Способ лечения и предупреждения потери костной ткани

Способ лечения и предупреждения потери костной ткани

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится в целом к ингибиторам 15-липоксигеназы и их применению для лечения и предупреждения потери костной ткани. Конкретно изобретение относится к применению ингибиторов 15-липоксигеназы для уменьшения потери костной ткани и/или усиления образования сетчатой структуры костной ткани.

Липоксигеназы представляют собой ферменты, содержащие железо, не входящее в состав гема, которые присутствуют в растениях и животных и катализируют окисление определенных полиненасыщенных жирных кислот, например, входящих в состав липидов и липопротеинов. Известно несколько различных липоксигеназ, каждая из которых отличается по окислительной активности. Липоксигеназы млекопитающих обозначают по положению в молекуле арахидоновой кислоты, в котором происходит окисление. 5-липоксигеназа превращает арахидоновую кислоту в 5-гидропероксиэйкозатетраеновую кислоту (5-ГПЭТЕ). Это представляет собой первую стадию метаболизма, приводящего к образованию 5-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (5-ГЭТЕ) и лейкотриенов (ЛТ). Аналогично этому 12- и 15-липоксигеназы превращают арахидоновую кислоту в 12- и 15-ГПЭТЕ соответственно. Восстановление биохимическим путем 12-ГПЭТЕ приводит к образованию 12-ГЭТЕ, в то время как 15-ГЭТЕ является предшественником класса соединений, известных как липоксины.

Другой ряд биологических воздействий связан с продуктами, обладающими липоксигеназной активностью, многие из которых являются медиаторами различных болезненных состояний. ЛТ С4 и D4 являются сильными констрикторами человеческой бронхиальной гладкой мышцы; ЛТ В4 и 5-ГЭТЕ, обнаруженные в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом, являются сильными хемотаксическими факторами воспалительных клеток, таких как полиморфонуклеарные лейкоциты (Green и Lambeth, Tetrahedron, 39, с.1687, 1983); были выявлены высокие уровни 12-ГЭТЕ в эпидермальной ткани пациентов, страдающих псориазом; было установлено, что липоксины стимулируют высвобождение присутствующего в лизосоме фермента и иона супероксида из нейтрофилов. Так, липоксигеназы играют важную роль в биосинтезе медиаторов астмы, аллергии, артрита, псориаза и воспаления, и ингибиторы этих ферментов прерывают путь биосинтеза, участвующий в развитии этих болезненных состояний.

Человеческая 15-липоксигеназа (15-ЛО) катализирует образование 15-S-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (15-S-ГЭТЕ) из арахидоновой кислоты (Kuhn и Borngraber, Lipoxygenases and Their Metabolites, изд-во Plenum Press, Нью-Йорк, 1999). У мышей синтез 15-8-ГЭТЕ осуществляется под воздействием 12/15-липоксигеназы (Alox15), которая представляет собой мышиный гомолог человеческой 15-ЛО. Мышиная 12/15-ЛО превращает арахидоновую кислоту в 12-(S)-гидроксиэйкозатетраеновую и 15-S-ГЭТЕ в соотношении 3:1 и, кроме того, она может превращать линолевую кислоту в 13-гидроксиоктадекадиеновую кислоту (13-ГОДЭ).

Ранее было установлено, что 15-липоксигеназа участвует в патогенезе некоторых заболеваний, включая атеросклероз (Harats и др., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., cc. 2100-2105, 2000), астму (Shannon и др., Am.Rev.Respir. Dis., 147, cc.1024-1028, 1993), рак (Shureiqi и др., JNCI, 92, cc.1136-1142, 2000) и гломерулонефрит (Montero и Badr, Exp. Neph., 8, cc.14-19, 2000). Были выявлены многочисленные классы соединений, которые обладают способностью ингибировать 15-липоксигеназу, в частности фенолы, гидроксамовые кислоты и ацетиленовые жирные кислоты (см. обзор Kuhn и Borngraber, Lipoxygenases and Their Metabolites, изд-во Plenum Press, Нью-Йорк, 1999). Эти агенты обладают различным спектром ингибирующей активности. Например, установлено, что нордигидрогвайаретовая кислота является ингибитором 5-и 15-липоксигеназы, установлено, что нафтилгидроксамовые кислоты ингибируют 5-, 12-и 15-липоксигеназу (US 4605669), и опубликованы данные о том, что бензофлуореновый ингибитор 15-липоксигеназы, PD 146176, обладает относительно специфичным действием в отношении 15-липоксигеназы (Sendobry и др., Br. J. Pharm., 120, cc.1199-1206, 1997). В опытах на мышах со специально созданной делецией гена Alox15 (Alox15 -/-) было установлено, что 15-липоксигеназа участвует в развитии атеросклероза. Первоначально было установлено, что такие мыши с дефицитом Alox15 обладают небольшим фенотипическими отличиями, включая повышенную активность присутствующей в них 5-ЛО (Sun и Funk, J. Biol. Chem., 271, cc.24055-24062, 1996). Однако нарушение Alox15 приводит к существенному уменьшению атеросклеротических повреждений у имеющих тенденцию к атеросклерозу мышей с дефицитом ароЕ (ароЕ -/-) (Cyrus и др., J. Clin Invest., 103, cc.1597-1604, 1999).

