2359033 - Способ получения рекомбинантного гетерокарпина

Способ получения рекомбинантного гетерокарпина

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области генетической инженерии и может быть использовано в медико-биологической промышленности для получения рекомбинантного гетерокарпина - антагониста человеческого рилизинг-фактора гормона роста (GHRH). Установлена полная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид гетерокарпин; предложены основанные на ней последовательности праймеров, которые могут быть использованы для клонирования гена гетерокарпина, а также включающие эту последовательность генетические конструкции, в частности гибридный ген, кодирующий слитый белок, который содержит полипептид гетерокарпин, а также векторы для экспрессии названного гибридного гена. Описан способ получения рекомбинантного гетерокарпина в виде слитого с His-tag белка, предусматривающий использование клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных предложенными генетическими конструкциями. Рекомбинантный гетерокарпин, полученный согласно изобретению, может быть использован для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака. 7 с. и 2 з.п. ф-лы.

Реферат

Изобретение относится к способу получения рекомбинантного гетерокарпина.

Гетерокарпин является белком с противораковыми свойствами, который впервые описан заявителем в заявке на патент РСТ WO 02/068461. Этот выделенный белок имеет молекулярную массу около 90,9 кДа, содержит фрагменты с пептидными последовательностями SEQ.ID.NO.1, SEQ.ID.NO.2 и SEQ.ID.NO.3 (см. в приложении список последовательностей) и может быть получен экстракцией из клеток растения Pilocarpus heterophyllus, культивированных in vitro в соответствии с описанием указанной выше заявки. Однако полная последовательность этого белка оставалась неизвестной до настоящего времени, поскольку его клонирование не было осуществлено.

В настоящей заявке описаны полинуклеотиды, которые могут служить затравкой для клонирования гетерокарпина, описана также ДНК, кодирующая гетерокарпин, мРНК, соответствующая гетерокарпину, векторы экспрессии, содержащие названную мРНК, клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные с помощью этих векторов и способ получения рекомбинантного гетерокарпина.

Следовательно, первым объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8. Предпочтительно указанный выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8.

Объектом изобретения является также антисмысловой полинуклеотид, включающий последовательность, комплементарную последовательности указанного выделенного полинуклеотида, содержащего полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8. Предпочтительно указанный антисмысловой полинуклеотид представлен последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.8.

Изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, содержащему полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из фрагментов этой последовательности, причем указанный полинуклеотид таков, что он кодирует полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или одним из фрагментов этой последовательности.

На этом основании изобретение, в частности, относится к выделенному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или к выделенному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9.

Гетерокарпин, или, другими словами, белок с последовательностью SEQ.ID.NO.10, кодируется фрагментом полинуклеотида с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8, находящимся между основаниями в положениях 115 (инициирующий кодон ATG, кодирующий метионин) и 2437 (стоп-кодон UAA), т.е. полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.

Изобретение относится также к вектору экспрессии, содержащему выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из фрагментов этой последовательности, или же последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.8 или одному из фрагментов этой последовательности, причем полипептид, кодируемый указанным выделенным полинуклеотидом, имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный вектор экспрессии включает полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9.

Изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной указанным вектором экспрессии.

Изобретение относится также к выделенному полипептиду, содержащему полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или один из ее фрагментов, причем выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.

Объектом изобретения является также моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, описанный выше, в частности объектом изобретения является моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает белок с последовательностью SEQ.ID.NO.14, но не связывает белок с последовательностью SEQ.ID.NO.10.

Изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, содержащему

- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из ее фрагментов, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или один из ее фрагментов, в качестве лекарственного средства,

причем указанный выделенный полинуклеотид таков, что он кодирует выделенный полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации.

Предпочтительно, выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или с одним из ее фрагментов, или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или с одним из ее фрагментов.

В частности, указанный выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.

При этом указанный выделенный полинуклеотид, используемый в качестве лекарственного средства, предпочтительно находится в вирусном векторе, при этом вирусный вектор может быть выбран, например, из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса и поксвируса.

Изобретение относится также к выделенному полипептиду, содержащему полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, в качестве лекарственного средства. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.

Изобретение относится также к моноклональному антителу или к его фрагменту, осуществляющему связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, содержащий белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, в качестве лекарственного средства, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием пролиферации клеток. Предпочтительно указанное моноклональное антитело или указанный его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, специфически связывает выделенный полипептид, который представлен белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов. Еще более предпочтительно указанное моноклональное антитело или указанный его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, специфически связывает выделенный полипептид, который представлен белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, белком с последовательностью SEQ.ID.NO.10).

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала выделенный полинуклеотид, содержащий

- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из ее фрагментов, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или один из ее фрагментов,

и фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты.

