Композиция антител к her2

Композиция антител к her2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей основной вид антитела к HER2, которое связывается с доменом II в HER2, или к варианту его аминокислотной последовательности, включающему лидерное удлинение на амино-конце. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанную композицию, и к вариантам терапевтического использования такой композиции.

Предпосылки создания изобретения

Антитела к Her2

Семейство рецепторов HER2 тирозинкиназ представляет собой важные модуляторы роста, дифференциации и выживания клеток. Указанное семейство рецепторов включает четыре разных представителя, включая рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1 или HER1), HER2 (ErbB2 или p185^neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2).

EGFR, кодируемый геном erbB1, вовлекается в процесс злокачественного роста у человека. В частности, повышенная экспрессия EGFR наблюдается при раке молочной железы, мочевого пузыря, легкого, головы, шеи и желудка, а также в случае глиобластомы. Повышенная экспрессия рецептора EGFR часто ассоциирована с повышенной продукцией лиганда EGFR, трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), одними и теми же опухолевыми клетками, приводя к активации рецептора через путь аутокринной стимуляции (Baselga and Mendelsohn Pharmac Ther. 64: 127-154 (1994)). Моноклональные антитела против EGFR или его лигандов, TGA-α и EGF, рассматриваются как терапевтические средства при лечении таких видов злокачественных новообразований (см., например, Baselga and Mendelsohn, выше; Masui et al., Cancer Research, 44: 1002-1007 (1984) и Wu et al., J. Clin. Invest., 95: 1897-1905 (1995)).

Второй представитель семейства HER, p185^neu, вначале был идентифицирован как продукт трансформирующего гена из нейробластом крыс, которым вводили химический препарат. Активированная форма протоонкогена neu возникает в результате точечной мутации (замена валина на глютаминовую кислоту) в трансмембранном участке кодируемого белка. Амплификация человеческого гомолога neu наблюдается при раке молочной железы и яичника и коррелирует с плохим прогнозом (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); патент США № 4968603). К настоящему времени в опухолях человека не выявлены точечные мутации, аналогичные neu протоонкогену. Суперэкспрессия HER2 (зачастую, но не полностью в соответствии с генной амплификацией) также наблюдается при других карциномах, включая карциномы желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря (см., в числе других, King et al., Science, 229: 974 (1985); Yokota et al., Lamcet 1: 765-767 (1986); Fukushige et al., Mol. Cell. Biol., 6: 955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Wеiner et al., Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50: 5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer., 57: 358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology 59: 46-52 (1991); и McCann et al., Cancer, 65: 88-92 (1990)). HER2 может суперэкспрессироваться при раке предстательной железы (Gu et al., Cancer Lett., 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum Pathol., 28: 827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79: 2162-70 (1997) и Sadasivan et al., J. Urol., 150: 126-31 (1993)).

Антитела против крысиного p185^neu и белковых продуктов человеческого HER2, описанные Дребином с соавторами (Drebin et al.), вызывают образование антител против генного продукта neu крыс, p185^neu (см., например, Drebin et al., Cell., 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198: 277-290 (1991); и WO 94/22578). Дребин с соавторами (Drebin et al., Oncogene, 2: 273-277 (1988)) показали, что смеси антител, активных в отношении двух разных участков на p185^neu, приводят к синергическим противоопухолевым эффектам на neu-трансформированных клетках NIH-3T3, имплантированных мышам nude (см., также патент США № 5824311, выданный 20 октября 1998 года).

Худзиак с соавт. (Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3): 1165-1172 (1989)) описывают получение панелей антител к HER2, которые были охарактеризованы с использованием клеточной линии опухоли молочной железы человека SK-BR-3. Относительную пролиферацию клеток SK-BR-3 после экспозиции с антителами определяют по окрашиванию монослоев кристаллическим фиолетовым через 72 часа. В рамках данного теста определяют максимальное ингибирование антителом, названным 4D5, которое ингибирует клеточную пролиферацию на 56%. Другие антитела в рассматриваемой панели снижают клеточную пролиферацию в меньшей степени по данным данного теста. Было также показано, что антитело 4D5 сенсибилизирует клеточную линию опухоли человека, осуществляющую суперэкспрессию HER2, к цитотоксическим эффектам TNF-α (см. также патент США № 5677171, выданный 14 октября 1997 года). Описанные Худзиаком с соавт. (Husziak et al.) антитела к HER2 были также охарактеризованы другими авторами (Fendly et al., Cancer Research, 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3): 59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1: 72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin Immunol., 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2): 979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37: 255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9: 1829-1838 (1994); Vitеtta et al., Cancer Research, 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266: 14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996) и Schaefer et al., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)).

