Фармацевтическая композиция, содержащая fc-область иммуноглобулина в качестве носителя

Фармацевтическая композиция, содержащая fc-область иммуноглобулина в качестве носителя

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому использованию Fc-фрагмента иммуноглобулина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей Fc-фрагмент иммуноглобулина в качестве носителя, и к способу увеличения продолжительности in vivo действия лекарственного средства, связанного с Fc-фрагментом иммуноглобулина.

Предшествующий уровень техники

Ранее многими фармакологами и химиками были предприняты попытки химического изменения и/или модификации in vivo активности природных физиологически активных молекул. Эти попытки были направлены, главным образом, на усиление in vivo активности или увеличение времени действия физиологически активных молекул, а также на снижение токсичности, устранение или уменьшение побочных эффектов или на модификацию специфической физиологической активности физиологически активных веществ. Если физиологически активное вещество является химически модифицированным, то в большинстве случаев оно теряет некоторую или большую часть своей физиологической активности. Однако в некоторых случаях такая модификация может приводить к увеличению или изменению физиологической активности. В этой связи многие исследования были направлены на химическую модификацию, с помощью которой можно было бы достичь нужной физиологической активности, а большинство таких исследований было направлено на ковалентное связывание физиологически активного вещества (лекарственного средства) с физиологически приемлемым носителем.

Так, например, в публикации Международной патентной заявки № WO 01/93911 описан полимер, имеющий множество кислотных групп в качестве носителя лекарственного средства. В публикации Международной патентной заявки № WO 03/00778 описаны содержащие анионогенную группу амфифильные блоксополимеры, которые, при их использовании в качестве носителя для катионогенного лекарственного средства, повышают стабильность такого лекарственного средства. В Европейском патенте № 0681481 описан метод улучшения свойств основных лекарственных средств с использованием циклодекстрина и кислот в качестве носителей. С другой стороны, гидрофобные лекарственные средства обладают низкой стабильностью in vivo, что обусловлено, главным образом, их низкой степенью растворимости в воде. В публикации Международной патентной заявки № WO 04/064731 сообщалось, что для улучшения растворимости гидрофобных лекарственных средств в воде в качестве носителя использовали липид. Однако до настоящего времени не появлялось каких-либо сообщений об использовании Fc-фрагмента иммуноглобулина в качестве носителя лекарственного средства.

Обычно, поскольку полипептиды имеют тенденцию к относительно быстрому разложению, что обусловлено их низкой стабильностью, расщеплением протеолитическими ферментами в крови и свободным прохождением через почки или печень, то белковые лекарственные препараты, содержащие такие полипептиды в качестве фармацевтически эффективных компонентов, должны часто вводиться пациентам для поддержания нужного уровня их концентраций и титров в крови. Однако частое введение белковых лекарственных препаратов, особенно путем инъекции, вызывает боли у пациентов. Для решения этой проблемы было предпринято множество попыток повысить стабильность белковых лекарственных средств в сыворотке и добиться поддержания высоких уровней лекарственных средств в крови в течение длительного периода времени и таким образом максимизировать фармацевтическую эффективность указанных лекарственных средств. Поэтому возникла необходимость в получении фармацевтических композиций с пролонгированной активностью, которые обеспечивали бы высокую стабильность белковых лекарственных средств и поддержание их титров на достаточно высоких уровнях, не вызывая при этом нежелательных иммунных ответов у пациентов.

Для стабилизации белков и предотвращения их преждевременного ферментативного расщепления и выведения почками обычно, в целях химической модификации поверхности белкового лекарственного средства, используют полимер, обладающий высокой растворимостью, такой как полиэтиленгликоль (далее называемый просто "ПЭГ"). ПЭГ, благодаря своему связыванию со специфическими или различными областями белка-мишени, стабилизирует белок и предотвращает его гидролиз, не вызывая при этом каких-либо серьезных побочных эффектов (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139, 1991). Однако это присоединение ПЭГ, несмотря на его способность повышать стабильность белка, связано с такими проблемами, как значительное снижение титров физиологически "активных" белков. Кроме того, с увеличением молекулярной массы ПЭГ уменьшается выход белка, что обусловлено снижением реакционной способности белков.

