Композиции и способы для регуляции развития сосудов

Композиции и способы для регуляции развития сосудов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Эта непредварительная заявка, поданная согласно 37 CFR §1.53(b), претендует на приоритет согласно 35 USC §119(e) предварительной заявки США с серийным №60/562054, поданной 14 апреля 2004 г.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в основном к композициям и способам, которые эффективны для регуляции развития сосудов. Конкретно настоящее изобретение относится к EGF-подобному домену 7 (EGFL7), новому происходящему из клеток эндотелия секретируемому фактору. Кроме того, настоящее изобретение относится к диагностике и лечению связанных с ангиогенезом состояний и заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Развитие сосудистого снабжения представляет собой основную потребность для многих физиологических и патологических процессов. Активно растущие ткани, такие как эмбриональные и опухолевые, испытывают потребность в адекватном кровоснабжении. Эту потребность они удовлетворяют продукцией проангиогенных факторов, способствующих образованию новых кровеносных сосудов посредством процесса, называемого ангиогенезом. Формирование сосудистой трубки представляет собой сложное, но упорядоченное биологическое событие, включающее все или многие из следующих стадий: a) эндотелиальные клетки (EC) пролиферируют из существующих EC или дифференцируются из клеток-предшественников; b) EC мигрируют и объединяются, формируя тяжеподобные структуры; c) затем сосудистые тяжи претерпевают тубулогенез, образуя сосуды с центральным просветом; d) существующие тяжи или сосуды дают отростки, формируя вторичные сосуды; e) первичная сосудистая сеть подвергается дальнейшему реструктурированию и видоизменению; и f) для заключения эндотелиальных трубок в оболочку привлекаются периэндотелиальные клетки, обеспечивающие поддерживающие и регулирующие функции для сосудов; такие клетки включают перициты для мелких капилляров, гладкомышечные клетки для крупных сосудов и миокардиальные клетки в сердце. Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003).

В настоящее время точно установлено, что ангиогенез вовлечен в патогенез множества нарушений. Они включают солидные опухоли и метастазирование, атеросклероз, ретролентальную фиброплазию, гемангиомы, хроническое воспаление, внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как пролиферативные ретинопатии, например диабетическая ретинопатия, связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (AMD), неоваскулярная глаукома, иммунное отторжение трансплантированной ткани роговицы и других тканей, ревматоидный артрит и псориаз. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992); Klagsbrunet al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); а также Garner A., "Vascular diseases", в: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.

В случае опухолевого роста ангиогенез является решающим для перехода из гиперплазии в неоплазию и для обеспечения питательных веществ для роста и метастазирования опухоли. Folkman et al., Nature 339: 58 (1989). Образование новых сосудов позволяет опухолевым клеткам приобретать преимущество в росте и автономию пролиферации в сравнении с обычными клетками. Как правило, опухоль начинается с отдельной патологически измененной клетки, способной пролиферировать только до размера нескольких кубических миллиметров вследствие удаления от доступных капиллярных русел, кроме того, опухоль может в течение продолжительного периода времени оставаться в “состоянии покоя” в отсутствие дополнительного роста и распространения. Затем некоторые опухолевые клетки переключаются на ангиогенный фенотип для активации эндотелиальных клеток, которые пролиферируют и развиваются в новые капиллярные кровеносные сосуды. Эти вновь сформированные кровеносные сосуды делают возможным не только непрерывный рост первичной опухоли, но также и распространение и повторное заселение метастатическими опухолевыми клетками. Соответственно была выявлена взаимосвязь между плотностью сосудов микроциркуляции в опухолевых срезах и выживаемостью пациентов при раке молочной железы, а также при некоторых других опухолях. Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992). Точные механизмы, контролирующие переключение на ангиогенез, не совсем ясны, однако предполагают, что формирование новых сосудов в опухолевом образовании происходит на основании общего соотношения стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза (Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31).

