Вакцина, набор и способ лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов

Вакцина, набор и способ лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новым бактериальным изолятам, идентифицированным по их ДНК 16S pPHK и вызывающим пародонтоз у животных-компаньонов; к полинуклеотидным последовательностям, содержащимся в этих изолятах; к полипептидам, кодируемым такими полинуклеотидными последовательностями; и к вакцинам, содержащим указанные бактериальные изоляты, которые были инактивированы или аттенуированы, а также к их полинуклеотидам или полипептидам. Настоящее изобретение также относится к способам лечения и предупреждения пародонтоза и к наборам для диагностики, лечения и предупреждения пародонтоза. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам оценки эффективности вакцины против пародонтозов у животного.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В результате обследования людей или исследования бактерий, выделенных у этих людей, было получено большое число экспериментальных данных, относящихся к пародонтозам. О пародонтозе у животных, не являющихся человеком, таких как домашние питомцы, а в частности собаки и кошки, имеется относительно мало данных.

Пародонтоз представляет собой группу инфекций, поражающих опорные ткани зубов. Такие поражения могут быть как легкими, так и тяжелыми и могут проявляться обратимым воспалением десны (gingiva), хронической деструкцией тканей периодонта (десны, периодантальной связки и альвеолярного отростка) и, в конечном счете, выпадением зубов.

Некоторые признаки этого заболевания представляют интерес с микробиологической точки зрения. Бактериальная этиология этого заболевания является сложной, поскольку за развитие и прогрессирования этого заболевания у человека ответственны многие микроорганизмы. Многие из этих организмов, если не все, могут также присутствовать у человека со здоровыми зубами и могут существовать в гармоничном симбиозе с хозяином. Так, например, признаки такого заболевания могут возникать в результате смещения экологического баланса между бактериальным и хозяйским факторами, например в результате изменения абсолютного или относительного числа некоторых микроорганизмов, изменения патогенного потенциала или модуляции конкретных факторов хозяина. Локальное микроокружение накладывает ряд уникальных ограничений на компоненты микробиоты наддесневой поверхности зуба и поддесневой борозды (канала между корнем зуба и десной, который при прогрессировании заболевания распространяется на зубодесневой карман).

Обызвествленные твердые ткани зуба и эпителиальные клетки десны являются доступными для колонизации бактериями. Эти ткани подвергаются воздействию выделяющейся слюны и жидкости десневой борозды (экссудата сыворотки), которые оба содержат молекулы, непосредственно взаимодействующие с бактериями и значительно изменяющие условия окружающей микросреды. Кроме того, известно, что у человека микроорганизмы, которые успешно колонизируют зубную ткань и поддесневую область, должны сосуществовать со множеством (свыше 600) бактерий других видов, которые обитают на этих участках. Таким образом, исследование патогенеза пародонтозов у человека представляет определенные трудности из-за сложности экологического микроокружения.

Классификация различных манифестаций пародонтоза у человека постоянно меняется, однако достаточно упомянуть, что эти заболевания отличаются по степени тяжести, скорости прогрессирования и числу пораженных зубов и что после прорезывания молочных зубов люди различных возрастных групп могут быть восприимчивыми к этому заболеванию. При заболеваниях такого рода природа патогенных агентов варьируется у различных пациентов и даже у одного пациента на различных участках поражения тела этого пациента. Однако обычно тяжелые формы этого заболевания ассоциируются с рядом грамотрицательных анаэробных бактерий. Существует множество данных, свидетельствующих о том, что из этой группы бактерий, поражающих человека, определенную роль играет бактерия Porphyromonas gingivalis (ранее называемая Bacteroides). Присутствие этого микроорганизма, действующего отдельно или в совокупности с другими инвазивными бактериями, а возможно, в отсутствие полезных видов бактерий и некоторых иммунологических ответов у хозяина, очевидно, играет главную роль в развитии данного заболевания.