Недавно были предложены конъюгаты "полимер-белковое лекарственное средство". Так, например, как описано в патенте США № 5738846, для повышения активности белкового лекарственного средства конъюгат может быть получен путем присоединения идентичных белковых лекарственных средств к обоим концам ПЭГ. Кроме того, как описано в публикации Международной патентной заявки WO 92/16221, к обоим концам ПЭГ могут быть присоединены два различных белковых лекарственных средства с получением конъюгата, обладающего двумя различными активностями. Однако вышеуказанные методы оказались не очень эффективными для сохранения уровня активности белковых лекарственных средств.

С другой стороны, в работе Kinstler и др. сообщалось, что гибридный белок, полученный путем связывания гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) с человеческим альбумином, обладал более высокой стабильностью (Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12):1883-1888, 1995). Однако в этой публикации указывалось, что поскольку модифицированное лекарственное средство, имеющее структуру "ГКСФ-ПЭГ-альбумин", обнаруживало примерно только четырехкратное увеличение времени его пребывания в организме и лишь небольшое увеличение времени полужизни в сыворотке, по сравнению с нативным ГКСФ, то промышленное производство такого лекарственного средства в качестве эффективного белкового препарата пролонгированного действия не является целесообразным.

Альтернативный методом повышения in vivo стабильности физиологически активных белков предусматривает присоединение гена физиологически активного белка к гену, кодирующему белок, обладающий высокой стабильностью в сыворотке, посредством генетической рекомбинации, и культивирование клеток, трансфецированных таким рекомбинантным геном, с получением гибридного (слитого) белка. Так, например, гибридный белок может быть получен путем конъюгирования альбумина, белка, который, как известно, является наиболее эффективным для повышения стабильности белка, или его фрагмента с представляющим интерес физиологически активным белком посредством генетической рекомбинации (публикация Международной патентной заявки № WO 93/15199 и WO 93/15200, публикация Европейской патентной заявки № 413622). Время полужизни гибридного белка интерферона-альфа и альбумина, полученного компанией Human Genome Science Company и поставляемого под торговым знаком Albuferon^TM, было увеличено с 5 часов до 93 часов у обезьян, однако проблема заключалась в том, что такое увеличение времени полужизни приводило к снижению активности in vivo до менее чем 5% по сравнению с немодифицированным интерфероном-альфа (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2):540-548, 2002).

Для присоединения белкового лекарственного средства к Fc-фрагменту иммуноглобулина была использована техника рекомбинантных ДНК. Так, например, интерферон (публикация выложенной корейской патентной заявки № 2003-9464) и рецептор интерлейкина-4, рецептор интерлейкина-7 или рецептор эритропоэтина (ЕРО) (Корейский патент, регистрационный номер № 249572) были предварительно экспрессированы у млекопитающих в форме гибрида с Fc-фрагментом иммуноглобулина. В публикации Международной патентной заявки № WO 01/03737 описан гибридный белок, содержащий цитокин или фактор роста, связанные с Fc-фрагментом иммуноглобулина посредством пептидной связи. Кроме того, в патенте США № 5116964 описаны белки, присоединенные к амино-концу или к карбокси-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина посредством генетической рекомбинации. В патенте США № 5349053 описан гибридный белок, содержащий IL-2, присоединенный к Fc-фрагменту иммуноглобулина посредством пептидной связи. Другими примерами Fc-гибридных белков, полученных посредством генетической рекомбинации, являются гибридный белок интерферона-бета или его производного и Fc-фрагмента иммуноглобулина (публикация Международной патентной заявки № WO 00/23472) и гибридный белок рецептора IL-5 и Fc-фрагмента иммуноглобулина (патент США № 5712121), гибридный белок интерферона-альфа и Fc-фрагмента иммуноглобулина G4 (патент США № 5723125) и гибрид белка CD4 и Fc-фрагмента иммуноглобулина G2 (патент США № 6451313).