Хотя имеются данные о том, что 5-ЛО участвует в патогенезе некоторых заболеваний, биологическая функция мышиной или человеческой 15-липоксигеназы полностью не выявлена и не описано, что в клинических опытах установлена возможность применения ингибиторов 15-липоксигеназы для человека. В частности, до настоящего времени не описана возможность применения ингибиторов 15-липоксигеназы для лечения остеопороза и/или остеоартрита у человека.

Остеопороз обусловлен уменьшением плотности минерального компонента костной ткани (минеральной плотности костной ткани (МПК)) в зрелой кости и приводит к переломам после незначительной травмы. Заболевание является широко распространенным и наносит чрезвычайно большой экономический ущерб. Наиболее часто переломы происходят в позвоночнике, дистальном отделе лучевой кости и тазобедренном суставе. Оценки свидетельствуют о том, что одна треть женщин в возрасте свыше 65 лет может иметь переломы позвоночника, обусловленные, в частности, остеопорозом. Кроме того, в преклонном возрасте существует вероятность переломов тазобедренного сустава у приблизительно одной из трех женщин и у одного из шести мужчин.

Установлено, что имеются две различные фазы потери костной ткани. Одна представляет собой медленный связанный с возрастом процесс, который происходит у людей обоего пола и начинается в возрасте приблизительно 35 лет. Эта фаза протекает с приблизительно одинаковой скоростью у людей обоего пола и приводит к потере приблизительно одинаковых количеств кортикального слоя кости и губчатого вещества (спонгиозного или похожего на решетку слоя) кости. Кортикальный слой кости преобладает в добавочном скелете, в то время как губчатое вещество сконцентрировано в осевом скелете, прежде всего в позвоночнике, а также на концах длинных костей. Остеопороз, вызываемый связанной с возрастом потерей костной ткани, называют остеопорозом типа II.

Другой тип потери костной ткани происходит ускоренно, он проявляется у женщин в постменопаузальном периоде и обусловлен дефицитом эстрогена. На этой фазе происходит непропорциональная потеря губчатого вещества кости. Остеопороз, обусловленный истощением эстрогена, называют остеопорозом типа I. Основными клиническими последствиями остеопороза типа I являются переломы позвоночника, тазобедренного сустава и предплечья. Области скелета, для которых характерны такие повреждения, содержат большие количества трабекулярной костной ткани. Для остеопороза типа I, как правило, характерен высокий уровень обмена костной ткани. Резорбция костной ткани повышается, но компенсирующее образование костной ткани является неадекватным. Было установлено, что остеопороз связан с применением кортикостероидов, иммобилизацией или продолжительным нахождением в постельном режиме, алкоголизмом, диабетом, гонадотоксической химиотерапией, гиперпролактинемией, нервно-психической анорексией, первичной и вторичной аменореей, иммунодепрессией, связанной с введением трансплантата, и овариэктомией.

Предполагается, что механизм потери костной ткани при остеопорозе связан с дисбалансом процесса обновления скелета. Этот процесс называется ремоделированием костной ткани. Он происходит в ряде дискретных «карманах» активности. Эти карманы образуются спонтанно внутри костного матрикса на определенной поверхности костной ткани и представляют собой область резорбции костной ткани. Остеокласты (клетки, растворяющие костную ткань или ответственные за резорбцию костной ткани) осуществляют резорбцию части костной ткани, как правило, определенного постоянного размера. Затем после завершения этого процесса резорбции появляются остеобласты (костеобразующие клетки), которые заполняют полость, оставшуюся после остеокластов, новой костной тканью.