Для колонизации ротовой полости необходимо, чтобы бактерии сначала проникали в рот, а затем локализовались в ротовой полости и заселяли доступные поверхности. Защитными факторами хозяина, действие которых направлено на предупреждение бактериальной колонизации, являются механические сдвигающие силы, возникающие при движения языка вместе с потоком слюны и жидкости десневой борозды. Поэтому успешная колонизация ротовой полости имеет ряд характерных признаков, позволяющих преодолеть защитные механизмы хозяина. Биопленка, состоящая из “сидячих” бляшек, которая затем аккумулируется на твердых и мягких тканях ротовой полости, представляет собой динамическую систему, состоящую из различных микробиологических видов. У человека P. gingivalis являются поздними или вторичными инвазивными микроорганизмами, колонизирующими ротовую полость, и требуют присутствия микроорганизмов-предшественников для создания необходимых условий окружающей среды.

Считается, что начальное внедрение бактерии P. gingivalis в ротовую полость человека происходит путем ее передачи от инфицированного человека. Поэтому очевидно, что должны действовать и другие переносчики инфекции. Эти исследования показали, что некоторые индивидуумы заражаются микроорганизмом одного (или, по меньшей мере, преобладающего) генотипа независимо от участка колонизации или клинического статуса. В противоположность этому, у других индивидуумов присутствуют штаммы, происходящие от многих других клональных видов бактерий. Это подтверждает существующее мнение, что P. gingivalis является в основном условно-патогенным микроорганизмом, вирулентность которого не ограничена конкретным клональным типом.

Ротовая полость человека имеет множество поверхностей, которые могут быть заселены P. gingivalis. Такими поверхностями являются минерализованные твердые ткани зубов и поверхности слизистой, включая поверхности десны, щеки и языка.

Хотя о пародонтозе человека имеется много данных, описанных выше, однако о таком заболевании у домашних животных известно очень мало. В работе Foumier D. et al. “Porphorymonas gulae sp., nov., an Anaerobic, Gram-negative, Coccibacillus from the Gingival Sulcus of Various Animal Hosts”, International Journal of a Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), 51, 1179-1189, описано несколько штаммов, выделенных у различных животных-хозяев, включая штамм P.gulae spp.nov., имеющий регистрационный номер АТСС 57100, Авторами настоящего изобретения была выдвинута гипотеза, что штаммы биотипа P. gingivalis, поражающие животных, представляют собой виды Porphyromonas, которые отличаются от P. gingivalis. При этом в данной работе нет каких-либо упоминаний о вакцине, которая может быть использована для лечения пародонтоза у животных-компаньонов. В работе Hirasawa и Takada “Porphyromonas gingivicanis sp.nov. and Porphyromonas crevioricanis sp. nov., Isolated from Beagles”, International Journal of Systemic Bacteriology, pp.637-640 (1994) описаны два вида бактерий, выделенных из жидкости десневой борозды коротконогих гончих. Эти виды бактерий описаны в патентах США № 5710039 и 5563063. Авторы указанных работ не высказывают каких-либо предположений об использовании этих видов бактерий в вакцине против пародонтоза. В международной заявке РСТ/AU98/01023, опубликованной под номером WO 99/19870, описаны различные полипептиды и нуклеотиды P. gingivalis. Однако в этой работе отсутствуют какие-либо упоминания о вакцинах, эффективных для предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов. Хотя имеется большое количество информации об этом заболевании у человека, однако было предпринято очень мало мер по предупреждению или лечению такого заболевания даже у человека.

Поэтому необходимость в разработке надежной и эффективной вакцины для лечения и предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов остается актуальной.

В работе Genco et al. (Trends in Microbiology 6:444-449, 1998) описана крысиная модель для исследования пародонтоза, опосредуемого Porphyromonas gingivicanis. В работе Grecca et al. (J. Endodontics 27: 610, 2001) описано рентгенографическое исследование восстановления околокорневой части зуба после лечения эндодонта зубов у собак с индуцированным периодонтитом околокорневой части зуба.

В работах, предшествующих настоящему изобретению, отсутствуют какие-либо упоминания о животном-модели, подходящем для оценки эффективности вакцины против одной или нескольких периопатогенных бактерий описательным или количественным методом.

ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным пигментированным анаэробным бактериям, имеющим последовательность ДНК для 16S рРНК, включающую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86-94, при условии что указанная бактерия не является собачьим штаммом Porphyromonas gingivalis, обозначенным 20В.