Процесс развития сосудов жестко регулируется. К настоящему времени было выявлено значительное число молекул, в основном продуцируемых окружающими клетками секретируемых факторов, которые регулируют дифференцировку, пролиферацию, миграцию и объединение EC в тяжеподобные структуры. Например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) был выявлен в качестве ключевого фактора, вовлеченного в стимуляцию ангиогенеза и в индукцию сосудистой проницаемости. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997). Открытие, что потеря даже одного аллеля VEGF приводит к эмбриональной смертности, указывает на незаменимую роль, которую играет этот фактор в развитии и дифференцировке сосудистой системы. Кроме того, было показано, что VEGF представляет собой ключевой медиатор в образовании новых сосудов, связанном с опухолями и внутриглазными заболеваниями. Ferrara et al., Endocr. Rev. выше. Большинство исследуемых опухолей человека сверхэкспрессируют мРНК VEGF. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995).

Кроме того, уровни концентрации VEGF в жидкостях глаза в высокой степени соотносятся с наличием активной пролиферации кровеносных сосудов у пациентов с диабетической и другими связанными с ишемией ретинопатиями. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994). Кроме того, в исследованиях было установлено расположение VEGF в оболочках новых хориоидальных сосудов пациентов, страдающих AMD. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996).

Нейтрализующие антитела к VEGF подавляют рост множества линий опухолевых клеток человека в голых мышах (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)), а также ингибируют внутриглазной ангиогенез в моделях с ишемическими нарушениями сетчатки. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Поэтому моноклональные антитела к VEGF или другие ингибиторы действия VEGF являются многообещающими кандидатами для лечения опухолей и различных связанных с новообразованными сосудами внутриглазных нарушений. Такие антитела описаны, например, в патенте EP 817648, опубликованном 14 января 1998; а также в патентах WО98/45331 и WО98/45332, опубликованных 15 октября 1998. Одно из таких антител к VEGF, бевацизумаб, было утверждено FDA для использования в сочетании с курсом химиотерапии для лечения метастазирующего рака прямой и ободочной кишки (CRC). Также во многих продолжающихся клинических испытаниях бевацизумаб исследуют на предмет лечения по различным раковым показаниям.

Известно, что внеклеточный матрикс (ECM) играет важную роль в ходе процесса ангиогенеза. Madri, Transpl. Immunol. 5:179-83 (1997). В ходе своей миграции EC окружены поддерживающим ECM и после формирования просвета прилегают к вновь синтезированным базальным мембранам сосудов. Было показано, что кроме обеспечения поддерживающего каркаса в ходе морфогенеза капилляров ECM осуществляет комплексный местный контроль над функциями EC. Например, ECM способен регулировать доступность для EC растворимых ангиогенных медиаторов и определять характер и тип взаимодействий с интегрином и молекулами клеточной адгезии. Также было предположено, что выживаемость EC регулируется взаимодействием рецепторов фактора роста и интегринов, которые, в свою очередь, регулируются составом местного ECM. Stupack and Cheresh, Oncogene 22:9022-29 (2003).