Известны также методы, предусматривающие модификацию аминокислотных остатков Fc-фрагмента иммуноглобулина. Так, например, в патенте США № 5605690 описан гибридный белок TNFR-Fc IgG1, который был получен путем генетической рекомбинации с использованием Fc-фрагмента IgG1, имеющего аминокислотные альтерации в комплемент-связывающей области или в области связывания с рецептором. Кроме того, другие методы получения гибридного белка с использованием Fc-фрагмента иммуноглобулина, модифицированного посредством генетической рекомбинации, описаны в патентах США №№ 6277375, 6410008 и 6444792.

Кроме того, описанные Fc-гибридные белки, продуцированные посредством генетической рекомбинации, имеют следующие недостатки: такой гибридный белок присутствует только в специфической области Fc-фрагмента иммуноглобулина, которая расположена у амино- или у карбокси-конца; продуцируются лишь гомодимерные, а не мономерные формы этого белка; и такой гибрид может находиться только между гликозилированными белками или между агликозилированными белками, и невозможно получить такой гибридный белок, который состоял бы из гликозилированного белка и агликозилированного белка. Кроме того, новая аминокислотная последовательность, созданная путем слияния, может индуцировать иммунные ответы, а линкерная область может оказаться восприимчивой к протеолитическому расщеплению.

Для решения этих проблем авторами настоящей заявки было проведено исследование, в результате которого было установлено, что при введении лекарственного средства в форме гибрида с Fc-фрагментом IgG такое лекарственное средство имеет повышенную стабильность in vivo при минимальном снижении in vivo активности.

Раскрытие изобретения

Учитывая вышеизложенное, задачей настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей Fc-фрагмент иммуноглобулина в качестве носителя.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа увеличения продолжительности действия in vivo лекарственного средства путем включения в него Fc-фрагмента иммуноглобулина в качестве носителя.

Краткое описание чертежей

Вышеуказанные и другие задачи, а также отличительные признаки и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из нижеследующего подробного описания, сопровождаемого графическим материалом, где:

на фиг.1 представлены результаты хроматографии Fc-фрагмента иммуноглобулина, полученного путем расщепления иммуноглобулина папаином;

на фиг.2 представлены результаты электрофореза в ДСН-ПААГ очищенного Fc-фрагмента иммуноглобулина (М: маркер молекулярной массы, дорожка 1: IgG; дорожка 2: Fc);

на фиг.3 представлены результаты электрофореза в ДСН-ПААГ для конъюгатов: (А) IFNα-ПЭГ-Fc, (В) ¹⁷Ser-КГСФ-ПЭГ-Fc и (С) ЕРО-ПЭГ-Fc, которые были продуцированы путем реакции связывания (М: маркер молекулярной массы, дорожка 1: Fc, дорожка 2: физиологически активный белок, дорожка 3: конъюгат физиологически активный белок-ПЭГ-Fc);

на фиг.4 представлены результаты эксклюзионной хроматографии конъюгата IFNα-ПЭГ-Fc, очищенного после реакции связывания;

на фиг.5 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF конъюгата ЕРО-ПЭГ-Fc;

на фиг.6а и 6b представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF и ДСН-ПААГ-анализа соответственно нативного Fc-фрагмента иммуноглобулина и дегликозилированного Fc-фрагмента иммуноглобулина (DG Fc);

на фиг. 7 представлены результаты масс-спектрометрии MALDI-TOF конъюгата IFNα-ПЭГ-Fc и конъюгата IFNα-ПЭГ-DG-Fc;

на фиг. 8а-8с представлены результаты обращенно-фазовой ВЭЖХ конъюгатов IFNα-ПЭГ-Fc, IFNα-ПЭГ-DG-Fc и IFNα-ПЭГ-производное Fc-фрагмента рекомбинантного AG;

на фиг.9 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа нативного IFNα, комплекса IFNα-40К ПЭГ, конъюгата IFNα-ПЭГ-альбумина и конъюгата IFNα-ПЭГ-Fc;

на фиг.10 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа нативного ЕРО, в высокой степени гликозилированного ЕРО, конъюгата ЕРО-ПЭГ-Fc и конъюгата ЕРО-ПЭГ-AG-Fc;