В одном из вариантов изобретения данная бактерия выбрана из группы, состоящей из Porphyromonas gulae B43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae В69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa В104, O. denticanis B106 и P. endodontalis В114, при условии что указанные бактерии не являются собачьим штаммом Porphyromonas gingivalis, обозначенным 20В.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенной пигментированной анаэробной бактерии, которая вызывает либо непосредственно, либо в комбинации с другими патогенными агентами пародонтоз у животных-компаньонов, где указанная бактерия может быть использована в целях приготовления вакцины для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, где указанная вакцина содержит иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одной бактерии, которая была инактивирована или аттенуирована, при условии что такая бактерия не является штаммом P. gulae sp. nov., имеющим регистрационный номер АТСС 51700. Предпочтительно указанная бактерия имеет последовательность ДНК 16S pPHK, которая, по меньшей мере, примерно на 95% гомологична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 86-94. Более предпочтительно указанная бактерия имеет последовательность ДНК 16S pPHK, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86-94.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенной пигментированной анаэробной бактерии, которая вызывает либо непосредственно, либо в комбинации с другими патогенными агентами пародонтоз у животных-компаньонов, где указанная бактерия может быть использована в целях приготовления вакцины для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, где указанная вакцина содержит выделенный полипептид в количестве, иммунологически эффективном для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов, где указанный полипептид кодируется полинуклеотидной молекулой, выделенной из указанной бактерии, при условии что указанная бактерия не является штаммом P. gulae sp. nov., имеющим регистрационный номер АТСС 51700. Предпочтительно указанная бактерия имеет последовательность ДНК 16S pPHK, которая, по меньшей мере, примерно на 95% гомологична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 86-94. Более предпочтительно указанная бактерия имеет последовательность ДНК 16S pPHK, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86-94.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенной пигментированной анаэробной бактерии, которая вызывает либо непосредственно, либо в комбинации с другими патогенными агентами пародонтоз у животных-компаньонов, где указанная бактерия может быть использована в целях приготовления вакцины для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, где указанная вакцина содержит выделенную полинуклеотидную молекулу, кодирующую полипептид в количестве, иммунологически эффективном для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов, где указанная полинуклеотидная молекула выделена из указанной бактерии, при условии что указанная бактерия не является штаммом P. gulae sp. nov., имеющим регистрационный номер АТСС 51700. Предпочтительно указанная бактерия имеет последовательность ДНК 16S pPHK, которая, по меньшей мере, примерно на 95% гомологична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 86-94. Более предпочтительно указанная бактерия имеет последовательность ДНК 16S pPHK, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86-94.

Предпочтительным животным-компаньоном является собака или кошка.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной полинуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, выделенную из бактерий, выбранных из группы, состоящей из бактерий, имеющих идентифицирующие признаки Porphyromonas gulae B43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae В69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa В104, O. denticanis B106 и P. endodontalis В114, при условии что указанные бактерии не являются штаммом P.gulae sp. nov., имеющим регистрационный номер АТСС 51700.

В одном из вариантов изобретения указанная выделенная полинуклеотидная молекула выделена из бактерии, выбранной из группы, состоящей из Porphyromonas gulae B43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae В69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa В104, O. denticanis B106 и P. endodontalis В114.

В другом варианте изобретения выделенный полинуклеотид кодирует полипептид.

В еще одном варианте изобретения выделенный полинуклеотид кодирует рибосомную РНК или транспортную РНК.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенной полинуклеотидной молекуле, содержащей любую из нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 86-94 и их гомологов, имеющих, по меньшей мере, 95% гомологию, при условии что указанная нуклеотидная последовательность не является последовательностью ДНК 16S pPHK, происходящей от бактерии P. gulae sp. nov., имеющей регистрационный номер АТСС 51700.

Предпочтительно выделенная полинуклеотидая молекула, содержащая любую из нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95-102 и 111-119 (fimA или oprF соответственно), где указанная последовательность кодирует полипептид или комплементарные ему последовательности, обладающие иммунологической эффективностью в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов.

Также предпочтительным является выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая любую из нуклеотидных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 95-102 и 111-119, их гомологов, которые, по меньшей мере, на 95% гомологичны этим последовательностям, где указанная последовательность кодирует полипептид или комплементарные ему последовательности, обладающие иммунологической эффективностью в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов.

