольные компоненты и неконъюгированные стероиды, за счет их перевода в органическую фазу. В завершение водную фазу стабилизируют путем ее нейтрализации. В патенте US 2551205 полученный экстракт рекомендуется подвергать дальнейшей очистке путем последующих стадий экстракции и осаждения. В целом же по завершении описанного в US 2551205 способа выход эстрогеновых компонентов используемого концентрата составляет лишь примерно 80% от всего их содержания в нем.

В патенте US 2565115 описана экстракция конъюгированных эстрогенов из МЖК ацетоном. О чистоте полученной таким путем эстрогеновой фракции в этом патенте, однако, не приводится никаких данных.

В патенте US 2696265 описан способ, в соответствии с которым сначала эстрогены экстрагируют алифатическим спиртом или кетоном, например гексанолом, циклогексанолом или циклогексаноном. Эстрогены переходят при этом в органическую фазу, после чего их подвергают дальнейшей очистке и, в частности, содержащую эстрогены водную фазу подкисляют соляной кислотой до значения рН, равного 4, и подвергают экстракционной обработке этилендихлоридом.

В патенте US 2834712 описан способ получения смесей эстрогенов с высокой степенью чистоты и малой токсичностью, основанный на выполнении множества отдельных стадий экстракции различными растворителями при различных значениях рН. При этом используются большие объемы растворителей, например гексана и бензола. Так, например, на одной из стадий в целях отделения фенольных компонентов уже очищенный концентрат растворяют в воде, полученный раствор подкисляют соляной кислотой до значения рН, равного примерно 5,0, и после этого подвергают экстракционной обработке бензолом, а затем диэтиловым эфиром.

В публикации WO 01/27134 описан сравнительно простой в осуществлении способ экстракции конъюгированных эстрогенов из МЖК. В соответствии с этим способом МЖК после добавления к ней соли, например хлорида натрия, подвергают экстракционной обработке взятым по меньшей мере в таком же объеме органическим растворителем, например этилацетатом, что сопровождается переходом конъюгированных эстрогенов в органическую фазу. Эту органическую фазу затем отделяют и сушат, получая собственно экстракт. Однако в публикации WO 01/27134 не приведено никакой информации о чистоте полученного экстракта конъюгированных эстрогенов.

Однако при осуществлении описанных выше известных методов жидкостно-жидкостной экстракции приходится сталкиваться со множеством проблем, таких как интенсивное пенообразование, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Обычно экстракцию требуется проводить в несколько стадий, что приводит к потере эстрогеновых компонентов и лишь неполному их выделению из мочи. Помимо этого для проведения этих методов экстракции требуются большие объемы отчасти вредных для здоровья растворителей. Кроме того, в указанных выше патентных публикациях не содержится никакой информации ни о содержании в получаемых продуктах неконъюгированных липофильных компонентов, таких, например, как неконъюгированные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения или же неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, ни об отделении этих компонентов. Эти известные способы не позволяют получить удовлетворительные результаты касательно выхода или касательно чистоты получаемого экстракта, о чем свидетельствуют данные измерений на полученном общем количестве гормонов в пересчете на массу сухого вещества, или же основаны на проведении множества различных стадий и применении больших объемов органических и отчасти даже нежелательных с токсикологической точки зрения растворителей.

Из уровня техники известны далее различные методы твердофазной экстракции, предназначенные для получения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов, значительно обедненной фенольными компонентами мочи.

Так, в частности, в публикации WO 98/08526 описан способ, который позволяет путем твердофазной экстракции на семиполярной, прежде всего на неионогенной семиполярной, полимерной адсорбирующей смоле получать содержащую практически все количество присутствующих в МЖК природных эстрогенов смесь, обедненную фенольными компонентами мочи и практически не содержащую крезола и ГФМФ. В публикации WO 98/08525 описан аналогичный способ, предусматривающий использование при твердофазной экстракции силикагеля в качестве адсорбента. Аналогичный способ описан и в заявке CN 1308083 и основан на применении полярных адсорбирующих смол, содержащих цианогруппы. В заявке US 2002/0156303 описан далее способ, при осуществлении которого МЖК перед ее очисткой пропусканием через полистирольную адсорбирующую смолу сначала обрабатывают щелочным растворителем и предварительно очищают фильтрацией. Получаемые этими способами экстракты могут использоваться в качестве исходного материала для получения фармацевтических препаратов, которые в качестве действующего вещества содержат природную смесь конъюгированных эстрогенов из МЖК.