на фиг.11 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа конъюгатов IFNα-ПЭГ-Fc, IFNα-ПЭГ-DG-Fc и IFNα-ПЭГ-производное рекомбинантного AG-Fc;

на фиг.12 представлен график, иллюстрирующий результаты фармакокинетического анализа Fab', комплекса Fab'-S-40K-ПЭГ, конъюгата Fab'-N-ПЭГ-N-Fc и конъюгата Fab'-S-ПЭГ-N-Fc;

на фиг.13 представлен график, иллюстрирующий in vivo-активности Fab', комплекса Fab'-S-40K-ПЭГ, конъюгата Fab'-N-ПЭГ-N-Fc и конъюгата Fab'-S-ПЭГ-N-Fc;

на фиг.14 представлен график, иллюстрирующий результаты сравнения аффинности связывания человеческих иммуноглобулинов подкласса IgG с комплементом C1q;

на фиг.15 представлен график, иллюстрирующий результаты сравнения аффинности связывания гликозилированного Fc, ферментативно дегликозилированного (DG) Fc и конъюгата интерферон-ПЭГ-носитель, где носителем является неглигозилированный (AG) Fc, продуцируемый E.coli, с комплементом C1q.

Осуществление изобретения

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей Fc-фрагмент иммуноглобулина в качестве носителя.

Используемый здесь термин "носитель" означает вещество, связанное с лекарственным средством, которое обычно повышает, снижает или нейтрализует физиологическую активность лекарственного средства путем его связывания с указанным лекарственным средством. Однако в целях осуществления настоящего изобретения носитель используется для минимизации снижения физиологической активности представляющего интерес лекарственного средства, связанного с указанным носителем, и для увеличения in vivo стабильности этого лекарственного средства.

Настоящее изобретение отличается тем, что для достижения его задач в настоящем изобретении в качестве носителя используется Fc-фрагмент иммуноглобулина.

Fc-фрагмент иммуноглобулина является безопасным для использования в качестве носителя лекарственного средства, поскольку он представляет собой биологически разлагаемый полипептид, который подвергается метаболизму в организме. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина имеет относительно низкую молекулярную массу по сравнению с целыми молекулами иммуноглобулина, что делает его предпочтительным с точки зрения получения, очистки и выхода конъюгата. Кроме того, поскольку Fc-фрагмент иммуноглобулина не содержит Fab-фрагмента, аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотных последовательностей антител других подклассов и который поэтому является в высокой степени негомогенным, то этот Fc-фрагмент может значительно повышать степень гомогенности веществ и является менее антигенным.

Используемый здесь термин "Fc-фрагмент иммуноглобулина" означает белок, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (С_Н2) и константную область 3 тяжелой цепи (С_Н3) иммуноглобулина и не содержит вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, константной области 1 тяжелой цепи (С_Н1) и константной области 1 легкой цепи (С_L1) иммуноглобулина. Кроме того, он может содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи. Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может также содержать часть константной области 1 тяжелой цепи (С_Н1) или всю эту область и/или часть константной области 1 легкой цепи (С_L1) или всю эту область, за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Кроме того, в том случае, если Fc-фрагмент иммуноглобулина обладает физиологической функцией, в основном, аналогичной физиологической функции нативного белка, или лучшей физиологической функцией, чем нативный белок, то таким Fc-фрагментом IgG может быть фрагмент, имеющий делецию в относительно длинной части аминокислотной последовательности С_Н2 и/или С_Н3. То есть Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать (1) домен С_Н1, домен С_Н2, домен С_Н3 и домен С_Н4, (2) домен С_Н1 и домен С_Н2, (3) домен С_Н1 и домен С_Н3, (4) домен С_Н2 и домен С_Н3, (5) комбинацию одного или нескольких доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части такой шарнирной области) и (6) димер каждого из этих доменов константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и производные этой последовательности (мутанты). Производной аминокислотной последовательностью является последовательность, отличающаяся от нативной аминокислотной последовательности тем, что она включает делецию, инсерцию, не-консервативную или консервативную замену одного или нескольких аминокислотных остатков или их комбинации. Так, например, в Fc IgG аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, играют важную роль в связывании, могут быть использованы в качестве подходящей мишени для модификации. Кроме того, могут быть использованы и другие различные производные, включая производные, в которых либо делетирована область, способная образовывать дисульфидную связь, либо элиминированы некоторые аминокислотные остатки, которые обычно присутствуют у N-конца нативной Fc-формы, либо добавлен метиониновый остаток. Кроме того, для ингибирования эффекторных функций может быть осуществлена делеция в комплемент-связывающем сайте, таком как C1q-связывающий сайт и ADCC-сайт. Методы получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина описаны в публикациях Международных патентных заявок №№ WO 97/34631 и WO 96/32478.

