2361575 - Твердые пероральные дозируемые формы валсартана

Твердые пероральные дозируемые формы валсартана

Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к спрессованной таблетке, включающей валсартан в качестве действующего вещества и от 50% до 65% микрокристаллической целлюлозы в пересчете на общую массу компонентов ядра этой спрессованной таблетки. Такое количество микрокристаллической целлюлозы обеспечивает увеличение биодоступности валсартана. 4 з.п. ф-лы, 13 табл.

Реферат

Ангиотензиноген, т.е. α2-макрогликопротеин, расщепляется ферментом ренином с образованием декапептида ангиотензина I, который сам обладает лишь очень слабой биологической активностью. На следующей стадии пути превращения отщепляются еще 2 аминокислоты под действием ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), который главным образом связан с эндотелием, с образованием ангиотензина II. Последний, как полагают, является одним из наиболее сильных природных вазоконстрикторов.

Ангиотензин II взаимодействует со специфическими рецепторами на поверхности клетки-мишени. В настоящее время были достигнуты успехи в идентификации подтипов рецепторов, которые, например, обозначают как АТ₁-рецепторы и АТ₂-рецепторы. Количество исследований системы ренин-ангиотензин, в частности в отношении гипертензии, за последние десять лет возрастало почти по экспоненциальному закону. В результате в настоящее время выявлен целый ряд рецепторов ангиотензина II, и некоторые из них были клонированы и проанализированы. В настоящее время значительные усилия предпринимаются для выявления веществ, которые связываются с АТ₁-рецептором, и активные соединения такого типа часто называют антагонистами ангиотензина-II. В результате ингибирования АТ₁-рецептора эти антагонисты могут, например, применяться в качестве гипотензивных средств или для лечения застойной сердечной недостаточности.

АТ₁- и АТ₂-рецепторы также изучены в отношении их распределения (относительного содержания) и биологических свойств и было установлено, что несмотря на 30%-ную гомологию, для них характерно очень различное распределение и активность.

АТ₁-рецептор, который играет основную роль в регуляции кровяного давления, был обнаружен в корковом веществе надпочечников, почке, матке и т.д. На клеточном уровне он обнаружен в фибробластах, макрофагах и клетках гладкой мускулатуры (ГМК).

В противоположность этому АТ₂-рецептор обнаружен в основном в эмбриональных тканях, а также в тканях взрослых организмов, прежде всего в подверженной патологическому изменению ткани, например, при ишемической болезни сердца. В этой ткани он локализован на фибробластах и эндотелиальных клетках.

Целью представленного в настоящем описании исследования было изучение распределения AT₁- и АТ₂-рецепторов в легком человека с использованием иммуноцитохимических методов и гибридизации in situ.

Ранее были созданы специфические антитела к эпитопам AT₁-рецептора, но такие специфичные инструменты для исследования отсутствуют для АТ₂-рецептора. В результате для его оценки применяются гистологические исследования, основанные на использовании меченных с помощью радиоактивного изотопа антагонистов рецептора, в сочетании с авторадиографией, что позволяет получить только относительно грубые данные о локализации в ткани. Однако в последние 2 года стали доступны специфические хорошо охарактеризованные антитела к человеческому рецептору, и их применяли в представленных ниже исследованиях.

Методы и материалы

1. Специфичность антитела и зонда для гибридизации in situ (ISD и титрования

Для того чтобы подтвердить специфичность иммуноцитохимических (ИЦХ) исследований и исследований методом ISF, из департамента патологии университетского госпиталя (Pathology Dept., University Hospital), Гент, Бельгия, получали залитые в парафин блоки нормальных человеческих надпочечников (корковое вещество и мозговое вещество) и использовали в качестве материала для тестирования. Известно, что АТ₁-рецепторы в основном локализованы в корковом веществе надпочечников, а АТ₂-рецепторы в мозговом веществе.