В организме здорового взрослого индивидуума остеокласты и остеобласты функционируют таким образом, что образование костной ткани и резорбция костной ткани сбалансированы. Однако при остеопорозе развивается дисбаланс в процессе ремоделирования костной ткани, в результате чего замена костной ткани происходит с меньшей скоростью, чем ее потеря. Хотя этот дисбаланс в определенной степени возникает у большинства индивидуумов в пожилом возрасте, он проявляется намного более серьезным образом и встречается в молодом возрасте при постменопаузальном остеопорозе, после овариэктомии или при ятрогенных (обусловленных применением лекарственных средств) состояниях, таких как состояния, вызванные применением кортикостероидов или иммунодепрессантов.

Для увеличения массы костной ткани у людей, страдающих остеопорозом, были предложены различные подходы, включая введение андрогенов, солей фтора и паратиреоидного гормона и модифицированных версий паратиреоидного гормона. Было предложено также применять для сохранения существующей массы костной ткани индивидуально или в сочетании друг с другом бисфосфонаты, кальцитонин, кальций, 1,25-дигидроксивитамин D₃ и/или эстрогены.

Настоящее изобретение основано на открытии того, что ингибиторы 15-липоксигеназы обладают способностью увеличивать образование сетчатой структуры костной ткани и/или усиливать отложение костной ткани и ускорять заживление переломов. Такие молекулы можно вводить индивидуально или в сочетании с дополнительными агентами, которые обладают способностью ингибировать резорбцию костной ткани и/или усиливать образование костной ткани, в частности, с анаболиками.

Таким образом, одним из объектов изобретения является способ уменьшения потери костной ткани у индивидуума. Способ заключается в том, что индивидууму вводят фармацевтически эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы.

Другим объектом изобретения является способ повышения минеральной плотности костной ткани, заключающийся в том, что индивидууму вводят фармацевтически эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы.

Еще одним объектом изобретения является способ диагностики предрасположенности индивидуума к потере костной ткани, заключающийся в том, что осуществляют обнаружение полиморфизма человеческой хромосомы 17, прежде всего обнаружение полиморфизма гена 15-липоксигеназы.

Следующим объектом изобретения является способ отбора соединений, обладающих способностью уменьшать потерю костной ткани или увеличивать плотность минерального компонента костной ткани, заключающийся в том, что ингибиторы 15-липоксигеназы приводят в контакт с человеческими мезенхимальными стволовыми клетками и определяют клеточную дифференцировку клеток, участвующих в образовании костной ткани.

Эти и другие объекты настоящего изобретения более детально поясняются с помощью приведенного ниже подробного описания изобретения и прилагаемых чертежей. Кроме того, в настоящее описание полностью включены в качестве ссылки различные ссылки, в которых более подробно изложены определенные процедуры или композиции.

При осуществлении на практике настоящего изобретения можно применять, если не указано иное, стандартные методы химии протеинов, биохимии, методы рекомбинантной ДНК и фармакологии, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе (см., например, Т.Е. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (изд-во W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (изд-во Worth Publishers, Inc., последнее издание); Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е изд., 1989); Methods In Enzymology (под ред. S. Colowick и N. Kaplan, изд-во Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд. (Истон, шт.Пенсильвания: изд-во Mack Publishing Company, 1990); Carey и Sundberg Advanced Organic Chemistry, 3-е изд.. (изд-во Plenum Press), тома А и В (1992).

Все публикации, патенты и заявки на патент, процитированные выше или ниже в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

При описании настоящего изобретения используются перечисленные ниже понятия, значения которых указаны ниже.

Понятие "потеря костной ткани" означает дисбаланс соотношения образования костной ткани и резорбции костной ткани, приводящий к меньшему, чем это необходимо, количеству костной ткани у пациента. Потеря костной ткани может происходить в результате остеопороза, остеотомии, периодонтита или обусловливаться неплотно прилегающим протезом. Потеря костной ткани может быть обусловлена также вторичным остеопорозом, который включает индуцированный глюкокортикоидами остеопороз, индуцированный гипертиреозом остеопороз, индуцированный иммобилизацией остеопороз, индуцированный гепарином остеопороз или индуцированный иммунодепрессантами остеопороз. Можно осуществлять мониторинг потери костной ткани, например, путем описанных ниже измерений плотности минерального компонента костной ткани.