Аминокислотные замены в белках и пептидах, которые, в основном, не влияют на активность таких белков или пептидов, известны специалистам (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly и наоборот.

Кроме того, Fc-фрагмент, если это необходимо, может быть модифицирован путем фосфорилирования, сульфирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и т.п.

Вышеупомянутыми производными Fc являются производные, которые обладают биологической активностью, идентичной активности Fc-фрагмента настоящего изобретения, или обладают повышенной структурной устойчивостью, например, к нагреванию, к изменению рН или т.п.

Кроме того, эти Fc-фрагменты могут быть получены из нативных форм, выделенных у человека и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс и морских свинок, либо они могут быть их рекомбинантами или производными, полученными из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В соответствии с настоящим изобретением они могут быть получены из нативного иммуноглобулина путем выделения целых иммуноглобулинов из организма человека или животного и их обработки протеолитическим ферментом. Папаин гидролизует нативный иммуноглобулин на Fab- и Fc-фрагменты, а обработка пепсином приводит к продуцированию pF'c- и F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты могут быть подвергнуты, например, эксклюзионной хроматографии для выделения Fc или pF'c.

Человеческим Fc-фрагментом предпочтительно является рекомбинантный Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный из микроорганизма.

Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может присутствовать в форме, имеющей обычно присущее ей число сахарных цепей, или в форме, имеющей повышенное число сахарных цепей по сравнению с нативной формой или пониженное число сахарных цепей по сравнению с нативной формой, либо он может присутствовать в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение или удаление сахарных цепей Fc-фрагмента иммуноглобулина может быть достигнуто методами, известными специалистам, такими как химический метод, ферментативный метод и метод генной инженерии с использованием микроорганизма. Удаление сахарных цепей из Fc-фрагмента приводит к резкому снижению аффинности связывания с C1q-частью первого компонента комплемента С1, а также к снижению или к потере антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), не индуцируя при этом нежелательных иммунных ответов in vivo. В этой связи следует отметить, что Fc-фрагмент иммуноглобулина в дегликозилированной или негликозилированной форме может оказаться более подходящим для использования в настоящем изобретении в качестве носителя лекарственного средства.

Используемый здесь термин "дегликозилирование" означает ферментативное удаление сахарных групп из Fc-фрагмента, а термин "агликозилирование" означает, что Fc-фрагмент был продуцирован в негликозилированной форме прокариотом, предпочтительно E.coli.

С другой стороны, Fc-фрагмент иммуноглобулина может происходить от человека или от других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс и морских свинок, а предпочтительно от человека. Кроме того, Fc-фрагментом иммуноглобулина может быть Fc-фрагмент, происходящий от IgG, IgA, IgD, IgE и IgM или полученный из их комбинаций или гибридов. Предпочтительно, если этот Fc-фрагмент происходит от иммуноглобулинов IgG или IgM, которые среди прочих белков присутствуют в наибольшем количестве в крови человека, а наиболее предпочтительно, если он происходит от IgG, который, как известно, увеличивает время полужизни связывающихся с лигандом белков.