Предпочтительно выделенный полинуклеотид, являющийся активным началом, представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или с одним из ее фрагментов, или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или с одним из ее фрагментов.

В частности, выделенный полинуклеотид, являющийся активным началом, представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.

Указанный выделенный полинуклеотид, введенный в фармацевтическую композицию согласно изобретению, предпочтительно находится в вирусном векторе, при этом вирусный вектор выбирают, например, из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса и поксвируса.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей выделенный полипептид, содержащий полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка протеина, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, при этом указанная композиция включает фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты. Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция согласно изобретению является композицией, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, представленный белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или ее фрагментом, или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов.

В частности, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ.ID.NO.10), и фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты.

Другим объектом изобретения является применение выделенного полинуклеотида, содержащего

- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из ее фрагментов, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или один из ее фрагментов,

причем указанный выделенный полинуклеотид таков, что он кодирует выделенный полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для протеина, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации,

для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.

Предпочтительно используемый выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или с одним из ее фрагментов или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или с одним из ее фрагментов.

В частности, используемый выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.

Указанный используемый выделенный полинуклеотид предпочтительно находится в вирусном векторе, причем вирусный вектор выбирают, например, из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса и поксвируса.

Настоящее изобретение относится также к применению выделенного полипептида, содержащего полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов, причем выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.

В качестве альтернативного варианта согласно изобретению моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, содержащий белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, может быть использовано для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания. Предпочтительно указанное моноклональное антитело или указанный его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, специфически связывает полипептид, который представлен белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов.

В частности, моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает белковую последовательность SEQ.ID.NO.10), может быть использовано для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.

В соответствии с предпочтительными вышеуказанными вариантами применения пролиферативным заболеванием, которое подлежит лечению с помощью полипептида или полинуклеотида, описанных выше, является рак. В соответствии с более предпочтительными вариантами рак относится к группе, включающей рак простаты, рак грудной железы, рак легких (и в частности, мелкоклеточный рак легких) и рак прямой кишки. Еще более предпочтительно заболеванием является рак грудной железы и мелкоклеточный рак легких.

Кроме того, изобретение относится к способу получения выделенного полипептида, содержащего белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, при этом указанный способ включает следующие последовательные стадии:

(а) культивирование, в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, включающим выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или же одному из фрагментов этих последовательностей, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и

(б) выделение полипептида из культуры клеток-хозяев.

Предпочтительно указанный способ получения относится к получению выделенного полипептида, представленного белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, при этом указанный способ включает следующие последовательные стадии:

(б) выделение полипептида из культуры клеток-хозяев.

В частности, указанный способ относится к получению выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 (другими словами, к получению белковой последовательности SEQ.ID.NO.10).

Согласно еще более предпочтительному варианту указанного способа он относится к получению белковой последовательности SEQ.ID.NO.10 и включает следующие стадии:

(а) культивирование, в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, включающим выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и

(б) выделение полипептида из культуры клеток-хозяев.

Настоящее изобретение относится также к способу идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, причем способ включает следующие последовательные стадии:

(а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для связывания тестируемого соединения с полипептидом, с выделенным полипептидом, содержащим

- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9,

- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.13 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.13,

причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и

(б) выявление связывания каждого тестируемого соединения с указанным полипептидом и идентификацию среди тестируемых соединений тех соединений, которые способны связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию.

В частности, указанный способ идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, включает на стадии (а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для связывания тестируемого соединения с полипептидом, с выделенным полипептидом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, с белковой последовательностью SEQ.ID.NO.10).

Альтернативный способ идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, включает следующие последовательные стадии:

(а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для взаимодействия клетки с тестируемым соединением, с клеткой, способной экспрессировать выделенный полипептид, содержащий

(б) определение эффекта от воздействия каждого тестируемого соединения на концентрацию в клетке полипептида и идентификацию среди тестируемых соединений тех соединений, которые способны связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию.

В частности, указанный альтернативный вариант способа включает на стадии (а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для взаимодействия с клеткой тестируемого соединения, с клеткой, способной экспрессировать выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, с клеткой, способной экспрессировать белковую последовательность SEQ.ID.NO.10).

Согласно предпочтительным вариантам осуществления способов идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, описанных выше, тестируемые соединения получают из библиотек малых молекул, получаемых в результате применения программ комбинаторной химии.

Фармакологические свойства, присущие полинуклеотидам и полипептидам согласно изобретению, делают возможным их использование в фармацевтических целях. Так, выделенные полипептиды, включающие

и которые имеют, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, а также полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды, могут согласно изобретению вводиться раковым больным для замедления у них роста опухоли или для регрессии этих опухолей.