Рекомбинантная гуманизированная версия мышиного антитела HER2 4D5 (huMab4D5-8, rhuMab HER2, Трастузумаб (Trastuzumab) или HERCEPTIN®; патент США № 5821337) клинически активна у пациентов с метастазирующими раковыми опухолями молочной железы, осуществляющими суперэкспрессию HER2, которым проводилась предшествующая обширная противораковая терапия (Basegla et. al., J. Clin. Oncol., 14: 737-744 (1996)). Трастузумаб (Trastuzumаb) был одобрен Агентством по контролю за лекарственными и пищевыми продуктами США (Food and Drug Аdministration) 25 сентября 1998 года для лечения пациентов с метастазирующими раковыми опухолями молочной железы, в случае если опухоли осуществляют суперэкспрессию HER2 белка.

В литературе также описаны другие антитела к HER2 с различными свойствами (Tagliabue et. al., Int J. Cancer., 47: 933-937 (1991); McKenzie et. al., Oncogene, 4: 543-548 (1989); Maier et. al., Cancer Res., 51: 5361-5369 (1991); Bacus et. al., Molеcular Carcinogenesis, 3: 350-362 (1990); Stancovski et. al., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et. al., Cancer Research, 52: 2580-2589 (1992); Xu et. al., Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et. al., Cancer Research, 52: 2771-2776 (1992); Hancock et. al., Cancer Res., 51: 4575-4580 (1991); Shawver et. al., Cancer Res., 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et. al., Cancer Res., 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et. al., J. Bol. Chem., 267: 15160-15167 (1992); патент США № 5783186 и Klapper et. al., Oncogene 14: 2099-2109 (1997)).

Скрининг с целью выявления гомологов привел к идентификации двух других представителей семейства рецепторов HER: HER3 (патенты США №№ 5183884 и 5480968, а также Kraus et. al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) и HER4 (заявка на патент EР № 599274; Plowman et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) и Plowman et. al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Оба указанных рецептора проявляют повышенную экспрессию по меньшей мере в некоторых клеточных линиях рака молочной железы.

Рецепторы HER в основном найдены в различных сочетаниях в клетках и считается, что гетеродимеризация повышает разнообразие клеточных ответов на множество лигандов HER (Earp et. al., Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR связывается с шестью разными лигандами: эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), афирегулин, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), бетацеллюлин и эпирегулин (Groenen et. al., Growth Factors, 11: 235-257 (1994)). Семейство белков герегулинов, получаемых при альтернативном сплайсинге одного гена, дает лиганды для HER3 и HER4. Семейство герегулинов включает герегулины альфа, бета и гамма (Holmes et. al., Science, 256: 1205-1210 (1992); патент США № 5641869; и Schaefer et. al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)), факторы дифференциации neu (NDF), глиальные факторы роста (GGF), фактор, индуцирующий активность ацетилхолинового рецептора (ARIA), и фактор, образуемый из сенсорных и двигательных нейронов (SMDF). В литературе имеются соответствующие обзоры (см. Groenen et. al., Growth Factors, 11: 235-257 (1994); Lemke et al., G. Molec & Cell. Neurosci., 7: 247-262 (1996) и Lee et. al., Pharm. Rev., 47: 51-85 (1995)). Недавно были идентифицированы три дополнительных лиганда HER: нейрегулин-2 (NRG-2), который, как сообщается, связывается с HER3 или HER4 (Chang et. al., Nature 387: 509-512 (1997); и Carraway et. al., Nature, 387: 512-516 (1997)), нейрегулин-3, который связывается с HER4 (Zhang et. al., PNAS (USA), 94(18): 9562-7 (1997)), и нейрегулин-4, который связывается с HER4 (Harari et. al., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)), HB-EGF, бетацеллюлин и эпирегулин также связываются с HER4.