Смеси конъюгированных эстрогенов, выделенные из МЖК описанным в WO 98/08526 или WO 98/08525 способом, обычно удовлетворяют установленным требованиям фармацевтических спецификаций, например, касательно соблюдения предельных значений содержания конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Описанные в этих публикациях способы позволяют прежде всего получать обедненный фенольными компонентами мочи, практически не содержащий крезола и ГФМФ продукт. При этом, однако, было установлено, что в полученном сухом веществе наряду с требуемыми конъюгированными эстрогенами могут содержаться также неконъюгированные липофильные соединения. К таким неконъюгированным липофильным соединениям относятся, например, различные неконъюгированные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения, такие, например, как формононетин, генистеин, даидзеин, биоханин А, эквол и куместрол, но также неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и неконъюгированные эстрогены, при этом такой перечень неконъюгированных липофильных соединений не ограничен указанными выше. Присутствие подобных неконъюгированных липофильных соединений в выделенной из МЖК смеси конъюгированных эстрогенов не представляется возможным стандартизировать, поскольку содержание и состав свободных и конъюгированных липофильных соединений варьируется, например, в зависимости от потребляемого жеребыми кобылами корма.

Хотя состав природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов и не изменяется из-за дополнительного присутствия в ней неконъюгированных липофильных соединений, тем не менее их наличие может снижать содержание конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Концентрацию действующих веществ, т.е. конъюгированных лошадиных эстрогенов, в полученном экстракте в принципе можно повысить путем целенаправленного отделения неконъюгированных липофильных компонентов. Отделение неконъюгированных липофильных соединений позволяет также добиться однородного состава отдельных партий экстракта, поскольку в этом случае благодаря удалению неконъюгированных липофильных компонентов, содержание и состав которых в МЖК может варьироваться в зависимости от сезонного изменения типа потребляемого жеребыми кобылами корма, все полученные экстракты имеют сравнимое содержание в них конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Помимо этого отделение неконъюгированных липофильных соединений может оказаться предпочтительным для достижения однородного спектра физиологического действия. Так, например, может оказаться целесообразным отделять от природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов присутствующие в ней при определенных условиях неконъюгированные липофильные соединения, которые возможно сами могут обладать собственным физиологическим действием.

Одна из возможностей отделения нежелательных неконъюгированных липофильных соединений состоит, например, в отдельной жидкостно-жидкостной экстракционной обработке выделенной известными, рассмотренными выше методами твердофазной экстракции природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов пригодным для этой цели органическим растворителем, который целенаправленно экстрагирует нежелательные неконъюгированные липофильные соединения без потери конъюгированных лошадиных эстрогенов. Подобный способ в целом описан в заявке РСТ/ЕР2003/050703.

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать технически и экономически оптимальный способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов со значительно сниженным содержанием в ней фенольных компонентов мочи, а также неконъюгированных липофильных соединений, прежде всего неконъюгированных флавоноидных, изофлавоноидных и норизопреноидных производных. Задача настоящего изобретения состояла прежде всего в разработке такого способа, который не требовал бы по сравнению с уже известными способами выделения природных смесей конъюгированных лошадиных эстрогенов проведения дополнительных стадий. Еще одна задача настоящего изобретения состояла в разработке способа, который обеспечивал бы снижение содержания фенольных компонентов мочи и неконъюгированных липофильных соединений в процессе твердофазной экстракции. Помимо этого задача настоящего изобретения состояла в разработке способа, который был бы основан на проведении лишь небольшого количества стадий и позволял бы при этом получать экстракт конъюгированных лошадиных эстрогенов со сравнительно высоким их содержанием в нем в пересчете на массу сухого вещества. Кроме того, подобный способ должен простым путем обеспечивать возможность выделения природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл даже при содержании в ней неконъюгированных липофильных соединений в варьирующихся и при определенных условиях повышенных количествах. Задача настоящего изобретения состояла далее в разработке оптимального способа твердофазной экстракции, получаемая которым природная смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов имела бы высокое содержание в ней действующих веществ и удовлетворяла бы установленным фармацевтическим спецификациям, прежде всего касательно соблюдения предельных значений содержания в ней конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества.

Для решения указанных задач согласно изобретению был разработан способ, который неожиданно простым путем позволяет выделять из МЖК даже при содержании в ней неконъюгированных липофильных соединений в варьирующихся и при определенных условиях повышенных количествах практически не содержащую крезол и ГФМФ смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая одновременно с этим в значительной степени обеднена также неконъюгированными липофильными соединениями, прежде всего неконъюгированными флавоноидными, изофлавоноидными и норизопреноидными производными.