Несмотря на многие достижения в области ангиогенеза некоторые из стадий в ходе формирования трубки сосуда все еще плохо охарактеризованы. В частности, мало известно о регуляции тубулогенеза - как развиваются сосудистые тяжи, преобразовываясь в трубки, и какие факторы регулируют этот переход. Учитывая роль ангиогенеза во многих заболеваниях и нарушениях, желательно обладать средствами снижения или ингибирования одного или нескольких биологических эффектов, обусловленных этими процессами. Также желательно обладать способами анализа наличия патогенных полипептидов в нормальном и патологическом состояниях, а особенно при злокачественной опухоли. Также существует необходимость в выявлении мишеней и разработке способов, которые могут повышать эффективность существующих противоангиогенных способов лечения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на выявлении и охарактеризовывании происходящего из EC нового секретируемого фактора, EGF-подобного домена 7 (EGFL7). EGFL7 экспрессируется на высоких уровнях в сосудистой системе, связанной с пролиферацией ткани, и подавляется в большинстве зрелых сосудов в нормальных взрослых тканях. Утрата функции EGFL7 вызывала значительные сосудистые дефекты в эмбрионах животных и снижала рост опухоли. Основываясь на его структуре, экспрессии и активности, EGFL7 считают новой молекулой ECM. Кроме того, открыто, что EGFL7 поддерживает адгезию и миграцию EC, а также вовлечен в выполнение поддерживающей функции для ангиогенных факторов в опухолевом ангиогенезе. С другой стороны, было открыто, что антагонисты EGFL7 эффективно блокируют связанные с EGFL7 адгезию и миграцию EC. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает новые композиции и их применение для регуляции (например, стимуляции или ингибирования) вовлеченных в ангиогенез процессов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую антагонист EGFL7 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В одном из аспектов композиция содержит терапевтически эффективное количество антагониста. В другом аспекте композиция содержит дополнительный активный ингредиент, например противоангиогенное средство. Предпочтительно композиция стерильна. Антагонист EGFL7 можно вводить в форме жидкого фармацевтического препарата, который можно консервировать для достижения устойчивости при длительном хранении. Консервированные жидкие фармацевтические препараты могут содержать многократные дозы антагониста EGFL7 и поэтому могут быть приемлемы для многократного применения. В предпочтительном варианте осуществления, где композиция содержит антитело, антитело представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения такой композиции, приемлемой для лечения связанного с ангиогенезом нарушения, где способ предусматривает смешивание терапевтически эффективного количества антагониста EGFL7 с фармацевтически приемлемым носителем.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает изделие, содержащее:

(a) композицию, содержащую антагонист EGFL7;

(b) контейнер, содержащий указанную композицию; и

(c) прикрепленный к указанному контейнеру ярлык или включенный в указанный контейнер листок-вкладыш, относящиеся к использованию указанного антагониста EGFL7 в лечении связанного с ангиогенезом нарушения, где антагонист может представлять собой антитело, связывающееся с EGFL7 и блокирующее его активность. Композиция может содержать терапевтически эффективное количество антагониста EGFL7.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ выявления соединения, ингибирующего активность полипептида EGFL7, где способ предусматривает контактирование тестируемого соединения с полипептидом EGFL7 в условиях и в течение времени, достаточных для возможного взаимодействия тестируемого соединения и полипептида, а также предусматривает определение, ингибируется ли активность полипептида EGFL7. В конкретном предпочтительном аспекте либо тестируемое соединение, либо полипептид EGFL7 иммобилизуют на твердом носителе. В другом предпочтительном аспекте неиммобилизованный компонент несет детектируемую метку. В предпочтительном аспекте этот способ содержит стадии:

(a) контактирования клеток и подлежащего отбору тестируемого соединения в присутствии полипептида EGFL7 в условиях, приемлемых для индукции клеточного ответа, обычно вызываемого полипептидом EGFL7; и

(b) определения индукции указанного клеточного ответа для определения, является ли тестируемое соединение эффективным антагонистом.

В другом предпочтительном аспекте этот процесс содержит стадии:

(a) контактирования клеток и подлежащего отбору тестируемого соединения в присутствии полипептида EGFL7 в условиях, приемлемых для стимуляции пролиферации клеток полипептидом EGFL7; и

b) измерения пролиферации клеток для определения, является ли тестируемое соединение эффективным антагонистом.

Один из типов антагониста полипептида EGFL7, ингибирующий одну или несколько функций или активностей полипептида EGFL7, представляет собой антитело. Таким образом, в другом аспекте изобретение обеспечивает выделенное антитело, связывающее полипептид EGFL7. В предпочтительном аспекте антитело представляет собой моноклональное антитело, предпочтительно имеющее не принадлежащие человеку остатки гипервариабельного участка (CDR) и принадлежащие человеку остатки каркасной области (FR). Антитело может быть меченым и может быть иммобилизованным на твердом носителе. В другом аспекте антитело представляет собой фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека. Предпочтительно антитело специфически связывается с полипептидом.