Для изучения человеческих легких контрольный материал получали после аутопсии, когда пациенты умирали по причинам, не связанным с болезнью легких, например, в результате несчастных случаев. Некоторые такие материалы получали из указанной выше организации г. Гента, некоторые из архивов департамента патологии госпиталя Пенсильвании (Pathology Dept. of The Pennsylvania Hospital), Филадельфия, США. Отбирали ткани, содержащие небольшие дыхательные пути, поскольку они, вероятно, более подвержены повреждению.

Все образцы фиксировали в 10%-ном забуференном формалине максимально быстро после смерти, обезвоживали и заливали в парафиновый воск. Делали срезы толщиной 3-5 мкм и помещали препараты на покрытые силаном предметные стекла.

Для того чтобы свести к минимуму различные изменения, связанные с обработкой, на каждое предметное стекло помещали по два последовательных среза, один для обработки антителом к АТ₁, а другой для обработки антителом к АТ₂. Одновременно обрабатывали до 20 предметных стеклом так, чтобы, за исключением первичного антитела, все реагенты, включая хромоген, были идентичными. Таким образом, единственным вариабельным фактором являлась толщина срезов, которую нельзя полностью контролировать.

2. Антитела

Тестировали два антитела к AT₁-рецептору, полученные от фирмы Santa Cruz Inc., Сан-Диего, штат Калифорния США, (клоны N 10 и 306), и было установлено одинаковое распределение рецептора в корковом веществе надпочечников.

Основная часть исследований проведена с антителом к АТ₂-рецептору, полученным от фирма Santa Cruz (клон С18), при использовании которого для опытов обнаружено, что он дает такую же схему окрашивания в мозговом веществе надпочечников и в легком, что и первое антитело.

Все антитела были строго проанализированы фирмами-производителями и отдельными поставщиками в отношении их специфичности и перекрестной реактивности.

3. ISГ-зонды

Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР-продукты) получали и применяли следующим образом:

Конструировали олигонуклеотиды, специфичные для человеческого рецептора типа I ангиотензина II (GenBank, регистрационный номер М93394) и рецептора типа II ангиотензина II (GenBank регистрационный номер U15592), используя программное обеспечение Oligo 5.0 для гомологичных областей обеих последовательностей (таблица 1). кДНК из человеческой костной ткани получали с помощью стандартных методов (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Для ПЦР применяли следующие пары олигонуклеотидных праймеров: для рецептора типа I ангиотензина II-5'-CTggCTgACTTATgCTTTTTACTgACT-3' и 5'-gATgCAggTgACTTTggCTACA-3'; (ПЦР-продукт длиной 236 пар оснований) и рецептора типа II ангиотензина II-5'-ATTTACTCCTTTTggCTACTCTTCCTC-3' и 5'-ggTCACgggTTATCCTgTTCTTC-3' (ПЦР-продукт длиной 489 пар оснований). ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием 10 нг кДНК-матрицы, применяя термоячейку типа MJ Research PCR Cycle и следующие циклы ПЦР: 1) 94°С/2 мин, 2) 94°С/10 с, 60°С/30 с, 72°С/15 с в течение 35 циклов, с использованием полимеразы High Fidelity Taq (фирма Boehringer Mannheim) в сочетании с компонентами, входящими в наборы производителей. Продукты ПЦР-амплифиации идентифицировали с помощью электрофореза на 0,8% агарозном/ТВЕ-геле (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Для подтверждения идентичности продуктов ПЦР-амплификации ДНК элюировали из геля и клонировали в клонирующем векторе А/Т pMOSBlue (фирма Amersham). Для колоний, содержащих ДНК-вставки правильного размера (таблица 1), проводили полное секвенирование обеих цепей для подтверждения их идентичности.

Каждый зонд, как смысловой, так и антисмысловой для AT₁, и только антисмысловой, как описано выше, метили флуоресцином (флуоресцинизотио-цианат; ФИТЦ) и наличие мРНК в клетках определяли после гибридизации с зондом, применяя для обнаружения мышиное антитело к ФИТЦ плюс систему щелочная фосфатаза - антитело к щелочной фосфатазе (АРААР). Такой метод введения метки повышает вероятность обнаружения очень небольших количеств копий.