Понятия "эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" обозначает количество агента, которое не вызывает токсического действия, но является достаточным для обеспечения требуемого биологического результата. Таким результатом может являться уменьшение и/или облегчение признаков, симптомов или причин заболевания или любое другое требуемое изменение биологической системы. Например, "эффективное количество" с точки зрения терапевтического применения обозначает количество композиции, содержащей действующее вещество, необходимое для обеспечения клинически значимого повышения скорости заживления при лечении перелома; реверсии потери костной ткани при остеопорозе; реверсии повреждений или нарушений хрящевой ткани; предупреждения или замедления начала остеопороза; стимуляции и/или усиления образования костной ткани при несращиваемых переломах и остеогенеза при растяжении; увеличения и/или ускорения роста костной ткани в применяемых в качестве протеза устройствах; и восстановления дефектов зубов. Специалист в данной области может определить соответствующее "эффективное" количество в каждом отдельном случае с помощью стандартных экспериментов.

Понятие "увеличение отложения костной ткани" означает, что накопление костной ткани у индивидуума, которому вводят ингибиторы 15-липоксигеназы, предлагаемые в изобретении, увеличивается по сравнению с накоплением костной ткани у индивидуума, с которым производится сравнение и которому не вводят ингибитор 15-липоксигеназы. Такое увеличенное отложение костной ткани, как правило, определяют согласно настоящему изобретению путем измерения минеральной плотности костной ткани (МПК). Например, увеличение отложения костной ткани можно определять на модели с использованием животных, таких как подвергнутые овариэктомии мыши, собаки и т.п. Животному вводят тестируемое соединение и измеряют минеральную плотность костной ткани (МПК) в костях, которые, как правило, истощаются при остеопорозе типа I или типа II, таких как кости добавочного и/или осевого скелета, прежде всего позвоночного столба, включая позвонки, а также концевые части длинных костей, таких как бедренная кость, средний отдел и дистальный отдел лучевой кости. В данной области техники известны несколько методов определения МПК. Например, можно осуществлять измерения МПК с помощью двойной абсорбциометрии энергии рентгеновских лучей или количественной компьютерной томографии и т.п. (см. примеры). Аналогично этому с помощью методов, хорошо известных в данной области, можно определять увеличение образования костной ткани. Например, можно проводить динамические измерения скорости костеобразования (КОС) на меченных с помощью тетрациклина образцах губчатой кости из поясничного отдела позвоночного столба и дистального метафиза бедренной кости с помощью количественной компьютерной морфометрии (см., например. Ling и др., Endocrinology 140: cc.5780-5788, 1999. В альтернативном варианте можно оценивать маркеры образования костной ткани, такие как активность щелочной фосфатазы и уровни остеокальцина в сыворотке, для определения косвенным путем того, происходит ли образование костной ткани (см. Looker и др., Osteoporosis International 11(6): cc.467-480, 2000).

Понятие "увеличенное образование костной ткани" означает, что количество образующейся костной ткани у индивидуума, которому вводят ингибиторы 15-липоксигеназы, предлагаемые в изобретении, увеличивается по сравнению со скоростью образования костной ткани у индивидуума, которому не вводят ингибитор 15-липоксигеназы. Такое увеличенное образование костной ткани определяют согласно настоящему изобретению с помощью, например, количественной компьютерной морфометрии, а также с помощью описанных выше других маркеров образования костной ткани.

Понятие "ингибитор 15-липоксигеназы" обозначает соединение, которое ингибирует 15-липоксигеназу и характеризуется значением IC₅₀ менее чем 1 мкМ, предпочтительно менее чем 100 нМ. Значения IC₅₀ можно определять стандартными методами. Одним из конкретных методов является колориметрический анализ, согласно которому предполагаемый ингибитор предварительно инкубируют в течение примерно 10 мин с 15-липоксигеназой, после чего добавляют субстрат, представляющий собой линолевую кислоту, и выдерживают еще в течение 10 мин. Продукт, т.е. 13-HPODE, оценивают количественно методом, основанным на сочетании восстановления гидроксипероксилированного липида и окисления N-бензоиллейкометиленового синего в присутствии гемина при рН 5. Поглощение окисленного метиленового синего прямо пропорционально количеству 13-HPODE, образованного с помощью 15-липоксигеназы, и его можно измерять в присутствии ингибитора и без него. Этот конечный анализ описан более подробно у Bruce J. Auerbach, John S. Kiely и Joseph A. Cornicelli, A Spectrophotometric Microtiter-Based Assay for the Detection of Hydroperoxy Derivatives of Linoleic Acid, Analytical Biochemistry, 201, cc.375-380, 1992. Другие методы анализа включают методы, в которых начальную скорость ферментативной реакции измеряют спектрофотометрически путем измерения при 234 нм количества образовавшегося конъюгированного диена.