Предлагаемый в изобретении способ касательно его наиболее важных стадий основан на описанном в WO 98/08526 способе, который предназначен для выделения из МЖК обедненной ее фенольными компонентами природной смеси конъюгированных эстрогенов. Помимо этого предлагаемый в изобретении способ основан на описанном в WO 03/048183 способе, который позволяет выделять даже из состарившейся МЖК, которая характеризуется при определенных условиях повышенным относительным содержанием в ней свободных эстрогенов, природную смесь конъюгированных эстрогенов, которая удовлетворяет необходимым фармацевтическим спецификациям.

В соответствии с этим в изобретении предлагается способ выделения природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, при осуществлении которого

а) мочу, которая представляет собой мочу, из которой необязательно удалены слизь и твердые вещества, сгущенный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи ее сгущенный ретентат (вещество, не прошедшее через мембранный фильтр), вводят в контакт с полимерной адсорбирующей смолой в достаточном для адсорбции содержащейся в моче смеси конъюгированных эстрогенов количестве и насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу отделяют от остальной мочи,

б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, прежде всего на 12,5-14,0,

в) необязательно проводят промежуточную промывку, при которой насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу промывают водой,

г) промытую адсорбирующую смолу вводят в контакт с элюентом в достаточном для десорбции адсорбированной смолой смеси конъюгированных эстрогенов количестве и

д) содержащий природную смесь конъюгированных эстрогенов элюат отделяют от адсорбирующей смолы и необязательно сгущают

и который отличается от известного из уровня техники способа тем, что полученная природная смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов обеднена фенольными компонентами мочи и неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями, а также тем, что в качестве элюента на стадии г) используют одно- или двухфазную смесь, содержащую

(I) воду с необязательно установленным на щелочное значением рН,

(II) по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из указанной выше группы не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель и необязательно

(III) по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей, и

в том случае, если полученный на стадии д), необязательно сгущенный элюат представляет собой двухфазную смесь, от полученного, состоящего из двух фаз элюата на стадии е) отделяют водную фазу с получением содержащей природную смесь конъюгированных эстрогенов водной фазы, которую необязательно концентрируют.

Подготовительная переработка партий исходного материала на известных как таковых стадиях а), б), г) и д), а также применение полученного на стадии д) элюата, содержащего природную смесь конъюгированных эстрогенов, в целом уже описаны в WO 98/08526 в качестве стадий а), b) и с) и тем самым известны специалистам в данной области из этой публикации. Известная как таковая стадия в) предлагаемого в изобретении способа в целом описана в WO 03/048183 в качестве стадии "промежуточной промывки" и тем самым известна специалистам в данной области из этой публикации. В соответствии с этим содержание указанных публикаций WO 98/08526 и WO 03/048183 в полном объеме включено в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительные детали касательно общей методики проведения процесса и используемых при этом материалов в обобщенном виде представлены в настоящем описании в разделе, в котором рассматриваются примеры осуществления изобретения.

Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа могут использоваться указанные в WO 98/08526 семиполярные, прежде всего неионогенные семиполярные, адсорбирующие смолы. Помимо этого при осуществлении предлагаемого в изобретении способа можно, что является неожиданным фактом, использовать и иные адсорбирующие смолы без ухудшения качества получаемого продукта, соответственно без ущерба для его обязательного соответствия фармацевтическим спецификациям. Так, в частности, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве адсорбентов можно использовать полимерные адсорбирующие смолы. Подобные полимерные адсорбирующие смолы, которые могут использоваться при осуществлении предлагаемого в изобретении способа, более подробно рассмотрены в последующем описании в разделе, в котором рассматриваются примеры осуществления изобретения.

Согласно изобретению предлагаемым в нем способом получают природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая обеднена не только фенольными компонентами мочи, такими как крезолы и ГФМФ, но и неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями.

Для этого после проведения известных как таковых стадий а)-в) промытую на стадии г), насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу обрабатывают элюентом в достаточном для элюирования смеси конъюгированных эстрогенов количестве. Согласно изобретению с этой целью в качестве элюента на стадии г) используют одно- или двухфазную смесь, которая содержит

(I) воду с необязательно установленным на щелочное значением рН,

(II) по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимых с ними неконъюгированных соединений не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель и необязательно

(III) по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве элюента на стадии г) используют одно- или двухфазную смесь, которая содержит

(I) воду с необязательно установленным на щелочное значением рН,

(II) по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель и

(III) по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей.

Используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь содержит воду (I) с необязательно установленным на щелочное значением рН.