В еще одном аспекте изобретение обеспечивает способ диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения у млекопитающего, предусматривающий анализ уровня экспрессии кодирующего полипептид EGFL7 гена (a) в тестируемом образце клеток ткани, который получают от указанного млекопитающего, и (b) в контрольном образце известных нормальных клеток ткани того же клеточного типа, где более высокий или низкий уровень экспрессии в тестируемом образце в сравнении с контрольным образцом указывает на наличие у указанного млекопитающего сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения. Экспрессию кодирующего полипептид EGFL7 гена можно, необязательно, определять измерением уровня мРНК или полипептида в тестируемом образце в сравнении с контрольным образцом.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения у млекопитающего, предусматривающий выявление наличия или отсутствия полипептида EGFL7 в тестируемом образце клеток ткани, который получают от указанного млекопитающего, где наличие или отсутствие указанного полипептида EGFL7 в указанном тестируемом образце указывает на наличие у указанного млекопитающего сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения у млекопитающего, предусматривающий (a) контактирование антитела к EGFL7 с тестируемым образцом клеток ткани, который получают у млекопитающего, и (b) детектирование образования комплекса между антителом и полипептидом EGFL7 в тестируемом образце, где образование указанного комплекса указывает на наличие у млекопитающего сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения. Детектирование может быть качественным или количественным, и его можно проводить в сравнении с наблюдением образования комплекса в контрольном образце известных нормальных клеток ткани того же клеточного типа. Большее или меньшее количество формируемых в тестируемом образце комплексов указывает на наличие сердечно-сосудистой, эндотелиальной или ангиогенной дисфункции у млекопитающего, от которого были получены тестируемые клетки ткани. Предпочтительно антитело несет детектируемую метку. Образование комплекса можно наблюдать, например, посредством световой микроскопии, проточной цитометрии, флуориметрии или других известных в данной области способов. Как правило, тестируемый образец получают у индивидуума, у которого предполагают наличие сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ определения наличия полипептида EGFL7 в образце, предусматривающий воздействие антитела к EGFL7 на образец, в котором предполагают наличие полипептида EGFL7, и определение связывания указанного антитела с компонентом указанного образца. В конкретном аспекте образец содержит клетку, предположительно содержащую полипептид EGFL7, и антитело связывается с клеткой. Предпочтительно антитело метят детектируемой меткой и/или связывают с твердым носителем.

В других аспектах изобретение обеспечивает набор для диагностики сердечно-сосудистого, эндотелиального или ангиогенного нарушения, содержащий антитело к EGFL7 и носитель в подходящей упаковке. Предпочтительно такой набор дополнительно содержит инструкции по применению указанного антитела для выявления наличия полипептида EGFL7. Предпочтительно носитель представляет собой, например, буфер. Предпочтительно сердечно-сосудистое, эндотелиальное или ангиогенное нарушение представляет собой злокачественную опухоль.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ снижения или ингибирования ангиогенеза у индивидуума со связанным с ангиогенезом патологическим состоянием, где способ предусматривает введение индивидууму антагониста EGFL7, способного препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции эндотелиальных клеток, тем самым снижая или ингибируя у индивидуума ангиогенез. Предпочтительно антагонист EGFL7 представляет собой антитело к EGFL7. Способность антагониста препятствовать индуцируемой EGFL7 миграции EC можно выявлять, например, в анализе миграции клеток in vitro.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления связанное с ангиогенезом патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль. В другом предпочтительном варианте осуществления связанное с ангиогенезом патологическое состояние представляет собой внутриглазное неоваскулярное заболевание. В еще одном предпочтительном варианте осуществления антагонист EGFL7 вводят совместно с другим противоангиогенным средством, таким как антитело к VEGF, в том числе бевацизумаб. Также настоящее изобретение обеспечивает способ повышения эффективности лечения противоангиогенным средством индивидуума со связанным с ангиогенезом патологическим состоянием, где способ предусматривает введение индивидууму антагониста EGFL7 в сочетании с противоангиогенным средством. Такой способ эффективен в лечении злокачественных опухолей или внутриглазных неоваскулярных заболеваний, особенно тех заболеваний или стадий заболеваний, которые плохо поддаются лечению только противоангиогенным средством. Противоангиогенное средство может представлять собой любое средство, способное снижать или ингибировать ангиогенез, в том числе антагонисты VEGF, такие как антитело к VEGF. При лечении опухоли антагонист EGFL7 в отдельности или в сочетании с противоангиогенным средством можно дополнительно сочетать с курсом химиотерапии, включающим одно или несколько химиотерапевтических средств. Также для повышения эффективности можно использовать сочетание с лучевой терапией.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ стимуляции образования сосудов у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему полипептида EGFL7 или агониста полипептида EGFL7, где у указанного млекопитающего стимулируют образование сосудов. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ стимуляции ангиогенеза у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида EGFL7 или его агониста. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека, а более предпочтительно - ангиогенез способствует регенерации ткани или заживлению раны.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ регуляции (например, ингибирования или стимуляции) образования сосудистой трубки у млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему композиции, которая содержит полипептид EGFL7, его агонист или антагонист.