4. Иммуноцитохимия

Для всех антител использовали следующую процедуру. Срезы толщиной 5 мкм сначала обрабатывали с помощью методов возвращения антигена в сочетании с обработкой микроволнами в нитратном буфере (рН 6,0).

Время экспозиции составляло 20 мин, и предметные стекла оставляли для охлаждения в буфере. Когда антитела представляли собой козлиные поликлональные антитела, то применяли метод на основе смеси пероксидаза-антитело к пероксидазе (РАР) с диаминобензидином (ДАБ) в качестве хромогена, а для кроличьих поликлональных антител использовали систему АРААР с новым фуксином. Срезы сначала обрабатывали 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 30 мин для того, чтобы блокировать неспецифичные рецепторы, а затем инкубировали с первичным антителом в течение 30 мин при комнатной температуре. Каждое антитело титровали и получали следующие оптимальные разведения:

Применяемые антитела	Ткань легкого	Надпочечник
АТ₁ клон N 10	1:200	1:500
клон N 306	1:200	1:500
АТ₂ клон С 18	1:150	1:500

В качестве отрицательного контроля для кроличьего поликлонального антитела применяли отрицательную сыворотку из Dako (фирма Prosan, Гент, Бельгия), для козьего поликлонального антитела первичное антитело не использовали.

ISГ

Срезы толщиной 5 мкм освобождали от парафина и затем подвергали гибридизации "in situ" согласно хорошо известным методам. Срезы сначала обрабатывали раствором для предварительной гибридизации в течение 20 мин при 55°С. Затем их промывали перед обработкой зондами в течение ночи при 55°С. После дополнительной промывки их обрабатывали мышиным антителом к ФИТЦ и системой для обнаружения АРААР с целью локализации специфического транскрипта. Для АТ₁-рецептора смысловой зонд представлял собой отрицательный контроль, для АТ₂-рецептора зонд не применяли.

Анализ изображения

Для количественной оценки интенсивности окрашивания предметные стекла визуально обследовали с помощью устройства типа Leica MR500 и количество окраски на единицу площади ткани оценивали в единицах изображения (пикселях), следуя инструкции фирмы Leica. Это осуществляли для определения соотношений AT₁-рецептора и АТ₂-рецептора в различных областях. Эти области включают а) эпителий дыхательных путей, б) расположенный под эпителием интерстеций, в) ГМК из участка вокруг кровеносных сосудов и г) слизистые железы.

Результаты

Распределение в срезах надпочечников

Распределение АТ₁-рецептора: С помощью обоих антител получена следующая схема распределения в корковом веществе надпочечников, для которой, как и предполагалось, характерно различное окрашивание вокруг клеток гладкой мускулатуры, окружающих кровеносные сосуды, а также сети интерстеция на фибробластах и вокруг них. Окрашивания эндотелиальных клеток не выявлено.

Распределение АТ₂-рецептора: С использованием антитела оценивали распределение в мозговом веществе надпочечников, в этой области выявлено выраженное окрашивание клеток феохромоцитомы.

ISГ: Оба антисмысловых зонда дали одинаковую картину.

Оценка легкого

Распределение АТ₁-рецептора: Обнаружено очень четкое окрашивание клеток интерстеция, подстилающих эпителий дыхательных путей (субэпителиальных), а также краев клеток гладкой мускулатуры (ГМК), окружающих кровеносные сосуды. Позитивное окрашивание обнаружено также для макрофагов.

Распределение АТ₂-рецептора: Для этого рецептора выявлено, что он в значительной степени связан с эпителиальными клетками дыхательный путей, причем наиболее сильно окрашивается щеточная каемка. Позитивно окрашенные клетки также обнаружены в некоторых слизистых железах, на некоторых эндотелиальных клетках сосудов и на фибробластах, хондроцитах и макрофагах. Не обнаружено окрашивания ГМК.