С другой стороны, используемый здесь термин "комбинация" означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-области иммуноглобулина того же самого происхождения, присоединены к одноцепочечному полипептиду другого происхождения и образуют димер или мультимер. То есть димер или мультимер могут быть образованы из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из Fc-фрагментов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

Используемый здесь термин "гибрид" означает, что последовательности, кодирующие два или более Fc-фрагментов иммуноглобулина различного происхождения, присутствуют в одноцепочечном Fc-фрагменте иммуноглобулина. В настоящем изобретении могут быть использованы различные типы гибридов. То есть гибриды доменов могут состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из СН1, СН2, СН3 и СН4 Fc-фрагментов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и могут включать шарнирную область.

С другой стороны, IgG подразделяется на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, а наиболее предпочтительным является Fc-фрагмент IgG4, который редко обладает эффекторными функциями, такими как CDC (комплемент-зависимая цитотоксичность) (см. фиг.14 и 15).

Таким образом, в качестве носителя лекарственного средства по настоящему изобретению наиболее предпочтительным Fc-фрагментом иммуноглобулина является негликозилированный Fc-фрагмент, происходящий от человеческого IgG4. Человеческий Fc-фрагмент является более предпочтительным, чем Fc-фрагмент, происходящий от другого источника, который может действовать в организме человека как антиген и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как вырабатывание нового антитела против антигена.

Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению, полученный, как описано выше, действует как носитель лекарственного средства и образует конъюгат с этим лекарственным средством.

Используемый здесь термин "конъюгат лекарственного средства" или "конъюгат" означает, что одно или несколько лекарственных средств связаны с одним или несколькими Fc-фрагментами иммуноглобулина.

Используемый здесь термин "лекарственное средство" означает вещество, обладающее терапевтической активностью при его введении человеку или животному, и примерами такого лекарственного средства являются, но не ограничиваются ими, полипептиды, соединения, экстракты и нуклеиновые кислоты. При этом предпочтительным является полипептидное лекарственное средство.

Используемые здесь термины "физиологически активный полипептид", "физиологически активный белок", "активный полипептид", "полипептидное лекарственное средство" и "белковое лекарственное средство" являются взаимозаменяемыми и отличаются тем, что, присутствуя в физиологически активной форме, они обладают различными физиологическими функциями in vivo.

Полипептидное лекарственное средство имеет тот недостаток, что оно неспособно поддерживать физиологическое действие в течение длительного периода времени, что обусловлено присущим ему свойством легко денатурироваться или разлагаться под действием протеолитических ферментов, присутствующих в организме. Однако, если полипептидное лекарственное средство присоединяют к Fc-фрагменту иммуноглобулина по настоящему изобретению с образованием конъюгата, то такое лекарственное средство обладает повышенной структурной стабильностью и увеличенным временем полужизни до разложения. Кроме того, полипептид, конъюгированный с Fc-фрагментом, гораздо меньше подвержен снижению физиологической активности, чем другие известные полипептидные лекарственные препараты. Поэтому, по сравнению с биологической доступностью in vivo стандартных полипептидных лекарственных средств, конъюгат по настоящему изобретению, состоящий из полипептида и Fc-фрагмента иммуноглобулина, отличается тем, что он обладает значительно лучшей биологической доступностью in vivo. Это также наглядно проиллюстрировано в описании вариантов осуществления изобретения. То есть при связывании с Fc-фрагментом иммуноглобулина по настоящему изобретению лекарственные средства на основе IFNα, ГКСФ, чГР и других белков обнаруживают примерно 2-6-кратное увеличение биологической доступности in vivo по сравнению с их стандартными формами, конъюгированными с одним ПЭГ или с ПЭГ и альбумином (таблицы 8, 9 и 10).

С другой стороны, конъюгат белка и Fc-фрагмента иммуноглобулина по настоящему изобретению отличается тем, что он не является гибридом, полученным стандартным рекомбинантным методом. В рекомбинантном методе гибридную форму Fc-фрагмента иммуноглобулина и активного полипептида, используемого в качестве лекарственного средства, получают так, чтобы указанный полипептид был присоединен к N-концу или С-концу Fc-фрагмента, в результате чего он экспрессируется и подвергается укладке как один полипептид, продуцируемый из нуклеотидной последовательности, кодирующей его гибридную форму.