В другом варианте изобретения выделенная полинуклеотидная молекула содержит любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 95-102 и 111-119 или их фрагментов или вариантов, где указанная последовательность кодирует полипептид или комплементарные ему последовательности, обладающие иммунологической эффективностью в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов.

В еще одном варианте изобретения выделенная полинуклеотидная молекула содержит нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 95-102 и 111-119 или с их комплементарной ей последовательностью. Предпочтительно указанная выделенная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность fimA, выбранную из любых последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 95-102, ее фрагмента или варианта, где указанный фрагмент или вариант имеет последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 98% или 99% идентична указанной последовательности. Также предпочтительной является выделенная полинуклеотидная молекула, последовательность которой содержит последовательность oprF, выбранную из любых последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 111-119, ее фрагмента или варианта, где указанный фрагмент или вариант имеет последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 98% или 99% идентична указанной последовательности.

Предпочтительно указанный фрагмент или вариант полинуклеотидной последовательности согласно изобретению, по меньшей мере, примерно на 98% гомологичен этой последовательности.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к выделенной полинуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с последовательностью fimA, выбранной из любых последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 95-102, или с комплементарными ей последовательностями.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к выделенной полинуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с последовательностью oprF, выбранной из любых последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 111-119, или с комплементарными ей последовательностями.

Настоящее изобретение также относится к выделенной полинуклеотидной молекуле, содержащей нуклеотидную последовательность примерно из 30 нуклеотидов, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий, по меньшей мере, примерно 10 смежных аминокислот любого из полипептидов, кодируемых любыми из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 95-102 и 109-119, или комплементарными последовательностями. Предпочтительно указанная выделенная полинуклеотидная молекула содержит, по меньшей мере, примерно 90 нуклеотидов, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с молекулой ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий последовательность, которая состоит, по меньшей мере, примерно из 30 смежных аминокислот любого из полипептидов, кодируемых любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 95-102 и 111-119, или комплементарными последовательностями.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду согласно изобретению, функционально присоединенному к гетерологичному промотору. Такой выделенный полинуклеотид может также содержать ориджин репликации, обладающий активностью в прокариотической или в эукариотической клетке.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному экспрессионному вектору, содержащему полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из любой нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 95-102 и 111-119, их фрагментов или вариантов, функционально присоединенных к промоторной последовательности.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к плазмиде, содержащей полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из любой нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 95-102 и 111-119, их фрагментов или вариантов, функционально присоединенных к промоторной последовательности.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную полинуклеотидную последовательность, вектор или плазмиду согласно изобретению.

Предпочтительно указанной клеткой-хозяином является BL21 E.coli, а указанный полинуклеотид дополнительно содержит экспрессионный вектор pBAD/HisA или экспрессионную плазмиду λ.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного FimA или OprF, выбранного из любых последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 103-110 или 120-128, или их фрагментов или вариантов, где указанный способ включает (1) культивирование клеток по пункту 36 формулы изобретения в условиях, при которых экспрессируется полипептид, содержащий FimA, OprF или их фрагменты или варианты, и (2) выделение указанного полипептида. Такой полипептид может быть выделен в растворимой или в нерастворимой форме.

В другом аспекте изобретения выделенный полипептид согласно изобретению является иммунологически эффективным при его использовании в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103-110 и 120-128.

В одном из вариантов изобретения указанный выделенный полипептид является иммунологически эффективным при его использовании в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103-110 и 120-128, и ее гомологи, имеющие последовательность, по меньшей мере, на 95%, 98% или на 99% идентичную этой последовательности.

В другом варианте изобретения указанный выделенный полипептид является иммунологически эффективным при его использовании в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов и содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103-110 и 120-128, или ее фрагменты или варианты.

В еще одном варианте изобретения указанный выделенный полипептид является иммунологически эффективным при его использовании в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов и содержит аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 95-102 и 111-119.