В контексте настоящего описания понятия "лечить" или "лечение" используются взаимозаменяемо и применяются для обозначения замедления развития симптомов потери костной ткани и/или уменьшения серьезности таких симптомов, которые развиваются или развитие которых предполагается. Кроме того, понятия включают предупреждение дополнительных симптомов, облегчение или предупреждение обусловливающих симптомы метаболических факторов и/или стимулирование роста костной ткани.

"Фармацевтически приемлемый" или "фармакологически приемлемый" обозначает продукт, который не является нежелательным ни с биологической, ни с иной точки зрения, т.е. продукт, который можно вводить индивидууму, не вызывая никаких нежелательных биологических действий или вредных взаимодействий с любыми компонентами композиции, в которую он входит.

"Физиологическое значение рН" или "значение рН, находящееся в диапазоне физиологических значений", означает значение рН в диапазоне примерно от 7,2 до 8,0 включительно, более предпочтительно в диапазоне примерно от 7,2 до 7,6 включительно.

В контексте настоящего описания понятие "пациент" обозначает млекопитающих и животных, не относящихся к млекопитающим. Примеры млекопитающих включают (но, не ограничиваясь ими) любого представителя класса млекопитающих: человека, приматов кроме человека, таких как шимпанзе и других видов человекообразных обезьян и обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, в том числе грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и т.п. Примеры животных, не относящихся к млекопитающим, включают (но, не ограничиваясь ими) птиц, рыб и т.п. Понятие не обозначает конкретный возраст или пол.

В контексте настоящего описания "полиморфизм" обозначает наличие в популяции двух или большего количества генетически детерминированных альтернативных последовательностей или аллелей. Полиморфный маркер или сайт представляет собой локус, в котором происходит дивергенция. Предпочтительные маркеры представляют собой по меньшей мере два аллеля, каждый из которых встречается в рассматриваемой популяции с частотой более чем 1%, более предпочтительно более чем 10 или 20%. Полиморфизм может представлять собой замены, инсерцию, повтор или делецию одного или нескольких оснований. Полиморфный локус может представлять собой всего лишь одну пару оснований. Полиморфные маркеры включают полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов, варьиабельное количество тандемных повторов (ВКТП), гипервариабельные участки, минисателлиты, динуклеотидные повторы, тринуклеотидные повторы, тетрануклеотидные повторы, простые повторы последовательности и инсерционные элементы.

Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) возникает в полиморфном сайте, занятом одним нуклеотидом, который представляет собой сайт вариации аллельных последовательностей. Как правило, перед сайтом и после него расположены высококонсервативные последовательности аллеля (например, последовательности, которые варьируются менее чем у 1/100 или 1/1000 представителей популяций). Однонуклеотидный полиморфизм, как правило, возникает в результате замены одного нуклеотида другим в полиморфном сайте. Транзиция представляет собой замену одного пуринового основания на другое пуриновое основание или одного пиримидинового основания на другое пиримидиновое основание. Трансверсия представляет собой замену пуринового основания на пиримидиновое основание, или наоборот. Однонуклеотидный полиморфизм может возникать также в результате делеции нуклеотида или инсерции нуклеотида в аллель, которые отсутствуют в аллеле, с которым производится сравнение.

В контексте настоящего описания понятие "клетка-предшественник" обозначает клетку, которая еще не полностью дифференцировалась или перешла на стадию (путь) дифференцировки и которая, как правило, не экспрессирует маркеры или не обладает функциями, присущими зрелой полностью дифференцированной клетке.

В контексте настоящего описания понятие "мезенхимальные клетки" или "мезенхимальные стволовые клетки" обозначает мультипатентные клетки-предшественники, которые обладают способностью к многократному делению и потомство которых образует скелетные ткани, включая хрящевую ткань, костную ткань, сухожилия, связки, строму костного мозга и соединительную ткань (см. A. Caplan, J. Orthop.Res. 9: cc.641-650, 1991).

В контексте настоящего описания понятие "остеогенные клетки" обозначает остеобласты и клетки-предшественники остеобластов.