В описанных выше способах белок, связывающий GHRH человека и ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, может являться, в частности, выделенным полипептидом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, белковой последовательностью SEQ.ID.NO.10).

Наконец, изобретение относится к полинуклеотидам с последовательностью SEQ.ID.NO.4, SEQ.ID.NO.5, SEQ.ID.NO.11 и SEQ.ID.NO.12, которые могут быть использованы, в частности, в качестве затравки в реакциях ПЦР при клонировании гетерокарпина.

Различные перечисленные выше характеристики станут очевидными для специалиста при чтении более подробного описания различных аспектов изобретения.

Подробное описание различных аспектов изобретения

Как указано выше, настоящее изобретение направлено в основном на продукты и способы, предназначенные для модулирования роста клеток и лечения рака. Настоящее изобретение основано, отчасти, на идентификации «последовательностей, ассоциированных с модулированием клеточной пролиферации», которые являются полипептидными и полинуклеотидными последовательностями, ассоциированными с модулированием клеточной пролиферации. Такие молекулы кДНК могут быть получены на основе препаратов РНК или мРНК с использованием стандартных методик, как например обратной транскрипцией. Аналогичным же образом белок или полипептид, ассоциированный с дифференцировкой, включает последовательность, кодируемую мРНК, ассоциированной с дифференцировкой клеток.

Описанные в настоящем изобретении фармацевтические композиции могут включать один или несколько полипептидов, последовательностей нуклеиновых кислот и/или антител. Полипептиды согласно изобретению содержат по меньшей мере часть белка или вариант белка, связывающего GHRH человека и ассоциированного с модулированием клеточной пролиферации. Последовательности нуклеиновых кислот согласно изобретению содержат последовательность ДНК или РНК, которая кодирует по меньшей мере часть такого полипептида или которая комплементарна этой кодирующей последовательности.

Антитела представляют собой белки иммунной системы или их фрагменты, осуществляющие связывание с антигеном, которые способны связывать часть полипептидов, описанных выше.

Полинуклеотиды, полипептиды и белки согласно изобретению

Настоящее изобретение относится более конкретно к полинуклеотидам с последовательностью SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, а также к полипептиду или белку с последовательностью SEQ.ID.NO.14.

Изобретение включает также полинуклеотиды, содержащие полинуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90-95% являются гомологичными полинуклеотидным последовательностям, описанным выше, в частности последовательностям SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 и SEQ.ID.NO.13. Это относится в равной мере к mutatis mutandis и к другим полинуклеотидам, полипептидам и белкам, составляющим часть изобретения, в частности к белку с последовательностью SEQ.ID.NO.14.

Степень гомологичности, выраженную в %, рассчитывают следующим образом:

100-100×(N'/N),

где N' означает число нуклеотидов или аминокислот, модифицированных по отношению к последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9, SEQ.ID.NO.10, SEQ.ID.NO.13 или SEQ.ID.NO.14, и N означает число нуклеотидов в последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9, SEQ.ID.NO.10, SEQ.ID.NO.13 или SEQ.ID.NO.14.

Согласно изобретению полинуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды или белки согласно изобретению, а также фрагменты или слитые протеины этих полипептидов или белков могут быть использованы для получения молекул рекомбинантной ДНК, которые управляют экспрессией этих полипептидов или белков, или их активных фрагментов в соответствующих клетках-хозяевах. Как вариант, полинуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с фрагментами последовательностей полинуклеотидов согласно изобретению, могут быть также использованы в тестах гибридизации нуклеиновых кислот, таких как блоттинг по Саузерну, нозерн-блоттинг и т.д.

В силу вырожденности генетического кода другие последовательности ДНК, кодирующие, главным образом, полипептидную или белковую аминокислотную последовательность согласно изобретению, могут быть использованы для клонирования и экспрессии указанных полипептидов или белков. Эти последовательности ДНК включают последовательности, которые способны гибридизовать полинуклеотидные последовательности полинуклеотидов согласно изобретению в определенных жестких условиях, которые могут быть созданы различными способами. Например, в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно выдерживать температуру, при которой гибридизуются затравки с матрицей, или концентрации MgCl₂ в реакционном буферном растворе. При использовании фрагментов ДНК с радиоактивными метками или олигонуклеотидов для зондирования мембран жесткие условия устанавливают путем регулирования ионной силы промывочных растворов или строго контролируя температуру промывки.

Предпочтительно указанная гомологическая нуклеотидная последовательность специфически гибридизуется с последовательностью, комплементарной последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 в жестких условиях (или очень жестких условиях). Параметры, характеризующие жесткие условия, определяются температурой, при которой расходятся 50% спаренных нитей (Т_m).