В еще одном варианте изобретения указанный выделенный полипептид является иммунологически эффективным при его использовании в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов, где указанный полипептид содержит, по меньшей мере, примерно 10 смежных аминокислот, составляющих фрагмент любой из полипептидных последовательностей SEQ ID NO: 103-110 и 120-128, и где указанный полипептид является иммунологически эффективным при его использовании либо отдельно, либо в сочетании с носителем, в качестве вакцины для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов. Такой выделенный полипептид предпочтительно содержит, по меньшей мере, примерно 25 аминокислот.

Предпочтительно выделенный полипептид, предназначенный для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов, кодируется молекулой ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, включающую последовательность fimA (SEQ ID NO: 95-102).

Предпочтительным также является выделенный полипептид, предназначенный для предупреждения или лечения пародонтоза у животных-компаньонов и кодируемый молекулой ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, включающую последовательность oprF (SEQ ID NO: 111-119).

В предпочтительном варианте изобретения указанным выделенным полипептидом является рекомбинантно экспрессируемый полипептид, выбранный из группы, состоящей из FimA (SEQ ID NO: 103-110) и OprF (SEQ ID NO: 120-128).

В другом варианте изобретения указанный рекомбинантно экспрессируемый полипептид присоединен к полипептиду-носителю. Предпочтительно указанный гибридный полипептид, по существу, имеет полигистидиновую или политреониновую последовательность.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одной инактивированной пигментированной анаэробной бактерии согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к вакцине для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одной инактивированной пигментированной анаэробной бактерии; и, по меньшей мере, одной другой бактерии или вируса; и фармацевтически приемлемый носитель.

В предпочтительном варианте изобретения указанная вакцина содержит иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одной инактивированной пигментированной анаэробной бактерии; по меньшей мере, одного вируса чумы собак (CDV), собачьего аденовируса-2 (CAV-2), собачьего парвовируса (CPV), вируса собачьего парагриппа (CPI) или собачьего коронавируса (CCV) и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одного полинуклеотида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одного полипептида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Предпочтительно указанная вакцина для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов содержит иммунологически эффективное количество FimA и фармацевтически приемлемый носитель.

Предпочтительной также является вакцина для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащая иммунологически эффективное количество OprF и фармацевтически приемлемый носитель.

Бактерия, предназначенная для использования в вакцинах согласно изобретению, может быть выбрана из группы, состоящей из Porphyromonas gulae B43, P. cansulci В46, P. circumdentaria В52, P. gulae В69, P. circumdentaria В97, P. cangingivalis В98, P. salivosa В104, O. denticanis В106 и P. endodontalis В114.