В контексте настоящего описания понятие "локус количественного признака" (КПЛ) обозначает меру фенотипического признака, такую как минеральная плотность костной ткани, который является непрерывно распределенным и может определяться несколькими генами. КПЛ представляет собой сайт на хромосоме, аллели которой влияют на количественный признак.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, представляют собой соединения, которые обладают способностью ингибировать или уменьшать активность 15-липоксигеназы. В этом контексте ингибирование и уменьшение активности фермента означает уменьшение уровня измеренной активности по сравнению с контрольным экспериментом, в котором фермент, клетку или индивидуум не подвергают обработке тестируемым соединением. В конкретных вариантах осуществления изобретения ингибирование или уменьшение измеренной активности составляет по меньшей мере 10%. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что для конкретных случаев применения может быть предпочтительным уменьшение или ингибирование измеренной активности по меньшей мере на 20, 50, 75, 90 или 100% или на любое целое число процентов от 10 до 100%. Как правило, ингибиторы 15-липоксигеназы, предлагаемые в настоящем изобретении, характеризуются значением IC₅₀ менее чем 1 мкМ, предпочтительно менее чем 100 нМ.

Настоящее изобретение основано, в частности, на открытии того факта, что 15-липоксигеназа представляет собой важный модулятор массы костной ткани. В частности, геномное сканирование 100 микросателлитных маркеров у мышей позволило выявить локусы чувствительности к нарушению, связанному с потерей костной ткани, которые расположены на хромосомах 1, 2, 4 и 11. Различия в экспрессии генов, прежде всего генов, кодируемых на хромосоме 11, обусловливают существенные различия в экспрессии гена, кодирующего 15-липоксигеназу, что свидетельствует о наличии связи между экспрессией 15-липоксигеназы и уменьшением минеральной плотности костной ткани.

Полная масса костной ткани является основным критерием риска, обусловленного остеопорозом перелома. На основе семейных исследований и исследований, проведенных на близнецах, было установлено, что минеральную плотность костной ткани (МПК) регулируют генетические факторы (см. обзор Stewart и Ralston, J. Endocr., 166: cc.235-245, 2000). При создании изобретения применяли модель с использованием генов мыши для идентификации локусов, контролирующих МПК. Для идентификации областей генома, которые регулируют минеральную плотность костной ткани, применяли метод, включающий две стадии. Сначала применяли компьютерный метод и микросателлитные маркеры для сканирования базы данных однонуклеотидного полиморфизма (SNP) животного, в результате чего были предсказаны области хромосом, которые участвуют в накоплении и поддержании скелетной массы (пример 1). Затем применяли модели с использованием животных для идентификации и оценки мутаций в генах, участвующих в накоплении и поддержании скелетной массы (пример 2), и для установления того факта, что нарушение гена 15-липоксигеназы приводит к увеличению МПК (пример 4), что свидетельствует о том, что ген 15-липоксигеназы участвует в регуляции массы костной ткани.

Соединения, которые ингибируют активность 15-липоксигеназы и предупреждают резорбцию костной ткани или стимулируют образование костной ткани, являются наиболее предпочтительными для лечения остеопороза. Соединения, которые ингибируют активность 15-липоксигеназы, можно применять в способе лечения остеопороза или остеоартрита, основанном на ингибировании резорбции костной ткани остеокластами или стимуляции дифференцировки, приводящей к образованию остеобластов, и формирования новой костной ткани. В примере 3 продемонстрирована способность ингибиторов 15-липоксигеназы стимулировать дифференцировку человеческих мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты in vitro. В примере 4 продемонстрировано, что полное нарушение гена 15-липоксигеназы in vivo приводит к увеличению МПК. В примере 5 на модели in vivo продемонстрирована способность ингибиторов 15-липоксигеназы стимулировать образование костной ткани.

Согласно настоящему изобретению ингибитор 15-липоксигеназы можно применять для приготовления лекарственного средства, которое содержит эффективное количество указанного ингибитора 15-липоксигеназы, предназначенного для уменьшения потери костной ткани у млекопитающего. Так, в настоящем изобретении предложен способ уменьшения потери костной ткани у млекопитающего, который заключается в том, что индивидууму вводят эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы. Предпочтительно потеря костной ткани связана с остеопорозом, остеоартритом, болезнью Пэджета или заболеваниями периодонта. Более предпочтительно потеря костной ткани связана с остеопорозом.

Кроме того, согласно настоящему изобретению ингибитор 15-липоксигеназы можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для увеличения минеральной плотности костной ткани у млекопитающего, которое содержит эффективное количество указанного ингибитора 15-липоксигеназы. Таким образом, в настоящем изобретении предложен также способ увеличения минеральной плотности костной ткани у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы.