В еще одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способ регуляции (например, индукции или снижения) ангиогенеза посредством регуляции (например, индукции или снижения) миграции эндотелиальных клеток у млекопитающего, где способ предусматривает введение млекопитающему полипептида EGFL7, его агониста или антагониста, где у указанного млекопитающего регулируют миграцию эндотелиальных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигурах 1a и 1b показано, что EGFL7 консервативен в ходе эволюции позвоночных. a: выравнивание аминокислот для EGFL7 человека, мыши, шпорцевой лягушки и данио рерио. Ген EGFL7 кодирует предполагаемый секретируемый белок ~30 кДа. Аминокислотная последовательность человека (Homo sapiens)гомологична таковой для мыши (Mus musculus), лягушки (Xenopus laevis) и данио рерио (Danio rerio) на 77,45%, 47,14% и 42,96% соответственно. Структурный анализ с использованием множества алгоритмов позволяет предположить, что белки EGFL7 содержат следующие домены (в рамках, начиная с N'-конца): сигнальную последовательность, домен EMI, два EGF-подобных домена в центральном участке, за которыми следует богатая лейцином и валином C-концевая область. b: Последовательность кДНК, аминокислот и интрона EGFL7 данио рерио. Стрелки указывают на два антисмысловых олигонуклеотида, AS_-47 (SEQ ID №6) и AS₁₉₅ (SEQ ID №7), а также на праймеры для ПЦР (SEQ ID №№8 и 9), используемые для выявления удержания интрона.

На фигурах 2a-2n представлен профиль экспрессии EGFL7. Тотальный препарат EGFL7 при гибридизации in situ для эмбрионов мыши (a-b) и данио рерио (j-n). b: поперечный срез a, окрашенный ядерным прочным красным. RBC=эритроциты. j-m: светлая стрелка=мезодерма боковой пластинки, темная стрелка=спинная аорта, темная стрелка-указатель=ISV. Вставка: увеличенное изображение ствола. n: мутант cloche. so=сомит. c: матка беременной мыши, окрашенная на EGFL7 и PECAM. В скобках = децидуальная оболочка. d-i: радиоактивная гибридизация in situ (g-i) и H&E (d-f) для срезов легких человека. Измерительная линейка: 0,45 мм (a, m, n), 0,07 мм (b), 0,38 мм (c-i), 0,25 мм (j, l), 0,15 мм (k), 0,26 мм (вставка m) и 0,04 мм (вставка c).