В предпочтительном варианте изобретения пигментированными анаэробными бактериями являются P. gulae В43, P. salivosa В104 и O. denticanis В106.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одной инактивированной выделенной пигментированной анаэробной бактерии согласно изобретению, фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одной полинуклеотидной молекулы согласно изобретению, фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, содержащей иммунологически эффективное количество, по меньшей мере, одного полипептида согласно изобретению, фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, адъювант.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов, включающему введение указанному животному-компаньону, нуждающемуся в этом, вакцинной композиции согласно изобретению.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики пародонтоза у животных-компаньонов, проводимой путем анализа образца на присутствие бактерий, полипептидов или полинуклеотидов согласно изобретению, где такое присутствие бактерий, полипептидов или полинуклеотидов согласно изобретению является показателем заболевания. Предпочтительно стадия анализа включает оценку образца методом, выбранным из группы, состоящей из ПЦР, гибридизации и детекции антитела.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему, по меньшей мере, в одном контейнере, композицию, предназначенную для лечения и предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов и содержащую эффективное количество, по меньшей мере, одной инактивированной выделенной пигментированной анаэробной бактерии, полипептида или полинуклеотида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, где указанный набор дополнительно содержит отпечатанные инструкции по применению данного набора для лечения или предупреждения пародонтоза у животных-компаньонов. Такой набор может также содержать средство для введения указанной композиции.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему, по меньшей мере, в одном контейнере, выделенную молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, состоящую, по меньшей мере, примерно из 15 смежных нуклеотидов, выбранных из любых последовательностей SEQ ID NO: 86-94, 95-102 и 111-119, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с последовательностью, комплементарной любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 86-94, 95-102 и 111-119, и вторую выделенную молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, содержащуюся во втором контейнере и включающую нуклеотидную последовательность, состоящую, по меньшей мере, примерно из 15 смежных нуклеотидов и выбранную из последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 86-94, 95-102 и 111-119, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 86-94, 95-102 и 111-119, где указанный набор дополнительно включает инструкции по его применению для детекции Porphyromonas spp. Указанный метод может быть применен, по существу, для всех млекопитающих включая человека.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему, по меньшей мере, в одном контейнере, белок, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, 30 смежных аминокислот, где указанный полипептид кодируется любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 95-102 и 111-119, и рекомендации по применению данного набора для детекции Porphyromonas spp. Этот набор может дополнительно включать второй полипептид, который представляет собой антитело, конъюгированное с ферментом, катализирующим колориметрические или хемилюминесцентные реакции. Такой фермент предпочтительно выбран из группы, состоящей из щелочной фосфатазы и пероксидазы хрена. Указанный набор может дополнительно содержать реагенты для колориметрического или хемилюминесцентного анализа.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к набору для гибридизации, содержащему, по меньшей мере, в одном контейнере, выделенную молекулу ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, состоящую, по меньшей мере, примерно из 15 смежных нуклеотидов и выбранную из любых последовательностей SEQ ID NO: 86-94, 95-102 и 111-119, или комплементарных ей последовательностей, где указанная гибридизация является специфической по отношению к Porphyromonas spp. и где указанный набор дополнительно содержит инструкции по его применению для детекции Porphyromonas spp. Такую гибридизацию предпочтительно осуществляют в условиях высокой жесткости.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки эффективности вакцины против одной или нескольких периопатогенных бактерий у животного, а в частности у собак.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки эффективности вакцины против одной или нескольких периопатогенных бактерий, где клиническими признаками, диагностированными у животного, являются повышенные уровни одного или нескольких периопатогенных бактерий в жидкости десневого кармана, в бляшках, в инфицированной кости или в зубодесневом кармане, или изменения количества альвеолярного отростка, определенные посредством рентгенографических измерений.

Бактерии, полинуклеотиды, полипептиды, вакцины, вакцинные композиции или наборы согласно изобретению не включают ни одну из бактерий и ни один из полинуклеотидов или пептидов, описанных в публикации Fournier D. et al., “Porphyromonas gulae sp. nov., an Anaerobic, Gram-negative, Coccibacillus from the Gingical Sulcus of Various Animal Hosts”, International Journal of a Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), 51, 1179-1189, включая штамм P. gulae sp. nov., имеющий регистрационный номер АТСС 51700; и в публикации Hirasawa and Takada, “Porphyromonas gingivicanis sp. nov. and Porphyromonas crevioricanis sp. nov., Isolated from Beagles”, International Journal of Systemic Bacteriology, pp.637-640 (1994), в патентах США № 5710039 или 5563063, или в международной заявке РСТ/AU98/01023, опубликованной под регистрационным номером WO 99/29870.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

На фиг.1 представлено филогенетическое дерево, построенное методом “ближайшего соседа” (neighbor-joining) для репрезентативных бактерий класса Bacteroidetes. Это филогенетическое дерево было построено с использованием компьютерных программ CLUSTAL Х, версия 1,81, и NJ Plot (обе эти программы можно найти на сайте ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalXJ). Указанное дерево было укоренено, и его основанием (корнем) является последовательность гена 16S pPHK Esсherichia coli (регистрационный номер J01695; данные не приводятся). “Бутстреп”-анализ осуществляли с использованием 1000 копий. Бутстреп-величины представлены графически (● - >950; ■ - >850; ○ - >700; □ - >500; не обозначено - <500). Отрезок на графике, 0,01, представляет масштаб замен на одно положение нуклеотида. Стрелки указывают на локализацию O.denticanis B106^T. Регистрационные номера: P. gingivalis ATCC 33277, J01695; P. gulae B243, AF285874; P. cansulci VPB 4875, X76260; P. salivosa NCTC 11632, L26103; P. endodontalis ATCC 35406, AY253728; T. forsythensis ATCC 43037, AB035460; Bacteroides cf. forsythus, клон BU45, выделенный из ротовой полости, AF385565; B. merdae ATCC 43184T, X83954; B. distasonis ATCC 8503, M86695; бактерия лошадиных фекалий, 118ds10, AY212569; D. shahii, штамм CCUG 43457, AJ319867; клон некультивированной бактерии Bacteroideceae: Rs-P82, AB088919; некультивированная бактерия cadhufec 059h7, AF530302; B. splanchnicus NCTC 10825, L16496; O. denticanis B106^T, AY560020; Bacteroidetes sp., клон ротовой полости FX069, AY134906; некультивированная бактерия SHA-38, AJ249105; A. putredinis ATCC 29800, L16497; R. microfusus ATCC 29728, L16498; B. denticanium B78, AY549431; B. fragilis ATCC 25285T, X83935; B. thetaiotaomicron, штамм 17.4, AY319392; B. acidofaciens, штамм А37, AB021163; P. bivia ATCC 29303, L16475; P. nigrescens ATCC 25261, L16479; P. intermedia ATCC 25611, L16468; P. denticola ATCC 35308, L16467 и P. buccae ATCC 33690, L16478.