Согласно настоящему изобретению ингибитор 15-липоксигеназы можно применять для приготовления лекарственного средства, содержащего эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы, которое предназначено для лечения остеопороза у млекопитающего. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ лечения остеопороза у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы.

Кроме того, ингибитор 15-липоксигеназы можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для стимуляции дифференцировки линии мезенхимальных стволовых клеток у человека в остеобласты, которое содержит количество указанного ингибитора 15-липоксигеназы, эффективное для увеличения количества остеобластов в организме человека. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ стимуляции дифференцировки линии мезенхимальных стволовых клеток у человека в остеобласты, заключающийся в том, что человеку вводят количество ингибитора 15-липоксигеназы, эффективное для увеличения количества остеобластов в организме человека. Предпочтительно ингибитор 15-липоксигеназы характеризуется значением IC₅₀ менее 1 мкМ.

Лечение с помощью ингибитора 15-липоксигеназы можно применять для заживления переломов кости и остеоэктомий, включая как сращиваемые, так и не сращиваемые переломы. Типы переломов, которые можно лечить с помощью способов, предлагаемых в изобретении, включают переломы, вызываемые как травмой, так и остеопорозом, например переломы тазобедренного сустава, шейки бедра, запястья, позвонков, позвоночного столба, ребер, грудины, гортани и трахей, лучевой/локтевой кости, большеберцовой кости, коленной чашечки, ключицы, таза, плечевой кости, нижней части голени, пальцев руки и пальцев стопы, лица и лодыжки. С помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении, можно увеличивать скорость заживления, а также стимулировать сращивание в случае переломов, которые в противном случае остаются несращиваемыми. Профилактическое лечение пациента, для которого установлено, что он имеет риск возникновения переломов, может также снижать риск возникновения переломов у этого пациента.

Следовательно, ингибитор 15-липоксигеназы можно применять для приготовления лекарственного средства, которое содержит эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы, предназначенного для уменьшения количества случаев переломов у млекопитающего. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ уменьшения количества случаев переломов у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы.

Кроме того, ингибитор 15-липоксигеназы можно применять для приготовления лекарственного средства, которое содержит эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы, предназначенного для заживления переломов у млекопитающего. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ заживления переломов у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное количество ингибитора 15-липоксигеназы.

Предпочтительно млекопитающее в указанных в описании способах и применениях представляет собой человека. Более предпочтительно описанный выше ингибитор 15-липоксигеназы характеризуется значением IC₅₀ менее чем 1 мкМ.

Известны несколько ингибиторов 15-липоксигеназы, которые можно применять согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении. К таким ингибиторам относятся синтетические органические молекулы, растительные экстракты и другие природные продукты, а также антитела к 15-липоксигеназе. Репрезентативные примеры (не ограничивающие объем изобретения) описаны у Cornicelli JA, Trivedi BK., 15-lipoxygenase and its inhibition: a novel therapeutic target for vascular disease, [обзор] [113 ссылок]. Current Pharmaceutical Design; 5(1): cc.11-20, 1999 (описаны различные производные кофеиновой кислоты, простые пропаргиловые эфиры, катехолы и бензотиопираноиндолы); Cornicelli JA. 15-lipoxygenase inhibitors as antiatherosclerotic agents. Idrugs, 1(2): cc.206-213, 1998; Fleischer R., Frohberg P., Buge A., Nuhn P., Wiese M. QSAR analysis of substituted 2-phenylhydrazonoacetamides acting as inhibitors of 15-lipoxygenase. Quant Struct - Act Relat; 19(2): cc.162-172, 2000; Kuhn H. Inhibitors of 12/15-lipoxygenase are potential anti-atherosclerotic drugs. Curr Opin Anti-Inflammatory Immunomodulatory Invest Drugs; 1(3): cc.227-237, 1999; Mogul R., Johansen E., Holman T.R. Oleyl sulfate reveals allosteric inhibition of soybean lipoxygenase-1 and human 15-lipoxygenase. Biochemistry; 39(16): cc.4801-4807, 2000; Sexton К., Roark W.H., Sorenson R., Cornicelli J., Sekerke C., Welch K., Thiourea inhibitors of 15- lipoxygenase. Abstracts of Papers American Chemical Society; 218(1-2), 1999: MEDIO; Tait B.D., Dyer R.D., Auerbach B.J., Bornemeier D., Guilds-Zamarka L., Oxender M. и др. Catechol based inhibitors of 15-lipoxygenase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, том 6(1): cc.93-96, 1996; Moreau R.A., Agnew J., Hicks K.B., Powell M.J., Modulation of lipoxygenase activity by bacterial hopanoids. JouPHKl of Natural Products, том; 60(4): cc.397-398, 1997; 219th National Meeting of the American Chemical Society (2000), Poster BIOL-15. авторы: E-N-Jonsson и T-R-Holman. University of California, Santa Cruz, CA (описаны ингибиторы 15-липоксигеназы, выделенные из морских губок; и Lyckander I.M., Malterud K.E. Lipophilic flavonoids from Orthosiphon spicatus as inhibitors of 15-lipoxygenase. Acta Pharm Nord; 4(3): cc.159-166, 1992. Кроме того, согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, можно применять производные тиомочевины и бензамида, описанные в U.S. No. 6268387 на имя Conner и др. (представителем которых является 3-амино-N-(3,4-дихлорфенил)-4-метоксибензамид, т.е. соединение 3), которые являются ингибиторами 15-липоксигеназы, а также 2-фенилбензо[d]изоселеназол-3-он (эбселен), 6,11-дигидро-5-тиа-11-азабензо[а]флуорин (обозначенный в настоящем описании как соединение 2), и фенилацетиленовые производные, представителем которых является 3-(2-окт-1-инилфенил)акриловая кислота, т.е. соединение 4. Можно применять также соединения, описанные в WO 01/96298 (включенный в настоящее описание в качестве ссылки), включая соединение 6, т.е. изобутиловый эфир [[[5-(5,6-дифтор-1Н-индол-2-ил)-2-метоксифенил]амино]сульфонил]карбаминовой кислоты.