ISГ: При этом анализе зонды также дали одинаковую картину. В частности, с использованием АТ₂-зонда сильный сигнал получен только на эндотелиальных клетках и некоторых слизистых железах.

Анализ изображения

Распределение протеина и, следовательно, рецепторов, определенное по интенсивности окрашивания, т.е. в пикселях/мкм² ткани, представлено в следующей таблице.

Антитело	Эпителий дыхательных путей	Субэпителиальная область	Железы	ГМК
AT₁	0,00	8	0,00	10
АТ₂	5	0-1	5	0,00

Присутствие рецепторов ангиотензина II в корковом веществе и мозговом веществе надпочечников ранее было продемонстрировано с помощью биохимических и гистологических методик. Данные, полученные с использованием как имеющихся в продаже, так и полученных от специалистов антител, подтверждают эти результаты, но также позволяют доказать возможность применений иммуноцитохимического и ISГ-методов, которые использовались в настоящем изобретении.

С учетом полученных в настоящем исследовании результатов было проведено сравнение распределения АТ₁- и АТ₂-рецепторов в нормальной и пораженной болезнью тканях легкого с целью выяснения специфичности распределения АТ₁- и АТ₂-рецепторов и их соотношения.

Присутствие AT₁-рецепторов в легком ранее было подтверждено биохимически и в настоящем исследовании продемонстрирована их четкая клеточная локализация. Эта информация является чрезвычайно важной для выявления относительного содержания АТ₁- и АТ₂-рецепторов в различных областях легкого в нормальном и патологическом состояниях.

Сведения о распределении, прежде всего, АТ₂-рецептора являются абсолютно новыми, поскольку к настоящему времени отсутствовали данные о их присутствии или распределении. Из результатов настоящего исследования вытекает несколько важных положений.

Во-первых, присутствие АТ₂-рецептора на эпителиальных клетках бронхов небольших дыхательных путей. Как уже было известно, этот рецептор считается антифиброзным, антипролиферативным и проапоптозным. Следовательно, повышающая или понижающая регуляция на эпителиальных клетках оказывает выраженные воздействия на замещение эпителиальных клеток, развитие гиперплазии и даже играет роль в развитии рака легких.

Во-вторых, присутствие значительных количеств протеина на щеточной каемке эпителиальных клеток может хорошо кореллировать с уровнем секреции слизи, поскольку, как было установлено, некоторые из эпителиальных клеток слизистых желез также несут этот рецептор. Из данных, полученных с помощью ISГ, следует, что некоторые железы содержат большое количество копий мРНК.

И наконец, присутствие АТ₂-рецептора на эндотелиальных клетках сосудов в настоящем изобретении подтверждено как с помощью иммуноцитохимии, так и с помощью гибридизации in situ. Обнаружено, что они встречаются сравнительно редко и не на всех клетках каждого конкретного сосуда.

Эти исследования подтверждают и расширяют данные о присутствии и распределении рецепторов ангиотензина II типа АТ₁ и АТ₂ в легком человека. Присутствие АТ₂-рецептора на эпителиальных клетках небольших дыхательных путей имеет важное значение для понимания происхождения болезней, связанных с изменением функции этих клеток.

Имеется очень немного данных о локализации AT-рецепторов в легком человека и о их распределении, повышающей или понижающей регуляции и соотношении в нормальной и пораженной болезнью ткани легкого. Для такого исследования получали образцы из нормального легкого и образцы, взятые у пациентов, страдающих хроническим обструктивным легочным заболеванием (хроническая обструкция дыхательных путей) (ХОЛЗ) ± гипертензией.

Образцы легкого

Образцы легкого получали у следующих групп пациентов, все из которых имели клинически подтвержденный диагноз.