Это приводит к резкому снижению активности полученного гибридного белка, поскольку активность белка как физиологически функционального вещества определяется конформацией этого белка. Таким образом, при присоединении полипептидного лекарственного средства к Fc-фрагменту рекомбинантным методом не наблюдается какого-либо влияния на биологическую доступность in vivo, даже если этот гибридный белок имеет повышенную структурную стабильность. Кроме того, поскольку такой гибридный белок часто имеет неправильную укладку, а поэтому экспрессируется в виде телец включения, то такой метод присоединения, применяемый для продуцирования белка и его выделения, является экономически невыгодным. Кроме того, если активная форма полипептида является гликозилированной, то такой полипептид должен экспрессироваться в эукариотических клетках. В этом случае Fc также является гликозилированным, и такое гликозилирование может индуцировать нежелательные иммунные ответы in vivo.

Таким образом, лишь применение настоящего изобретения позволяет получить конъюгат глигозилированного активного полипептида и агликозилированного Fc-фрагмента иммуноглобулина и позволяет решить все вышеуказанные проблемы, включая увеличение выхода белка, поскольку два компонента этого комплекса получают отдельно и выделяют с использованием самых эффективных систем.

Неограничивающими примерами белковых лекарственных средств, способных образовывать конъюгаты с Fc-фрагментом иммуноглобулина по настоящему изобретению, являются человеческий гормон роста, рилизинг-фактор гормона роста, пептид, высвобождающий гормон роста, интерфероны и рецепторы интерферона (например, интерферон-α, -β и -γ, водорастворимый рецептор интерферона 1 и т.п.), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), глюкагон-подобные пептиды (например, GLP-1 и т.п.), рецептор, связанный с G-белком, интерлейкины (например, интерлейкин-1,

-2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 и т.п.) и рецепторы интерлейкинов (например, рецептор IL-1, рецептор IL-4 и т.п.), ферменты (например, глюкоцереброзидаза, идуронат-2-сульфатаза, альфа-галактозидаза-А, агалсидаза-альфа и -бета, альфа-L-идуронидаза, бутирилхолинэстераза, хитиназа, глутамат-декарбоксилаза, имиглюцераза, липаза, уриказа, ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов, нейтральная эндопептидаза, миелопероксидаза и т.п.), интерлейкин- и цитокин-связывающие белки (например, IL-18bp, TNF-связывающий белок и т.п.), фактор активации макрофагов, пептид макрофага, В-клеточный фактор, Т-клеточный фактор, белок А, ингибитор аллергии, гликопротеины некроза клеток, иммунотоксин, лимфотоксин, фактор некроза опухоли, супрессоры опухолей, метастатический фактор роста, антитрипсин альфа-1, альбумин, альфа-лактальбумин, аполипопротеин-Е, эритропоэтин, высокогликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины, гемоглобин, тромбин, пептид, активирующий рецептор тромбина, тромбомодулин, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор IX, фактор XIII, фактор активации плазминогена, фибрин-связывающий пептид, урокиназа, стрептокиназа, гирудин, белок С, С-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутаза, лептин, тромбоцитарный фактор роста, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, фактор роста костей, белок, стимулирующий рост костей, кальцитонин, инсулин, атриопептин, фактор, индуцирующий образование хряща, элкатонин, фактор активации соединительной ткани, ингибитор пути тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, фактор высвобождения лютеинизирующего гормона, факторы роста нервной ткани (например, фактор роста нервной ткани, цилиарный нейротропный фактор, фактор-1 аксогенеза, натрийуретический пептид головного мозга, глиальный нейротропный фактор, нетрин, ингибитор нейтрофилов, нейротропный фактор, нейтурин и т.п.), паратиреоидный гормон, релаксин, секретин, соматомедин, инсулиноподобный фактор роста, адренокортикоидный гормон, глюкагон, холецистокинин, панкреатический полипептид, пептид высвобождения гастрина, рилизинг-фактор кортикотропина, тиреоид-стимулирующий гормон, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, рецепторы (например, TNFR(Р75), TNFR(Р55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор фактора активации В-клеток и т.п.), антагонисты рецепторов (например, IL-1-Ra и т.п.), антигены клеточной поверхности (например, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11а, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 и т.п.), антигены вирусных вакцин, моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, оцFv, Fab, Fab', F(ab')₂ и Fd) и вакцинные антигены, происходящие от вирусов. Фрагментом антитела могут быть фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, Fd или оцFv, способные связываться со специфическим антигеном, а предпочтительно фрагмент Fab'. Fab-фрагменты содержат вариабельный домен (V_L) и константный домен (С_L) легкой цепи и вариабельный домен (V_Н) и первый константный домен (С_Н1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они содержат несколько дополнительных аминокислотных остатков, включая один или несколько цистеиновых остатков шарнирной области со стороны карбокси-конца С_Н1-домена. Fd-фрагменты содержат только V_Н- и С_Н1-домены, а F(ab')₂-фрагменты продуцируются в виде пары Fab'-фрагментов, образуемых либо посредством дисульфидной связи, либо посредством химической реакции. оцFv-фрагменты (одноцепочечные Fv-фрагменты) содержат домены V_L и V_Н, которые связаны друг с другом посредством пептидного линкера, а поэтому присутствуют в одной полипептидной цепи.