Поскольку EGF и TGF-α не связываются с HER2, EGF стимулирует EGFR и HER2 к образованию гетеродимера, который активирует EGFR, что проводит к фосфорилированию HER2 в гетеродимере. Димеризация и/или трансфосфорилирование, по всей видимости, активируют тирозинкиназу HER2 (см., Earp et. al., выше). Аналогично, в том случае когда HER3 совместно экспрессируется с HER2, образуется активный сигнальный комплекс и антитела, направленные против HER2, способны разрушать данный комплекс (Sliwkowski et. al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Дополнительно, аффинность HER3 в отношении гетерорегулина (HRG) повышается до более высокого уровня аффинности в случае совместной экспрессии с HER2 (см. также Levi et. al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); и Lewis et. al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) в том, что касается белкового комплекса HER2-HER3. HER4, как и HER3, образует активный сигнальный комплекс с HER2 (Carraway and Cantley, Cell, 78: 5-8 (1994)).

Для воздействия на сигнальную систему HER был разработано антитело rhuMAb 2C4 (Pertuzumab, OMNITARG^TM) как гуманизированное антитело, которое ингибирует димеризацию HER2 с другими HER рецепторами, что приводит к ингибированию осуществляемых под действием лиганда фосфорилирования и активации, а также пути активации RAS и АКТ в направлении считывания информации. На фазе I испытаний Пертузумаба (Pertuzumab) в качестве единственного средства для лечения солидных опухолей 3 субъектов с развитым раком яичников подвергали лечению Пертузумабом. У одного пациента отмечался стойкий частичный ответ, а у другого пациента отмечалось стабилизация заболевания в течение 15 недель (Agus et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22:192, Abstract 771 (2003)).

Композиции, включающие вариант антитела

В патенте США № 6339142 описывается композиция с антителом к HER2, включающая смесь антитела против HER2 и одного или нескольких его вариантов, где количество активного(ых) варианта(ов) составляет менее, чем примерно 25%. Трастузумаб (Trastuzumab) представляет собой пример антитела к HER2.

Райд с соавт. (Reid et. al.) в постерной презентации на фармацевтической конференции (Well Characterized Biotech Phаrmaceutical Conference) (январь 2003 года) в докладе, посвященном эффектам изменений клеточной культуры на характеристике гуманизированного антитела («Effects of Cell Culture Process Changes on Humanized Antibody Characteristics»), описывает композицию с неназванным гуманизированным IgG1 антителом, содержащим N-концевую гетерогенную структуру, созданную комбинацией VHS сигнального пептида, N-концевого глютамина и пироглютаминовой кислоты в его тяжелой цепи.

Рид с соавт. (Reed et. al) в постерной презентации на конференции, посвященной получению антител (IBC Antibody Production Conference) (февраль 2002 года) в докладе, посвященном роли хроматографического метода в оценке антител («The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method»), описывает способ удлинения VHS- тяжелой цепи E25, представляющего собой гуманизированное IgG1 антитело.

Раус с соавт. (Rouse et. al.) в постерной презентации на конференции WCBP (6-9 января 2004 года) в докладе, посвященном методам оценки гликопротеина («Top Down' Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectometry and Its application to Biopharmaceutical Development»), описывают композицию на основе моноклонального антитела, включающего N-концевую гетерогенную структуру, полученную из остатков сигнального ^-3AHS или ^-2HS пептида, на их легкой цепи.