NN (n=3)	- некурящие, нормальная ткань
С (n=5)	- курящие, но в остальном нормальные
ХОЛЗ (n=8)	- ХОЛ3-позитивные, с нормальным кровяным давлением (КД)
ХОЛЗ/Н (n=3)	- ХОЛЗ плюс гипертензия
Н (n=4)	- курящие с повышенным КД

Дыхательные пути осторожно отсекали от легких немедленно после удаления легкого из организма пациента при резекции опухоли или по другим показаниям. Тщательно выбирали область, не содержащую какой-либо раковой ткани. Затем небольшие блоки фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в течение 2 ч при комнатной температуре до заливки в парафиновый воск. Это гарантирует оптимальную структурную целостность и сохранение антигенной активности.

Методы определения локализации рецептора

а) Иммуноцитохимия (ИЦХ). Тестировали 2 x антитела к АТ₁, фирма Santa Cruz (клоны N-10 и 306). Также тестировали одно антитело к АТ₂, фирма Santa Cruz (клон С 18).

Данные цифровых изображений показали:

Распределение АТ₂-рецептора в эпителиальных клетках бронхиол, включая щеточную каемку, и на клетках слизистых желез.

Для соседнего среза, окрашенного в отношении AT₁-рецептора, обнаружено сильное различие в распределении на клетках гладкой мускулатуры, фибробластах/строме и макрофагах.

Анализ человеческого легкого, взятого у пациентов

Из всего полученного материала готовили срезы и окрашивали согласно ИЦХ для выявления локализации как AT₁-, так и АТ₂-рецептора с использованием соответствующих отрицательных контролей. Анализы изображения начинали с получения данных для одного среза, полученного из легкого одного пациента (это представляет собой медленный процесс, поскольку должны быть строго соблюдены базисные линии). Были оценены эпителий и субэпителий и кровеносный сосуд. Этот анализ проводили "вслепую", так что не могло быть сделано никаких комментариев, за исключением того факта, что у некоторых "пациентов" имеются выраженные уровни, сильно отличающиеся от среднего. Расхождения, связанные с различной толщиной срезов и окрашиванием, были минимизированы в результате одновременного осуществления AT₁- и АТ₂-ИЦХ с использованием двух последовательных срезов. Таким образом, также могла быть использована одна партия хромогена.

Данные о локализации в эпителии легкого АТ₂-рецептора важны по ряду причин. Поскольку установлено, что этот рецептор является антипролиферативным, антифиброзным и проапоптозным, то можно ожидать, что его повышающая регуляция может привести к различным заболеваниям легких; например, что только одно курение оказывает определенное влияние. Этот рецептор играет роль в таких связанных с фиброзом состояниях, как респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), или даже в снижении пролиферативной способности эпителия при раке легкого.

Результаты

Локализация рецептора

Все антитела и рибонуклеотидные зонды тестировали в отношении нормального коркового вещества и мозгового вещества надпочечников, где, как известно, оба типа рецепторов присутствуют в относительно больших количествах.

Процесс повторяли с использованием нормальной ткани легкого, в которой заявителям удалось обнаружить и AT₁- и АТ₂-рецепторы и их мРНК. Локализация оказалась следующей:

AT₁ - на клетках гладкой мускулатуры, фибробластах/строме, макрофагах. Этот результат оказался весьма предсказуемым, за исключением того, что интенсивность окраски и количество рецепторов в нормальной ткани легкого оказалась весьма высокой.

АТ₂ - на эпителиальных клетках бронхов (особенно на щеточной каемке), на слизистых железах (некоторых). Кроме того, на эпителиальных клетках сосудов, фибробластах, макрофагах и хрящевых клетках. Эти данные являются полностью неожиданными и новыми и нуждаются в дополнительном исследовании. Локализация на эпителиальных клетках и слизистых железах подтверждена по содержанию как протеина, так и мРНК, локализация в щеточной каемке связана с секрецией слизи.