В частности, предпочтительными физиологически активными полипептидами являются полипептиды, требующие частого введения в организм пациента для лечения или предупреждения заболеваний, и такими полипептидами являются человеческий гормон роста, интерфероны (интерферон-α, -β и -γ,), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин (ЕРО) и фрагменты антител. Кроме того, в объем физиологически активных пептидов по настоящему изобретению входят некоторые производные, при условии, что, по сравнению с нативными формами физиологически активных полипептидов, они имеют, в основном, аналогичные или улучшенные функции, структуры, активность или стабильность. Наиболее предпочтительным полипептидным лекарственным средством по настоящему изобретению является интерферон-альфа.

Помимо полипептидных лекарственных средств, в объем настоящего изобретения входят также и другие лекарственные средства. Неограничивающими примерами таких лекарственных средств являются антибиотики, выбранные из производных и смесей тетрациклина, миноциклина, доксициклина, офлоксацина, левофлоксацина, ципрофлоксацина, кларитромицина, эритромицина, цефаклора, цефотаксима, имипенема, пенициллина, гентамицина, стрептомицина, ванкомицина и т.п.; противораковые средства, выбранные из производных и смесей метотрексата, карбоплатина, таксола, цисплатина, 5-фторурацила, доксорубицина, этопозида, паклитаксела, камтотецина, арабинозида цитозина и т.п.; противовоспалительные средства, выбранные из производных и смесей индометацина, ибупрофена, кетопрофена, пироксикама, пробипрофена, диклофенака и т.п.; антивирусные средства, выбранные из производных и смесей ацикловира и робавина, и антибактериальные средства, выбранные из производных и смесей кетоконазола, итраконазола, флуконазола, амфотерицина В и гризеофульвина.

С другой стороны, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению способен образовывать конъюгат, связанный с лекарственным средством посредством линкера.

Таким линкером являются пептидный и не-пептидный линкеры. При этом предпочтительным является не-пептидный линкер, а более предпочтительным является не-пептидный полимер.

Используемый здесь термин "пептидный линкер" означает аминокислоты, а предпочтительно 1-20 аминокислот, которые линейно связаны друг с другом пептидной связью и могут присутствовать в гликозилированной форме. Для задач настоящего изобретения предпочтительно, чтобы они имели агликозилированную форму. Таким пептидным линкером предпочтительно является пептид, имеющий повторяющееся звено из аминокислот Gly и Ser, которые являются иммунологически не активными для Т-клеток.

Используемый здесь термин "не-пептидный полимер" означает биологически совместимый полимер, включающий два или более повторяющихся звена, связанных друг с другом ковалентной связью, за исключением пептидной связи. Примерами не-пептидного полимера являются полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловый спирт, полисахариды, декстран, поливиниловый эфир, биологически разлагаемые полимеры, такие как PLA (поли(молочная кислота)) и PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислоты), липидные полимеры, хитины и гиалуроновая кислота. Наиболее предпочтительным