На фиг.2 представлено филогенетическое дерево, построенное методом “ближайшего соседа” для клинических изолятов бактерий Odoribacter denticanis. Это филогенетическое дерево было построено, как показано на фиг.1. Указанное дерево было укоренено, и его основанием является последовательность гена 16S pPHK Porphyromonas gingivalis ATCC 53977 (регистрационный номер L16492; данные не приводятся). Отрезок на графике, 0,01, представляет масштаб замен на одно положение нуклеотида. Регистрационные номера: O.denticanis B106^T, AY560020; O.denticanis B113, AY560022; O.denticanis B150, AY560027; O.denticanis B155, AY560030; O.denticanis B172, AY560033; O.denticanis B183, AY560035; Bacteroidetes sp., клон FX069, выделенный из ротовой полости, AY134906; некультивированная бактерия cadufec 059h7, AF530302; B. splanchnicus NCTC 10825 и клон некультивированной бактерии Bacteroideceae: Rs-P82, AB088919.

На фиг.3 представлено филогенетическое дерево, построенное методом “ближайшего соседа” для репрезентативных белков семейства FimA Porphyromonas gingivalis (классы I-V). Это филогенетическое дерево было построено с использованием компьютерных программ CLUSTAL Х, версия 1.81, и NJ Plot. Это дерево было укоренено, и его основанием является белок фимбриллин CFT073 Esсherichia coli (регистрационный номер NP_757241; данные не приводятся). Бутстреп-анализ осуществляли с использованием 1000 копий. Бутстреп-величины представлены графически (● - >950; ■ - >850; ○ - >700; □ - >500; не обозначено, - <500). Отрезок на графике, 0,05, представляет масштаб замен на одно положение аминокислоты. Регистрационные номера FimA: O.denticanis B106^T, AY573801; P.gingivalis HG1691, Q93R80; P.gingivalis BH18/10, JN0915; P.gingivalis ATCC 33277, Р13793; P.gingivalis OMZ314, BAA04624; P.gingivalis OMZ409, Q51822; P.gingivalis 6/26, Q51826; P.gingivalis ATCC 49417, Q51825; P.gingivalis W83, AAQ67087; P.gingivalis HG564, Q51827 и P.gingivalis HNA-99, Q9S0W8.

На фиг.4 представлены фотографии (А) P.gulae B43 и (В) O.denticanis B106^T, полученные на сканирующем электронном микроскопе. Указанный отрезок означает масштаб размера - 1000 нм.

На фиг.5 графически представлены результаты исследования, проводимого путем культивирования, в котором была идентифицирована “не содержащая продуктов животного происхождения” среда, поддерживающая рост штамма Porphyromonas gulae B43. Были протестированы следующие среды: полная среда МЕ, среда МЕ с гемином, среда МЕ с витамином К, среда МЕ с гемином и витамином К, полная среда PYG, среда PYG с гемином, среда PYG с витамином K, среда PYG с гемином и витамином К и среда BHI.

На фиг.6 графически представлена средняя степень разрежения кости у мышей после суперинфицирования бактериями указанных видов. Мышей подвергали ложному инфицированию или подвергали инфициров