Распределение AT₁- и АТ₂-рецепторов ангиотензина в легких пациентов, страдающих хроническим бронхитом, по сравнению с контролем
Группа	Эпителий	Субэпителий	Соотношение
АТ₁	АТ₂	AT₁	АТ₂	AT₁ (субэпителий)/АТ₂ (эпител ий)
контроль (1)	0,02	7,15	4,07	0,01	0,56
курящие - N=4
контроль (2)	0,02	9,49	6,45	1,3	0,67
некурящие
N=5
контроль (3)	0,1	7,97	11,02	0,04	1,38
курящие, страдающие гипертензией
ХОЛЗ	0,10	6,84	19,64	0,11	2,87
курящие, без гипертензии N=7
ХОЛЗ	0,30	6,01	6,12	0,05	1,01
курящие, страдающие гипертензией N=3

Устройство фирмы Leica (анализатор изображения типа MR 500) переводит интенсивность окраски в серую шкалу (0-250), каждая единица соответствует одному пикселю. Это дает возможность надежно количественно оценить данные.

Эти данные основаны на анализах изображения органа пациента. Данные выражают в пикселях на единицу площади позитивно окрашенной ткани и в виде среднего значения для пяти областей на предметное стекло.

Как видно из приведенных результатов, отношение содержания AT₁ в субэпителии и АТ₂ в эпителии в нормальной ткани легкого существенно ниже 1, в то время как это соотношение близко к 1 или выше 1 в пораженной болезнью ткани легкого. Эпителий образует внутреннюю выстилку трахей и большинства бронхов. Увеличение соотношения содержаний рецепторов АТ₁/АТ₂ в бронхиальной субэпителиальной области легкого пациентов, страдающих хроническим бронхитом, по сравнению с контролем прежде всего является следствием повышения количества AT₁-рецептора, обнаруженных на фибробластах и макрофагах, окружающих эпителий дыхательных путей, что проявляется в повышенных уровнях воспаления и фиброза, характерных для ХОЛЗ.

Приведенные выше результаты ясно свидетельствуют о том, что АТ₁-рецепторы, которые модулируют ангиотензин II, локализованы в субэпителиальной ткани легкого и, прежде всего, что их относительное содержание в соответствующей ткани легкого повышается. Таким образом, ингибирование ангиотензина II антагонистами AT₁-рецептора приводит к снижению обструкции дыхательных путей.

Кроме того, эксперименты продемонстрировали, что относительное содержание

АТ₂ в эпителиальной ткани легкого, прежде всего в соответствующей пораженной болезнью ткани, например, главным образом на эпителиальных клетках бронхов, а также в структурных клетках альвеол, например, на слизистых железах альвеол, повышается. Поскольку АТ₂-рецепторы являются антипролиферативными, антифиброзными и проапоптозными, их модуляция может применяться для лечения определенных форм состояний и болезней легких, прежде всего для лечения респираторного дистресс-синдрома взрослых (ARDS), и для снижения пролиферативной способности эпителия при раке легкого и молочной железы, кроме того, для лечения септического синдрома, форм поражения легкого, таких как пневмония, аспирация содержимого желудка, травма грудной клетки, шок, ожоги, жировая эмболия, экстракорпоральное кровообращение, отравление О₂, геморрагический панкреатит, интерстициальное и бронхоальвеолярное воспаление, пролиферация эпителиальных и интерстициальных клеток, накопление коллагена, фиброз.

Распределение рецепторов в нормальной ткани молочной железы и в ткани молочной железы пациентов, страдающих раком молочной железы

Образцы ткани молочных желез, проанализированные в этом исследовании, выбраны случайным образом из файлов департамента патологии университетского госпиталя (Pathology Dept., University Hospital), Гент. Их фиксировали в формалине, помещали в парафиновый воск и с помощью патологоанатомов из департамента патологии определяли их патологический статус. Было изучено 16 случаев: 14 инвазивных относящихся к протоку (проточных) карцином, 1 инвазивная, коллоидная карцинома и 1 инвазивная, относящаяся к дольке (дольковая) карцинома.

Иммуноцитохимический анализ осуществляли с использованием залитых в парафиновый воск срезов ткани с применением поликлональных антител к АТ₁ и АТ₂, которые использовались при изучении легких, в сочетании с указанным выше методом, основанным на использовании комплекса стрептавидин-биотин-пероксидаза.