В презентации на IBC конгрессе (IBC Meeting) (сентябрь 2000 года) Джилл Портер (Jill Porter) представил стратегический подход, связанный с использованием сравнительных исследований и тестов для характеристики биологических препаратов («Strategic Use of Comparability Studies and Assay for Well Characterized Biologicals»), в котором обсуждается получаемая на поздних этапах элюции форма ZENАPAX^TM, включающая три дополнительных аминокислотных остатка на тяжелой цепи.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей основной вид антитела к HER2, которое связывается с доменом II в HER2, и варианту по аминокислотной последовательности, включающему лидерное удлинение на аминоконце.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к композиции, включающей смесь основного вида антитела к HER2, содержащего последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно и вариант аминокислотной последовательности основного вида антитела, включающий VHS-лидерное удлинение на аминоконце, присоединенной к одному или двум вариабельным доменам легкой цепи, где от примерно 1% до примерно 20% молекул антитела в композиции включают VHS-лидерное удлинение на аминоконце.

Настоящее изобретение также относится к полипептиду, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или ее дезамидированный и/или окисленный вариант, а также к антителу, включающему (а) легкую цепь, содержащую данный полипептид, и (b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 и дезамидированного и/или окисленного варианта SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 24.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому препарату, включающему композицию в фармацевтически приемлемом носителе, и к способу лечения HER2-экспрессирующего рака у пациента, включающему введение пациенту указанного фармацевтического препарата в количестве, эффективном для лечения рака.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена схема белковой структуры HER2 и аминокислотных последовательностей домена I-IV (SEQ ID NO: 19-22 соответственно) его внеклеточного домена.

На фиг.2А и 2В показаны результаты сопоставления аминокислотных последовательностей вариабельного легкого (V_L) (фиг.2А) и вариабельного тяжелого (V_H) (фиг.2В) доменов мышиного моноклонального антитела 2С4 (SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно); V_L и V_H доменов гуманизированного антитела 2С4 версии 574 (SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно) и консенсусных последовательностей каркасных участков V_L и V_H (hum κ1, легкая каппа, подгруппа I, humIII, тяжелая, подгруппа III) (SEQ ID NO: 5 и 6 соответственно). Стрелки указывают на различия между гуманизированным вариантом 2С4 574 и мышиным моноклональным антителом 2С4 или между гуманизированным антителом 2С4 574 и мышиным моноклональным антителом 2С4 и каркасным участком человеческой молекулы. В скобках показаны гипервариабельные участки (CDR).

На фиг.3А и 3В показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 15) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 16) Пертузумаба (Pertuzumab). CDR выделены жирным шрифтом. Углеводный фрагмент присоединен к Asn 299 в тяжелой цепи.

На фиг.4А и 4В показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 17) и тяжелой цепи Пертузумаба, каждая из которых включает интактную последовательность сигнального пептида на аминоконце (SEQ ID NO: 18).

На фиг.5 схематически показано связывание 2С4 в сайте связывания гетеродимера в HER2, что препятствует гетеродимеризации с активированным EGFR или HER3.

На фиг.6 показано спряжение HER2/HER3 с путями MAРK и Akt.

На фиг.7 проиллюстрированы результаты сравнительного изучения активности Трастузумаба и Пертузумаба (Trastuzumab and Pertuzumab).

На фиг.8А и 8В показаны реконструированные масс-спектры восстановленной легкой цепи (фиг.8А) и тяжелой цепи (фиг.8В) Пертузумаба.

На фиг.9А и 9В приведены результаты анализа нативного Пертузумаба (фиг.9А) и CPB-расщепленного Пертузумаба (фиг.9В) методом катионообменной хроматографии.

На фиг.10 показан результат анализа Пертузумаба методом гель-хроматографии.

На фиг.11А и 11В показан результат CE-SDS-LIF анализа восстановленного Пертузумаба (фиг.11А) и интактного Пертузумаба (фиг.11В).

На фиг.12А и 12В показаны пептидные карты после расщепления Пертузумаба трипсином (фиг.12А) и LYS-C пептидные карты Пертузумаба (фиг.12B).

На фиг.13 приведены результаты СЕ-анализа N-связанных олигосахаридов, высвобожденных из Пертузумаба.

На фиг.14 показаны олигосахаридные структуры, обычно наблюдаемые в IgG антителах.

На фиг.15 показан позитивный вариант масс-спектрального анализа MALDI-TOF нейтральных олигосахаридов, высвобожденных из Пертузумаба.