Для последовательностей, содержащих более 30 оснований и в соответствии с Sambrook et coll. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Т_m определяют согласно уравнению

T_m=81,5+0,41×(% G+C)16,6×log[катион]-0,63×(% формамида)-(600/число оснований).

В соответствии с изобретением «очень» жесткими условиями являются условия, когда используемая температура гибридизации на 10°С ниже Т_m, а буфер гибридизации содержит 6-кратный раствор SSC (0,9 М раствор хлорида натрия и 0,09 М раствор цитрата натрия). При таких условиях полинуклеотиды с неспецифическими последовательностями не гибридизуются с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13.

Измененные последовательности ДНК, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают делеции, добавки или замены различных нуклеотидных остатков и приводят к последовательности, которая кодирует тот же генный продукт или его функциональный эквивалент. Генный продукт также может содержать делеции, добавки или замены аминокислотных остатков в белковых последовательностях согласно изобретению, которые приводят к так называемым молчащим изменениям и получают, таким образом, полипептиды и белки с эквивалентной функцией.

Такие замены аминокислотных остатков могут осуществляться на основе полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или с учетом амфипатической природы данного остатка.

Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, а положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; аминокислоты с полярными группами, у которых близки значения гидрофобности, включают лейцин, изолейцин, валин; глицин, аланин; аспарагин, глутамин; серин, треонин; фенилаланин, тирозин.

По целому ряду причин последовательности ДНК согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы для изменения полинуклеотидных последовательностей согласно изобретению, включая изменения, но не ограничиваясь ими, которые модифицируют экспрессию генного продукта. Например, мутации могут быть осуществлены с использованием хорошо известных специалисту методов, например, используя направленный мутагенез, вставки новых сайтов рестрикции, изменения гликозилирования, фосфорилирования и т.д.

В частности, в некоторых системах экспрессии, как, например, дрожжи, клетка-хозяин может сверхгликозилировать генный продукт. В такой системе предпочитают изменять полинуклеотидные последовательности для того, чтобы устранить сайты гликозилирования. В объем настоящего изобретения входят также модифицированные полинуклеотидные последовательности, связанные с гетерологичными последовательностями, кодирующими слитый протеин. Слитый протеин (которым может быть, например, протеин с последовательностью SEQ.ID.NO.14) может быть модифицирован для установления сайта расщепления, локализированного между белковой последовательностью согласно изобретению (например, последовательностью SEQ.ID.NO.10) и гетерологичной белковой последовательностью, так чтобы белковая последовательность согласно изобретению могла бы быть отщеплена от гетерологичной части.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, ассоциированные с модулированием пролиферации клеток

Любой полинуклеотид, кодирующий полипептид или его часть или его вариант, который, как описано в настоящем изобретении, связывает GHRH человека и ассоциируется с модулированием клеточной пролиферации, входит в объем изобретения. Такие полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой ДНК (геномную, кДНК или синтезированную) или молекулы РНК.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, связывающие GHRH человека и ассоциированные с модулированием клеточной пролиферации, могут быть получены с использованием любого способа, доступного специалисту. Например, такой полинуклеотид может быть амплифицирован посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), исходя из кДНК, полученной из клеток. Для этого специфические затравки могут быть заданы или синтезированы, или они должны быть коммерчески доступны; эти затравки базируются на последовательности указанного полинуклеотида. Амплифицированный участок может быть затем использован для выделения полного гена из банка геномных ДНК или из банка кДНК любой клетки или любой ткани с помощью известных специалисту способов, кратко изложенных ниже. В качестве варианта полный ген может быть сконструирован из нескольких фрагментов продукта ПЦР. Молекулы кДНК, кодирующие протеин, фиксирующий GHRH человека и ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, или его часть, могут быть получены также путем скрининга банка кДНК, полученного например, из мРНК клеток или ткани. Такие библиотеки коммерчески доступны или могут быть получены согласно классическим методам (см. Sambrook et coll., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Согласно альтернативному варианту могут быть также применены и другие методы скрининга, хорошо известные специалисту.

Молекула кДНК, кодирующая полипептид, фиксирующий GHRH человека и ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, может быть секвенирована классическими методами с использованием ферментов, как например: фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназы Х (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, Etats-Unis), Taq-полимеразы (Perkin Elmer, Foster City, CA, Etats-Unis), термостабильной полимеразы Т7 (Amersham, Chicago, IL, Etats-Unis), или комбинируя рекомбинантные полимеразы и экзонуклеазы, имеющие способность активировать повторное считывание, как, например, система амплификации Элонгаза (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Etats-Unis). Система автоматического секвенирования может быть использована с помощью инструментов, име

Способ получения рекомбинантного гетерокарпина

Патент 2359033