На фигурах 3a-3d показано, что нокдаун гена EGFL7 вызывает дефект сосудистого тубулогенеза у эмбрионов данио рерио. Эмбрионы данио рерио, в которые вводят инъекцией контрольный (Con_-47 или Con₁₉₅) или EGFL7-антисмысловой (AS_-47 или AS₁₉₅) олигонуклеотиды. a: макроскопическая морфология через 48 часов (Con_-47 или Con₁₉₅) или EGFL7-антисмысловой (AS_-47 или AS₁₉₅) олигонуклеотиды. a: макроскопическая морфология через 48 часов после оплодотворения. Стрелка указывает на перикардиальный отек, стрелка-указатель указывает на кровоизлияние. b-d: экспрессия fli1 через 23 часа после оплодотворения (b) и через 30 часов после оплодотворения (c-d). d: увеличенное изображение сосудов средней части туловища, представленных на с. Белая стрелка-указатель: просвет спинной аорты, черная стрелка-указатель: просвет задней кардинальной вены, черная стрелка: межсегментные сосуды. Измерительная линейка: 0,6 мм (a), 0,23 мм (d) и 0,5 мм (b, c).

На фигурах 4a-4h показано, что количество EC не изменено в KD EGFL7. Трансгенных рыб flk1:GFP, в которых вводили инъекцией контрольный (a, c, e, g) или антисмысловой (b, d, f, h) олигонуклеотиды, анализировали на стадии 22 сомитов (a-d) или проводили анализ через 30 часов после оплодотворения (e-h). a, b: вид с дорзальной стороны. e, f: вид сбоку. c, d, g, h: поперечные срезы, полученные на уровне, который указан белыми линиями на a-b, e-f, контрокрашивали фаллоидином и DAPI. PD: протоки предпочки, So: сомиты, N: нотохорды, белые стрелки: артериальные EC, белые стрелки-указатели=венозные EC, DA=спинная аорта, PCV=задняя кардинальная вена. Измерительная линейка: 0,33 мм (a, b), 0,03 мм (c, d, g, h), 0,47 мм (e, f).

На фигурах 5a-5g показано, что EGFL7 способствует адгезии EC. При окрашивании винкулина в клетках эндотелия сосудов пуповины человека (HUVEC) выявляют образование фокальной адгезии для фибронектина (b), коллагена I типа (c) и EGFL7 (d), но не для BSA (a). Прочность адгезии для EGFL7 меньше, чем для коллагена или фибронектина, поскольку после центрифугирования при 46 g меньшее число клеток остаются прикрепленными к субстрату EGFL7 (e). Зависящее от дозы блокирование антителом к EGFL7 адгезии HUVEC к EGFL7, но не к фибронектину подтверждает специфичность субстрата. Контрольное антитело (к B7x) не оказывает эффекта ни на один из субстратов (f). g: кинетика адгезии HUVEC для различных субстратов. Измерительная линейка: 0,03 мм (a-d).

На фигуре 6 представлено сравнение скоростей роста меланомной опухоли B16 у гомозиготных EGFL7^-/- (n=11) и гетерозиготных EGFL7^+/- (n=11) нокаутных мышей.

На фигурах 7a-7b представлено сравнение частоты возникновения и скорости роста меланомной опухоли B16 у гомозиготных EGFL7^-/- нокаутных мышей (n=10) в сравнении с мышами дикого типа одного с ними помета (n=13). На 7b были исключены не имеющие опухоли мыши.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Определения

Пока не указано иначе, используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, как обычно понимает специалист в данной области, к которой относится это изобретение. См., например, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). В целях настоящего изобретения ниже определены следующие термины.

В рамках настоящей заявки используемые взаимозаменяемо термины "EGFL7" и "полипептид EGFL7" относятся к природной последовательности EGFL7, вариантам EGFL7 и химерному EGFL7, каждый из которых определен здесь. Не обязательно, EGFL7 не связан с природным гликозилированием. “Природное гликозилирование” относится к углеводным группам, ковалентно присоединенным к EGFL7 в случае его продуцирования в клетках млекопитающих, особенно в клетках, в которых он продуцируется в природе. Соответственно продуцируемый в не принадлежащей человеку клетке EGFL7 человека представляет собой пример EGFL7, который может “быть не связан с природным гликозилированием”. Иногда EGFL7 может быть полностью не гликозилирован, как в случае, когда он продуцируется в прокариотах, например, E. coli.