При использовании на стадии г) в качестве элюента однофазной смеси значение рН подобных содержащих воду элюентов лежит в нейтральном или щелочном диапазоне, достигая 13, и в предпочтительном варианте может составлять от 7 до 10. В качестве растворителей в составе содержащего воду элюента следует применять стабильные в используемом диапазоне значений рН растворители. Значение рН содержащего воду однофазного элюента устанавливают на требуемое добавлением соответствующего количества растворимого в воде инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, прежде всего гидроксида натрия.

При использовании же на стадии г) в качестве элюента двухфазной смеси значение рН водной фазы подобных элюентов лежит после тщательного перемешивания обеих фаз в нейтральном или щелочном диапазоне, достигая 13, и в предпочтительном варианте может составлять от 7 до 10. Если водная фаза подобных двухфазных элюентов содержит органический растворитель, то в качестве него следует применять стабильные в используемом диапазоне значений рН растворители. Значение рН водной фазы двухфазных элюентов устанавливают на требуемое добавлением соответствующего количества растворимого в воде инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, прежде всего гидроксида натрия.

Используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь наряду с необязательно подщелаченной водой (I) содержит также по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимых с ними неконъюгированных соединений органический растворитель (II). Такой органический растворитель (II), кроме того, должен быть не смешивающимся или практически не смешивающимся с водой, при этом выражение "практически не смешивающийся" означает, что в водной фазе допускается наличие максимум 6 об.% растворенного в ней органического растворителя. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве пригодных для элюирования неконъюгированных липофильных соединений органических растворителей (II) могут использоваться, например, следующие органические растворители с 1-10 атомами углерода, которые могут быть расположены в виде прямой или разветвленной цепи либо в виде цикла: спирты с С₄-С₁₀ (как, например, бутанол, гексанол, циклогексанол и пентанол), эфиры кислот с С₂-С₁₀ (как, например, этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), метилацетат, пропилацетат, изопропилацетат (изопропиловый эфир уксусной кислоты), бутилацетат, амилацетат, этилметилмалонат, диметилфосфонат), альдегиды с С₃-С₁₀ и кетоны с С₄-С₁₀ (как, например, бутанон, пентанон, гексан-2,4-дион, гександиал, циклогексанкарбальдегид, бутан-1,2,4-трикарбальдегид, метилфенилкетон и аналогичные соединения), соответственно в целом С₃-С₁₀алкоксисоединения, простые эфиры с С₂-С₁₀ (диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир), нитрилы с С₃-С₆ и галоалканы с С₁-С₃ (метиленхлорид), а также смеси вышеуказанных растворителей. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве пригодных для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающихся или практически не смешивающихся с водой органических растворителей (II) прежде всего могут использоваться С₁-С₄алкиловые эфиры уксусной кислоты, бутанол, циклогексанол, гексанол, диэтиловый эфир, метиленхлорид, метил-трет-бутиловый эфир и смеси указанных растворителей. Среди этих растворителей предпочтительными для применения при осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве пригодных для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающихся или практически не смешивающихся с водой органических растворителей (II) являются С₁-С₄алкиловые эфиры уксусной кислоты и прежде всего этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) и/или изопропиловый эфир уксусной кислоты (изопропилацетат).

Используемая согласно изобретению в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь необязательно может содержать также по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель (III), выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей. К простым эфирам, которые могут использоваться в составе элюента, относятся смешивающиеся с водой циклические простые эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, а также смешивающиеся с водой простые эфиры с открытой цепью, такие, например, как диметиловый эфир этиленгликоля (моноглим), диметиловый эфир диэтиленгликоля (диглим) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших алканолов можно использовать смешивающиеся с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3, атомами углерода, прежде всего этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов можно использовать смешивающиеся с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, прежде всего ацетон. В качестве наиболее эффективных зарекомендовали себя далее элюенты, в которых смешивающимся с водой органическим растворителем (III) является ацетон, этанол или смесь ацетона с этанолом.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь наряду с необязательно подщелаченной водой (I) содержит в качестве пригодного для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя (II) С₁-С₄алкиловый эфир уксусной кислоты, предпочтительно этиловый эфир уксусной кислоты и/или изопропиловый эфир уксусной кислоты, а в качестве смешивающегося с водой органического растворителя (III) содержит ацетон и/или этанол.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь наряду с необязательно подщелаченной водой (I) содержит в качестве пригодного для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя (II) этиловый эфир уксусной кислоты, а в качестве смешивающегося с водой органического растворителя (III) содержит ацетон.