Для создания пригодной модели для оценки антагонистов линии клеток, полученные из тканей молочной железы человека, также оценивали в отношении содержания рецепторов. Это может являться пригодной рабочей моделью для дальнейшей биохимических и цитологических исследований in vitro.

Результаты

Полученные данные ясно свидетельствуют о присутствии рецепторов типа 1 и 2 ангиотензина II в нормальной ткани молочной железы человека, причем АТ₂ обнаружен на кубовидных клетках эпителиальной выстилки протоков, а АТ₁ главным образом присутствует на миоэпителиальных клетках протока. Все окрашивание прекращалось при удалении первичного антитела из смеси для инкубации.

Во всех случаях для соединительной ткани обнаружено позитивное окрашивание на AT₁-рецептор, но при этом окрашивание раковых клеток отсутствовало (11/16) или было слабым (5/16). В противоположность этому для АТ₂-рецептора обнаружено позитивное окрашивание всех карцином и почти полное отсутствие реактивности в строме (1/16).

Результаты, полученные с использованием изученных линий клеток, оказались очень интересными с точки зрения различной схемы окрашивания, обнаруженной для каждой из них. Короткоживующие культуры нормальных эпителиальных клеток молочной железы давали очень сильную позитивную реакцию на AT₁-рецептор, но лишь слабое окрашивание в отношении АТ₂-рецептора.

Карциномы молочной железы
Пациент	AT₁	АТ₂
Карцинома молочной железы	Карцинома	Строма	Карцинома	Строма
1	инвазивная, среднедифференцированная проточная карцинома - 2-й степени согласно классификации Блума-Ричардсона (Bloom-Richardson)		++	++	-
2	инвазивная, среднедифференцированная проточная аденокарцинома		+++	++ точечная	-
3	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома - проточная карцинома in situ		++	+	-
4	инвазивная, среднедифференцированная проточная карцинома - обширная проточная карцинома in situ	-	+	++	-
5	инвазивная коллоидная карцинома	-	++	++	-
6	инвазивная, среднедифференцированная проточная карцинома -проточная карцинома in situ	+	+	+++	-
7	инвазивная, хорошо дифференцированная проточная карцинома - большая проточная карцинома in situ	-	++	++	-
8	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома - проточная карцинома in situ	+	++	+++	-
9	инвазивная, хорошо дифференцированная проточная карцинома	-	+	++ точечная	-
10	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома - проточная карцинома in situ	-	+	+	-
11	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома - многоочаговые карциномы in situ	-	++	++	-
12	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома	-	+++	++	+
13	инвазивная, слабодифференцированная инвазивная	+	++	++	-
14	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома - несколько проточных карцином in situ	-	++ точечная	++	-
15	инвазивная, слабодифференцированная проточная карцинома - несколько проточных карцином in situ	+	+++	+	-
16	инвазивная дольковая карцинома - решетчатовидная внутридольковая карцинома	+	+	+	-

Заключение

Как видно из приведенных результатов, присутствие AT₁-рецептора на нормальных эпителиальных клетках, вероятно, очень варьируется в легком. Однако тип эпителиальных клеток можно отнести к миоэпителиальному, поскольку АТ₂-рецептор в обеих тканях обнаружен на кубовидных эпителиальных клетках. В то же время позитивное окрашивание стромы в отношении AT₁-рецепторов также обнаружено в обеих тканях. Очевидно, что последний факт связан с присутствием фибробластов во внеклеточном матриксе.

Присутствие АТ₁-рецептора на клетках карциномы, а также их столь широкое и воспроизводимое распространение является неожиданным. Описанные типы клеток, несущие специфические рецепторы, представляют собой идеальную модель для исследований in vitro.

Эти эксперименты ясно демонстрируют неожиданное явление, состоящее в том, что при использовании согласно настоящему изобретению в качестве модели клеток карциномы молочной железы, АТ₁-рецепторы в основном распределены в строме, в то время как АТ₂-рецепторы главным образом выявлены в клетках карциномы.