На фиг.16А и 16В приведены аминокислотные последовательности легкой цепи (SEQ ID NO: 13) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 14) Трастузумаба (Trastuzumab).

На фиг.17А и 17В показана последовательность легкой цепи Пертузумаба (SEQ ID NO: 23) и вариант последовательности тяжелой цепи Пертузумаба (SEQ ID NO: 24).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

I. Определения

Термин «основной вид антитела» в контексте настоящего описания относится к структуре аминокислотной последовательности в композиции, которая в количественном отношении представляет собой преобладающую антительную молекулу в композиции. Предпочтительно основной вид антитела представляет собой антитело к HER2, такое как антитело, которое связывается с доменом II HER2, антитело, которое ингибирует димеризацию HER более эффективно, чем Трастузумаб (Trastuzumab), и/или антитело, которое связывается с сайтом гетеродимерного связывания HER2. Предпочтительный вариант указанного основного вида антитела в контексте настоящего описания представляет собой такой вариант, который включает вариабельную легкую и вариабельную тяжелую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 4 и, наиболее предпочтительно, включает аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, SEQ ID NO: 15 и 16 (Пертузумаб).

Термин «вариант аминокислотной последовательности» антитела в контексте настоящего описания представляет собой антитело с аминокислотной последовательностью, которая отличается от последовательности, имеющейся в основном виде антитела. Обычно варианты аминокислотной последовательности обладают по меньшей мере примерно 70% гомологией с основным видом антитела и, предпочтительно, они характеризуются по меньшей мере примерно 80% и, более предпочтительно, по меньшей мере 90% гомологией с основным видом антитела. Варианты аминокислотной последовательности содержат замещения, делеции и/или вставки в определенных положениях внутри данной аминокислотной последовательности или в непосредственной близости от аминокислотной последовательности основного вида антитела. Примеры вариантов аминокислотных последовательностей в контексте настоящего описания включают кислый вариант (например, дезамидированный вариант антитела), основный вариант, антитело с лидерным удлинением на аминоконце (например, VHS-) на его одной или двух легких цепях, антитело с С-концевым лизиновым остатком на его одной или двух тяжелых цепях, антитело с одним или несколькими окисленными остатками метионина и т.п., а также включает сочетания различных аминокислотных последовательностей тяжелой и/или легкой цепей. Варианты антител, особенно интересные в контексте настоящего описания, представляют собой антитело, включающее лидерное удлинение на аминоконце в одной или двух цепях антитела, необязательно также включающее другие различия по аминокислотной последовательности и/или по гликозилированию относительно основного вида антитела.

Термин «вариант по гликозилированию» антитела в контексте настоящего описания относится к антителу с одним или несколькими углеводными фрагментами, присоединенными к молекуле, которая отличается от одного или нескольких углеводных фрагментов, присоединенных к антителу основного вида. Примеры вариантов по гликозилированию включают антитело с G1 или G2 олигосахаридной структурой вместо G0 олигосахаридной структуры, присоединенной к Fc участку, антитело с одним или двум углеводными фрагментами, присоединенными к его одной или двум легким цепям, антитело без углеводного фрагмента, присоединенного к его одной или двум тяжелым цепям антитела и т.п., а также сочетание таких изменений в гликозилировании.

В том случае когда антитело содержит Fc участок, олигосахаридная структура, такая как структура, показанная на фиг.14, может быть присоединена к одной или двум тяжелым цепям антитела, например, по остатку 299. В случае Пертузумаба G0 представляет собой доминирующую олигосахаридную структуру с другими возможными олигосахаридными структурами, такими как G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) и G2, которые встречаются в меньших количествах в композиции Пертузумаба.

Если особо не указано иное, термин «G1 олигосахаридная структура» в контексте настоящего описания включает G1(1-6) и G1(1-3) структуры.

Термин «лидерное удлинение на аминоконце» в контексте настоящего описания относится к одному или нескольким аминокислотным остаткам аминоконцевой лидерной последовательности, которые присутствуют на аминоконце одной или нескольких тяжелых или легких цепей антитела. Пример аминоконцевого лидерного удлинения включает три аминокислотных остатка или состоит из трех аминокислотных остатков VHS, присутствующих на одной или обеих легких цепях варианта антитела.