В используемой в качестве элюента на стадии г) предлагаемого в изобретении способа одно- или двухфазной смеси объемное соотношение между водой (I) и не смешивающимся или практически не смешивающимся с водой органическим растворителем (II) может составлять от 5:1 до 1:5, однако наиболее целесообразно применять их в объемном соотношении от 2:1 до 1:2.

Помимо этого в используемой в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазной смеси объемное соотношение между водой (I) и смешивающимся с водой органическим растворителем (III) может составлять от 4:1 до 1:5; однако предпочтительно применять их в объемном соотношении от 2:1 до 1:3.

В используемой в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазной смеси объемное соотношение между суммарным объемом, складывающимся из объема воды (I) и объема не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя (II), и объемом смешивающегося с водой органического растворителя (III) может составлять от 5:1 до 1:5, предпочтительно от 2:1 до 1:2.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь состоит из (I) воды, из (II) С₁-С₄алкилового эфира уксусной кислоты, предпочтительно этилового эфира уксусной кислоты и/или изопропилового эфира уксусной кислоты, в качестве не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя и из (III) ацетона и/или этанола в качестве смешивающегося с водой органического растворителя при объемном соотношении между ними в интервале от 1:1:1 до 1:1:2. На стадии г) в качестве элюента прежде всего предлагается использовать однофазную смесь, которая состоит из (I) воды, из (II) этилового эфира уксусной кислоты в качестве не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя и из (III) ацетона в качестве смешивающегося с водой органического растворителя при объемном соотношении между ними 1:1:1,4.

При использовании в качестве элюента на стадии г) двухфазной смеси обе фазы рекомендуется тщательно перемешивать между собой непосредственно перед внесением в колонку.

Элюент можно использовать в количестве, которое составляет примерно от 3 до 10, прежде всего примерно от 4 до 6, объемов слоя на один объем слоя полимерной адсорбирующей смолы. Элюент целесообразно пропускать через содержащий насыщенную смесью эстрогенов адсорбирующую смолу реактор с такой скоростью или с таким расходом, чтобы адсорбирующая смола оставалась в контакте с элюентом в течение достаточного для полного элюирования смеси конъюгированных эстрогенов промежутка времени. При использовании в качестве элюента однофазной смеси из воды, этилового эфира уксусной кислоты и ацетона в объемном соотношении между ними, равном 10:10:14, элюент можно пропускать через реактор, например, с расходом, составляющим от 3 до 10 об. частей, предпочтительно от 5 до 7, об. частей, на 1 об. часть адсорбирующей смолы в час. Процесс элюирования целесообразно проводить при температуре в интервале от примерно 20 до примерно 60°С, предпочтительно от примерно 30 до 50°С. При необходимости расход элюента через реактор можно регулировать проведением процесса при слегка повышенном давлении, например при давлении, превышающем окружающее давление на величину, достигающую 0,2 бара, и собирать элюат несколькими фракциями.

Содержание конъюгированных эстрогенов, фенольных компонентов мочи, таких как крезолы и ГФМФ, и неконъюгированных липофильных соединений в отдельных фракциях элюата можно определять известным методом с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (сокращенно ЖХВР) или же с помощью газовой хроматографии (сокращенно ГХ).

В процессе элюирования сначала на стадии д) получают практически не содержащую эстрогенов первую фракцию, которая имеет слабо выраженную окраску, соответственно вовсе не имеет цвета и количество которой в целом соответствует примерно одному объему слоя. Основное же количество конъюгированных эстрогенов, составляющее, например, от 80 до 99% от всего количества конъюгированных эстрогенов, присутствующих в исходной МЖК, находится в последующих основных фракциях элюата, окраска которых меняется от темно-желтой до коричневой и количество которых в целом соответствует 2-4 объемам слоя. В получаемых в последующем последних фракциях конъюгированные эстрогены содержатся в целом лишь в следовых количествах. При получении последних фракций, содержание в которых конъюгированных эстрогенов все еще превышает 10 мас.% в пересчете на массу сухого вещества, а содержание крезолов и ГФМФ составляет менее 0,6 мас.% в пересчете на массу сухого вещества, эти фракции можно объединять для последующей переработки с основным элюатом с высоким содержанием в нем эстрогенов.

Получаемый на стадии д) элюат может представлять собой одно- или двухфазную смесь. При использовании в качестве элюента однофазной смеси элюат в результате вытеснения имеющейся перед элюированием на колонке с адсорбирующей смолой воды из колонки и обусловленного этим смещения объемного соотношения между водной и органической фазами также может состоять их двух фаз. Получаемый на стадии д) одно- или двухфазный элюат можно при необходимости подвергать известным методом до