Нуклеиновая кислота EGFL7 представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует полипептид EGFL7, как указано выше, или которая гибридизуется с такой ДНК или РНК и остается устойчиво связанной с ней в строгих условиях гибридизации, а также длина которой составляет приблизительно более 10 нуклеотидов. Строгие условия представляют собой условия, в которых (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для промывки, например, 0,15 M NaCl/0,015 M цитрат натрия/0,1% NaDodSO₄ при 50°C, или (2) используют в ходе гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколлом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрия при 42°C.

Нуклеиновая кислота является функционально связанной при приведении нуклеиновой кислоты в функциональную взаимосвязь с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота EGFL7 может быть функционально связана с последовательностью другой нуклеиновой кислоты в векторе таким образом, что она может экспрессироваться в конкретном организме-хозяине. Это можно осуществить хорошо известными в данной области способами. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера функционально связывают с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде белка-предшественника, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или связывающий рибосому участок функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что способствует трансляции. Как правило, “функционально связанный” означает, что связанные последовательности ДНК прилегают друг к другу, а также в случае секреторного лидера прилегают друг к другу и в стадии считывания. Однако энхансеры не обязательно должны прилегать друг к другу. Связывание осуществляют лигированием в подходящие участки рестрикции. Если такие участки не существуют, тогда в соответствии с общепринятой практикой используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

“Природная последовательность EGFL7” включает полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, как и встречающийся в природе EGFL7, независимо от способа его получения или видов. Таким образом, природная последовательность EGFL7 может иметь аминокислотную последовательность встречающегося в природе EGFL7 человека, EGFL7 мыши, EGFL7 шпорцевой лягушки, EGFL7 данио рерио или EGFL7 из любых других видов. Например, на фигуре 1A представлена предпочтительная полноразмерная природная последовательность аминокислотной последовательности EGFL7 человека (SEQ ID №:1). Природная последовательность аминокислотной последовательности EGFL7 мыши представлена на фигуре 1A (SEQ ID №:2). Такую природную последовательность EGFL7 можно выделять из природных источников или можно получать рекомбинантными и/или синтетическими способами. Термин “природная последовательность EGFL7”, в частности, включает встречающиеся в природе препро-, про- и зрелые формы, а также усеченные формы EGFL7, встречающиеся в природе различные формы и встречающиеся в природе аллельные варианты.

“Варианты EGFL7“ представляют собой биологически активные полипептиды EGFL7, имеющие аминокислотную последовательность, которая вследствие вставки, делеции, модификации и/или замены одного или нескольких аминокислотных остатков в природной последовательности отличается от последовательности природной последовательности полипептида EGFL7, такой как представленные на фигуре 1A (SEQ ID №№:1-4) последовательности для EGFL7 человека, мыши, шпорцевой лягушки и данио рерио соответственно. Как правило, варианты EGFL7 имеют последовательность, менее чем на 100% совпадающую с природной последовательностью EGFL7, такой как EGFL7 человека из SEQ ID №:1. Однако обычно биологически активный вариант EGFL7 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 70% совпадающую с аминокислотной последовательностью встречающегося в природе EGFL7, такого как EGFL7 человека из SEQ ID №:1, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 75%, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 80%, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 85%, даже более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 90%, при повышении предпочтительности в диапазоне по меньшей мере приблизительно от 95% до по меньшей мере приблизительно 99% совпадения аминокислотной последовательности при минимальном шаге 1%. Варианты EGFL7 включают пептидные фрагменты по меньшей мере из 5 аминокислот, сохраняющие биологическую активность соответствующей природной последовательности полипептида EGFL7. Также варианты EGFL7 включают полипептиды EGFL7, где к N- или C-концу или внутри природной последовательности EGFL7 добавлены один или несколько остатков аминокислот. Также варианты EGFL7 включают полипептиды EGFL7, где некоторое количество аминокислотных остатков удалено и, необязательно, заменено одним или несколькими остатками аминокислот. Также варианты EGFL7 могут быть ковалентно модифицированы, например, посредством замены группой, отличной от встречающейся в природе аминокислоты, или модификацией аминокислотного остатка для получения не встречающейся в природе аминокислоты. Варианты EGFL7 могут содержать связывающий гепарин домен.