К другим ингибиторам 15-липоксигеназы относятся перечисленные ниже соединения:

1)

описанное в материалах 222-го National Meeting of the American Chemical Society, Чикаго, шт.Иллинойс, США, 26-30 августа 2001 г. постер, MEDI 270.

2)PD 148104

описанное в материалах 218-го ACS (Нью-Орлеан), 1999, MEDI 200.

3) PD 146176, разработанное фирмой Parke Davis (в настоящее время Pfizer)

4) А 78773 (фирма Abbott), описанное в WO 92/1682

5) QA-208-199 (фирма Novartis)

описанное в материалах 6-ой Int Conf Prostaglandins (Флоренция), 1986, 328 Связанный с этим объект настоящего изобретения относится к методам совместной терапии с использованием ингибиторов 15-липоксигеназы для увеличения образования костной ткани и других действующих веществ, таких как бисфосфонаты, эстроген, ИМРЭ (избирательные модуляторы рецептора эстрогена), кальцитонины или с использованием анаболиков. Примерами бисфосфонатов являются алендронат, ибандронат, памидронат, этидронат и ризедронат. Примерами ИМРЭ являются ралоксифен, дигидроралоксифен и лазофоксифен. Кальцитонины включают человеческий и лососевый кальцитонин. В качестве анаболиков можно применять паратиреоидные гормоны (РТН), например, hPTH(1-34), PTH(1-84), и протеин, связанный с паратиреоидным гормоном (РТНгР), и его аналоги. Конкретные аналоги PTHrP описаны в "Mono- and Bicyclic Analogs of Parathyroid Hormone-Related Protein. 1. Synthesis and Biological Studies," Michael Chorev и др. Biochemistry, 36: ее. 3293-3299, 1997 и "Cyclic analogs of РТН and PTHrP," в WO 96/40193 и U.S. No. 5589452 и WO 97/07815. Другое действующее вещество можно вводить одновременно, до или после введения ингибитора 15-липоксигеназы и его можно вводить с помощью другого метода введения. Предпочтительно сначала вводят ингибитор 15-липоксигеназы. Продолжительность такого введения может быть любой, но, как правило, она составляет от 6 до 24 месяцев. После этого лечения осуществляют лечение с помощью антирезорбтивного агента, например бисфосфоната, ИМРЭ, кальцитонина или с использованием гормонзаместительной терапии.

Так, предпочтительно можно применять композицию, содержащую описанный выше ингибитор 15-липоксигеназы и дополнительное действующее вещество. Таким образом, в описанном выше способе предпочтительно применяют дополнительное действующее вещество. Более предпочтительно указанное действующее вещество, которое используют или применяют согласно способу, предлагаемому в изобретении, явля