Термин «дезамидированное» антитело представляет собой антитело, в котором один или несколько аспарагиновых остатков были дериватизированы с образованием, например, аспарагиновой кислоты, сукцинимида или изо-аспарагиновой кислоты.

Термин «гомология» определяется как процент остатков в аминокислотной последовательности варианта, которые оцениваются как идентичные, по результатам сопоставления последовательностей и введения, при необходимости, гэпов для достижения максимального процента гомологии. Способы и компьютерные программы, применяемые для такого сопоставления, известны в данной области. Одна из соответствующих компьютерных программ представляет собой «Align 2», разработанную компанией Genentech Inc., которая была зарегистрирована с документацией для пользователей в Бюро США по защите авторских прав (United States Copyright Office, Washington, DC 20559) 10 декабря 1991 года.

В контексте настоящего описания термин «катионообменный анализ» относится к способу, с помощью которого композицию, включающую два или более соединений, разделяют на основе разницы их зарядов с использованием катионообменника. Катионообменник обычно включает ковалентно связанные отрицательно заряженные группы. Предпочтительно рассматриваемый катионообменник представляет собой слабый катионообменник и/или включает карбоксилатную функциональную группу, такую как в катионообменной колонке PROPAC WCX-10^TM, поставляемой компанией Dionex.

Термин «рецептор HER» представляет собой рецептор белка тирозинкиназы, который принадлежит к семейству рецепторов HER и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4, а также других представителей данного семейства, которые могут быть идентифицированы в будущем. Рецептор HER обычно содержит внеклеточный домен, который может связывать лиганд HER, липофильный трансмембранный домен, консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен и сигнальный домен на карбоксиконце, содержащий несколько тирозиновых остатков, которые могут быть фосфорилированы. Предпочтительный рецептор HER представляет собой нативную последовательность человеческого рецептора HER.

Внеклеточный домен HER2 включает четыре домена: домен I (аминокислотные остатки примерно на участке 1-195), домен II (аминокислотные остатки примерно на участке 196-319), домен III (аминокислотные остатки примерно на участке 320-488) и домен IV (аминокислотные остатки примерно на участке 489-630) (остатки пронумерованы без сигнального пептида) (см. Garrett et al., Mol. Cell., 11: 495-505 (2003); Cho et al., Nature., 421: 756-760 (2003); Franklin et al., Cancer Cell., 5: 317-328 (2004); или Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 1746-1750 (1993). См., также чертеж на фиг.1, прилагаемый к настоящему описанию.

Термины «ErbB1», «HER1», «рецептор эпидермального фактора роста» и «EGFR» в контексте настоящего описания используются взаимозаменяемо и относятся к EGFR, описанному, например, в работе Карпентера с соавт. (Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56: 881-914 (1987), включая его естественные мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, описанный, например, в работе Хамфри с соавт. (Humphrey et al., PNAS (USA), 87: 4207-4211 (1990)). Термин erbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт EGFR.

Термины «ErbB2» и «HER2» используются взаимозаменяемо и относятся к человеческому белку HER2, описанному в литературе (см., например, Semba et al., PNAS (USA)., 82: 6497-6501 (1985) и Yamomoto et al., Nature, 319: 230-234 (1986) (номер доступа в Genеbank X03363). Термин «erbB2» относится к гену, кодирующему человеческий ErbB2, и «neu» относится к гену, кодирующему крысиный p185^neu. Предпочтительный HER2 представляет собой нативную последовательность человеческого HER2.

Термины «ErbB3» и «HER3» относятся к полипептидному рецептору, описанному, например, в патентах США №№ 5183884 и 5480968, а также в работе Крауса с соавт. (Kraus et al., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989)).

Термины «ErbB4» и «HER4» в контексте настоящего описания относятся к полипептидному рецептору, описанному, например в заявке на патент EР № 599274; а также в работах Плаумана с соавт. (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); и Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)), включая его изоформы, описанные, например, в WO 99/19488, опубликованной 22 апреля 1999 года.