“Процент совпадения аминокислотной последовательности” в отношении последовательности EGFL7 определен здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, совпадающих с остатками в последовательности EGFL7, после выравнивания последовательностей и введения промежутков, если необходимо, для достижения максимального совпадения последовательностей, не учитывая при этом какие-либо консервативные замены как составляющую совпадения последовательностей. Никакие из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в последовательности-кандидате EGFL7 не должны рассматриваться как влияющие на совпадение или гомологию последовательностей. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области. Одна из таких компьютерных программ представляет собой разработанную Genentech “ALIGN-2”, представленную вместе с документацией для пользователя в бюро по охране авторских прав США, Washington, D. C. 20559, где она зарегистрирована под регистрационным номером авторского права США №TXU510087.

Молекула “химерного EGFL7” представляет собой полипептид, содержащий полноразмерный EGFL7 или один или несколько его доменов, слитых или связанных с гетерологичным полипептидом. Как правило, молекула химерного EGFL7 обладает по меньшей мере одним общим со встречающимся в природе EGFL7 биологическим свойством. Пример молекулы химерного EGFL7 представляет собой молекулу с эпитопом, меченным в целях очистки. Другая молекула химерного EGFL7 представляет собой иммуноадгезин EGFL7.

“Выделенный EGFL7” означает EGFL7, который очистили из источника EGFL7 или получили рекомбинантными или синтетическими способами и очистили. Очищенный EGFL7 практически не содержит другие полипептиды или пептиды. В рамках настоящей заявки “практически не содержит” означает примесь белков из другого источника, составляющую приблизительно менее чем 5%, предпочтительно - приблизительно менее чем 2%, более предпочтительно - приблизительно менее чем 1%, еще более предпочтительно - приблизительно менее чем 0,5%, наиболее предпочтительно - приблизительно менее чем 0,1%.

“По существу чистый” белок означает композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 90 мас.% белка от общей массы композиции, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95 мас.%, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 90 мас.%, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95 мас.% “По сушеству гомогенный” белок означает композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 99 мас.% белка от общей массы композиции.

Термин “антагонист” используют в самом широком смысле, и термин включает любую молекулу, частично или полностью блокирующую, ингибирующую или нейтрализующую биологическую активность природного полипептида EGFL7. В частности, приемлемые молекулы антагонистов включают являющиеся антагонистами антитела или фрагменты антител, фрагменты или варианты аминокислотной последовательности природных полипептидов EGFL7, пептиды, растворимые фрагменты рецептора(ов) EGFL7, небольшие органические молекулы и т.д. Способы выявления агонистов или антагонистов полипептида EGFL7 могут предусматривать контактирование полипептида EGFL7 с молекулой-кандидатом агониста или антагониста и измерение поддающегося регистрации изменения в одной или нескольких биологических активностях, обычно связанных с полипептидом EGFL7.

В целях настоящей заявки “активный” или “активность” относится к форме(ам), сохраняющей биологическую и/или иммунологическую активность природного или встречающегося в природе EGFL7, где “биологическая” активность относится к обусловленной природным или встречающимся в природе EGFL7 биологической функции (ингибирующей или стимулирующей), отличной от способности индуцировать продукцию антитела к антигенному эпитопу, которым обладает природный или встречающийся в природе EGFL7, а “иммунологическая” активность относится к способности индуцировать продукцию антитела к антигенному эпитопу, которым обладает природный или встречающийся в природе EG