Все эти неожиданные результаты ясно свидетельствуют о том, что любой антагонист АТ₁-рецептора или модулятор АТ₂-рецептора может применяться для лечения состояний или болезней, связанных с увеличением содержания AT₁-рецепторов в субэпителиальной области или с увеличением содержания АТ₂-рецепторов в эпителии, прежде всего для лечения обструктивных заболеваний дыхательных путей. Согласно классификации к обструктивным заболеваниям дыхательных путей относятся респираторные заболевания, которые характеризуются увеличением размера дыхательных путей и повышенной секрецией в дыхательных путях, что приводит к снижению вентиляции альвеол. Обструктивные заболевания дыхательных путей включают обратимые и необратимые состояния и к ним относятся, например, хроническое обструктивное заболевание легких, такое как бронхит, например, хронический бронхит и эмфизема, а также астма, кистозный фиброз, интерстициальное легочное заболевание, инвазивный рак легкого и повышенная устойчивость дыхательных путей при принудительной экспирации. Любой из таких вариантов лечения также необязательно может быть связан с лечением гипертензии как у не курящих, так и у курящих пациентов.

Эти неожиданные результаты ясно свидетельствуют о том, что любой модулятор АТ₂-рецептора может использоваться для лечения состояний или болезней, связанных с увеличением содержания АТ₂-рецепторов в эпителиальной легочной ткани, прежде всего для лечения определенных форм состояний и болезней легких, в частности, для лечения респираторного дистресс-синдрома взрослых (ARDS), и для снижения пролиферативной способности эпителия при инвазивном раке легкого, кроме того, для лечения септического синдрома, форм поражения легкого, таких как пневмония, аспирация содержимого желудка, травма грудной клетки, шок, ожоги, жировая эмболия, экстракорпоральное кровообращение, отравление O₂, геморрагический панкреатит, интерстициальное и бронхоальвеолярное воспаление, пролиферация эпителиальных и интерстициальных клеток, накопление коллагена, фиброз.

Антагонисты AT₁-рецептора или модулятор АТ₂-рецептора представляют собой агенты, которые изменяют биологическую реакцию хозяина на клетки опухоли, что обеспечивает их терапевтическую ценность. Повышенный уровень экспрессии АТ₁-рецептора в миоэпителии протока молочной железы и АТ₂-рецептора в кубовидном эпителии молочной железы свидетельствует о том, что любой антагонист AT₁-рецептора или модулятор АТ₂-рецептора может применяться для лечения инвазивной карциномы молочной железы. Эти карциномы включают уплотненные, инфильтрирующиеся папиллярные, проточные, медуллярные и дольковые злокачественные опухоли молочной железы, а также метастазы в легких, плевре, скелете и печени. Лечение может рассматриваться как дополнительные лечебные мероприятия в сочетании с хирургией, радиотерапией, или в качестве паллиативной терапии в сочетании с гормональной терапией или с другими модификаторами биологических реакций, таким как интерфероны, интерлейкины, факторы некроза опухоли, моноклинальные антитела и т.д.

В то время как клиническое обследование или маммография позволяют предположить наличие рака молочной железы, но только установить диагноз позволяет оценка биопсии ткани. Схема распределения АТ₁- и АТ₂-рецепторов может применяться в качестве маркера гиперплазии (локализация АТ₁-рецепторов) и инвазивного рака (локализация АТ₂-рецепторов) и, следовательно, для диагностики злокачественного развития опухоли.

Антагонисты AT₁-рецептора включают соединения, имеющие различные структурные особенности. Например, следует отметить соединения, перечисленные в заявке на европейский патент, опубликованной под номером 443983 (ЕР 443983), в частности, заявленные соединения и конечные продукты примеров получения, содержание этой публикации изобретения включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпочтительным является (S)-N-(1-карбокси-2-метилпроп-1-ил)-N-пентаноил-N-[2'(1Н-тетразол-5-ил)бифенил-4-илметил]амин[валсартан]формулы