Термин «лиганд HER» обозначает полипептид, который связывается с рецептором HER и/или активирует его. Лиганд HER, представляющий особый интерес в контексте настоящего описания, относится к нативной последовательности человеческого лиганда HER, такого как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage et al., J. Biоl. Chem., 247: 7612-7621 (1972)); трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223: 1079-1082 (1984)); амфирегулин, также известный как аутокринный фактор роста невриномы или кератиноцитов (Shoyab et al., Science, 243: 1074-1076 (1989)); Kimura et al., Nature, 348: 257-260 (1990); и Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11: 2547-2557 (1991); бетацеллюлин (Ching et al., Science 259: 1604-1607 (1993)) и Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993)); гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251: 936-939 (1991)); эпирегулин (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270: 7495-7500 (1995)); и Komurasaki et al., Oncogenе, 15: 2841-2848 (1997)); герегулин (см. ниже); нейрегулин-2 (NRG-2) (Carraway et. al., Nature, 387: 512-516 (1997)); нейрегулин-3 (NRG-3) (Zhang et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567 (1997)); нейрегулин-4 (NRG-4) (Harari et. al., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)) или крипто (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6): 3330-3335 (1997)). Лиганды HER, которые связывают EGFR, включают EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, HB-EGF и эпирегулин. Лиганды HER, которые связывают HER3, включают герегулины. Лиганды HER, способные связывать HER4, включают бетацелюллин, эпирегулин, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и герегулины.

Термин «герегулин» (HRG) в контексте настоящего описания относится к полипептиду, кодируемому генным продуктом герегулина, описанному в патенте США № 5641869 или в работе Марчионни с соавт. (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)). Примеры герегулина включают герегулин-α, герегулин-β1, герегулин-β2, герегулин-βЕ3 (Holmes et al., Science 256: 1205-1210 (1992); и патент США № 5641869); фактор дифференциации neu (NDF) (Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)); фактор, индуцирующий активность ацетилхолинового рецептора (ARIA) (Falls et al., Cell 72: 801-815 (1993); фактор роста глиальных клеток (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); фактор, образуемый из сенсорных и двигательных нейронов (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); γ-герегулин (Schaefer et. al., Oncogenе 15: 1385-1394 (1997)). Термин включает также биологически активные фрагменты и/или варианты по аминокислотной последовательности нативной последовательности полипептида HRG, такие как EGF-подобный фрагмент его домена (например,

HRGЕ1_177-244).

Термин «димер HER» в контексте настоящего описания представляет собой нековалентно ассоциированный димер, включающий по меньшей мере два различных рецептора HER. Такие комплексы могут образовываться, когда клетка, экспрессирующая два или несколько рецепторов HER, подвергается воздействию лиганда HER, и могут быть выделены иммунопреципитацией и далее проанализированы методом ДСН-ПААГ, как описано, например, в работе Silwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Примеры таких димеров HER включают гетеродимеры EGFR-HER2, HER2-HER3 и HER3-HER4. Кроме того, димер HER может включать два или более рецептора HER2, объединенных с другим рецептором HER, таким как HER3, HER4 или EGFR. С димером могут быть ассоциированы другие белки, такие как субъединица цитокинового рецептора (например, gp130).

Термин «сайт гетеродимерного связывания» на HER2 относится к участку во внеклеточном домене HER2, который контактирует или вступает во взаимодействие с участком во внеклеточном домене EGFR, HER3 или HER4 при образовании из них димера. Такой участок обнаружен в домене II в HER2 (Franklin et al., Cancer Cell, 5: 317-328 (2004)).

Термины «активация HER» или «активация HER2» относятся к активации или фосфорилированию одного или нескольких рецепторов HER или рецепторов HER2. В основном, активация HER приводит к сигнальной трансдукции (которая, например, вызывается внутриклеточным доменом киназы, фосфорилирующей тирозиновые остатки в рецепторе HER или в полипептидном субстрате). HER активация может быть опосредована связыванием лиганда HER с димером HER, включающим интересующий рецептор HER. Связывание лиганда HER с димером HER может активировать домен киназы одного или нескольких рецепторов HER в димере и, таким образом, приводить к фосфорилированию тирозиновых остатков в одном или нескольких рецепторах HER и/или к фосфорилированию тирозиновых остатков в дополнительном(ых) полипептиде(ах) субстрата, таком как внутриклеточные Akt или MAPK киназы.

Термин «антитело» в контексте настоящего описания используется в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител и антительных фрагментов, которые демонстрируют желательную биологическую активность.

Термин «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, например, индивидуальных антител, включающих популяцию, представители которой идентичны или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов, которые могут возникать в процессе продукции моноклонального антитела, такие как варианты, приведенные в настоящем описании. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые в типичном случае включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Кроме своей специфичности моноклональные антитела имеют достоинства в том, что они не загрязнены другими иммуноглобулинами. Определение «моноклональный» указывает на характер антитела, которое получают по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует трактовать в плане ограничения способа получения антител определенным методом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены по методу гидридом, впервые описанному Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены с использованием рекомбинантой ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть выделены из библиотеки фаговых антител с использованием методик, описанных в литературе (см., например, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)).

Приведенные в настоящем описании моноклональные антитела включают, в частности, «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желательную биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Интересные в контексте настоящего описания химерные антитела включают «приматизированные» антитела, включающие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от приматов, отличных от человека (например, Old World Monkey, Ape и т.п.), и последовательности константного участка человеческой молекулы.

Термин «фрагменты антител» включает часть интактного антитела, предпочтительно включающую его антигенсвязывающий или вариабельный участок. Примеры антительных фрагментов включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, диантитела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные из антительного(ых) фрагмента(ов).

«Интактное антитело» представляет собой такое антитело, которое включает антигенсвязывающий вариабельный участок, а также константный домен легкой цепи (C_L) и константные домены тяжелой цепи C_H1, C_H2 и C_H3. Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены нативной последовательности человека) или их варианты по аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями и включает олигосахаридную структуру, присоединенную к одной или двум тяжелым цепям.

Термин «эффекторные функции» антитела относится к биологической активности, определяемой Fc участком (нативная последовательность Fc участка или вариант Fc участка по аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q, комплементзависимая цитотоксичность, связывание Fc рецептора, антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, отрицательная регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора B клеток; BCR) и т.п.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного участка своих тяжелых цепей интактные антитела могут быть распределены по разным «классам». Идентифицировано пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть подразделены на «подклассы» (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Тяжелую цепь константных доменов, которая соответствует разным классам антител, называют α, δ, ∈, γ и μ соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термины «антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность» и «ADCC» относятся к клеточной реакции, в которой специфичные цитотоксичные клетки, экспрессирующие Fc рецепторы (FcR) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на целевой клетке и далее вызывают лизис целевой клетки. Первичные клетки для реакции ADCC, клетки NK экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FсγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках показана в таблице 3 на странице 464 в работе Раветча и Кинета (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991)). Для оценки ADCC активности интересующей молекулы проводят тест ADCC in vitro, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Применяемые в таких тестах эффекторные клетки включают мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК (PBMC)) и естественные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC активность интересующей молекулы может быть оценена in vitro, например, на модели животных, такой как описана в работе Клайнеса с соавт. (Clynes et al., PNAS (USA), 95: 652-656 (1998)).

Термин «эффекторные клетки человека» относится к лейкоцитам, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторную функцию. Предпочтительно клетка экспрессирует по меньшей мере FcγRIII и выполняет ADCC эффекторную функцию. Примеры человеческих лейкоцитов, которые вовлекаются в ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические T клетки нейтрофилы, при этом МНПК и NK клетки являются предпочтительными. Эффекторные клетки могут быть выделены из своего нативного источника, например из крови или МНПК, как показано в настоящем описании.

Термины «Fc рецептор» или «FcR» в контексте настоящего описания используется для описания рецептора, который связывается с Fc участком антитела. Предпочтительно FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой такой рецептор, который связывается с IgG антителом (гамма рецептор) и в