Резистентные мутанты протеазы ns3-ns4a hcv

Резистентные мутанты протеазы ns3-ns4a hcv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к резистентным мутантам протеазы NS3/4A вируса гепатита С.

Уровень техники родственной области

Инфекция, вызванная вирусом гепатита С (“HCV”), представляет собой непреодолимую проблему медицины человека. HCV рассматривают как этиологический фактор для большинства случаев гепатита ни А, ни В с серологически установленной распространенностью среди людей 3% в мировом масштабе [A. Alberti et al., “Natural History of Hepatitis C,” J. Hepatology, 31., (Suppl.), pp. 17-24 (1999)]. Почти четыре миллиона индивидуумов могут быть инфицированы только в Соединенных Штатах [M.J. Alter et al., “The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437-455 (1994); M.J. Alter “Hepatitis C Virus Infection in the United States,” J. Hepatology, 31, (Suppl.), pp. 88-91 (1999)].

При первом контакте с HCV приблизительно только у 20% инфицированных индивидуумов развивается острый клинический гепатит, тогда как оказалось, что у других индивидуумов не появляются значительные видимые симптомы инфекционного заболевания. Однако почти в 70% случаев вирус является причиной хронической инфекции, которая сохраняется в течение десятилетий [S. Iwarson, “The Natural Course of Chronic Hepatitis,” FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 201-204 (1994); D. Lavanchy, “Global Surveillance and Control of Hepatitis C,“ J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)]. Обычно это приводит к рецидивирующему и прогрессивно ухудшающемуся воспалению печени, которое часто ведет к более серьезным патологическим состояниям, таким как цирроз печени и печеночно-клеточный рак [M.C. Kew, "Hepatitis С and Hepatocellular Carcinoma", FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220 (1994); I. Saito et. al., "Hepatitis С Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 6547-6549 (1990)]. К сожалению, не существует никаких достаточно эффективных способов лечения для ослабления прогрессирования хронического HCV.

Геном HCV кодирует полибелок из 3010-3033 аминокислот [Q.L. Choo, et. al., "Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis С Virus." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 2451-2455 (1991); N. Kato et al., "Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9524-9528 (1990); A. Takamizawa et. al., "Structure and Organization of the Hepatitis С Virus Genome Isolated From Human Carriers," J. Virol., 65, pp. 1105-1113 (1991)]. Полагают, что неструктурные (NS) белки HCV обеспечивают необходимый каталитический механизм для репликации вируса. NS-белки образуются в результате протеолитического расщепления полибелка [R. Bartenschlager et. al., «Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis С Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions,» J. Virol, 67, pp. 3835-3844 (1993); A. Grakoui et. al., "Characterization of the Hepatitis С Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites," J. Virol., 67, pp. 2832-2843 (1993); A. Grakoui et. аl., "Expression and Identification of Hepatitis С Virus Polyprotein Cleavage Products," J. Virol., 67, pp. 1385-1395 (1993); L. Tomei et. al., "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С virus polyprotein", J. Virol., 67, pp. 4017-4026 (1993)].

NS-белок 3 (NS3) HCV проявляет активность сериновой протеазы, которая осуществляет процессинг вирусного полибелка с образованием большинства вирусных ферментов, и является необходимой для репликации и инфективности вируса. Показано, что первые 181 аминокислоты NS3 (остатки 1027-1207 вирусного полибелка) составляют домен сериновой протеазы NS3, который осуществляет процессинг всех четырех последующих участков полибелка HCV [C. Lin et al., “Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, pp. 8147-8157 (1994)]. Замещения каталитической триады сериновой протеазы NS3 HCV приводят к нарушению репликации и инфективности вируса у шимпанзе [A.A. Kolykhalov et al., "Hepatitis С virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo", J. Virol., 74: 2046-2051]. Известно, что мутации в протеазе NS3 вируса желтой лихорадки снижают инфективность вируса [Chambers, T.J. et. al., "Evidence that the N-terminal Domain of Nonstractural Protein NS3 From Yellow Fever Virus is a Serine Protease Responsible for Site-Specific Cleavages in the Viral Polyprotein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 8898-8902 (1990)].

Сериновая протеаза NS3 HCV и ассоциированный с ней кофактор, NS4A, осуществляют процессинг области вирусного неструктурного белка в индивидуальные неструктурные белки, включая все вирусные ферменты [С. Failla, et al., "An ammo-terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protease is essential for interaction with NS4A", J. Virol. 69, pp. 1769-1777; Y. Tanji et al., "Hepatitits С virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing", J. Virol. 69, pp. 1575-1581; C. Lin et al., "A central region in the hepatitis С virus NS4A protein allows formation of an active NS3-NS4A serine proteinase complex in vivo and in vitro", J. Virol. 69, pp. 4373-4380], и являются необходимыми для вирусной репликации. Оказалось, что упомянутый процессинг аналогичен процессингу, осуществляемому аспартильной протеазой вируса иммунодефицита человека, которая также вовлечена в процессинг вирусных белков. Ингибиторы протеазы HIV (ВИЧ), которые ингибируют процессинг вирусных белков, являются сильными противовирусными средствами для человека, указывая, что прерывание указанной стадии цикла жизни вируса является основанием для разработки терапевтически эффективных средств. Следовательно, это является привлекательной мишенью для разработки лекарственных средств.

Некоторые потенциальные ингибиторы протеазы HCV были описаны в предыдущем уровне техники в данной области [публикации PCT №№ WO 02/18369, WO 02/08244, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, WO 98/46630, WO 98/17679 и WO 97/43310, патент Соединенных Штатов 5990276, M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713-18 (1998); W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-13 (2000); R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571-79 (2000); M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267-70 (2000); and S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2271-74 (2000)]. Однако неизвестно, имеют ли названные соединения соответствующие профили, чтобы быть приемлемыми лекарственными средствами. Кроме того, возможно, что протеаза HCV может становиться резистентной к другому подходящему лекарственному средству.

Поэтому современные представления относительно HCV не приводят к каким-либо удовлетворительным анти-HCV средствам или способам лечения инфекции HCV. Единственным признанным способом лечения заболевания, вызванного HCV, является терапия на основе альфа-интерферона. Однако альфа-интерфероны проявляют значительные побочные эффекты [M. A. Walker et al., "Hepatitis С Virus: An Overview of Current Approaches and Progress," DDT, 4, pp. 518-29 (1999); D. Moradpour et al., "Current and Evolving Therapies for Hepatitis C," Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199-1202 (1999); H. L. A. Janssen et al. "Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis," J. Hepatol., 21, pp. 241-243 (1994); P.F. Renault et al., "Side Effects of Alpha Interferon," Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273-277. (1989)] и индуцируют длительную ремиссию только в части случаев (~25%) [O. Weiland, “Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection”, FEMS Microbiol. Rev., 14, pp. 279-288 (1994)]. Существующий стандарт лечения, пэгилированным альфа-интерфероном в комбинации с рибавирином, приводит к длительному вирусному ответу (SVR) приблизительно в 40-50% случаев у пациентов, инфицированных генотипом 1, что имеет значение для 70% пациентов с хроническим гепатитом С в развивающихся странах, и к SVR в 80% у пациентов, инфицированных генотипом 2 или 3 [J.G. McHutchison, et al., N. Engl. J. Med., 339: 1485-1492 (1998); G.L. Davis et al., N. Engl. J. Med., 339: 1493-1499 (1998)]. Кроме того, перспективы относительно эффективных анти-HCV вакцин остаются неясными.

Таким образом, существует потребность в более эффективных анти-HCV способах лечения, в особенности потребность в соединениях, которые ингибируют протеазу NS3 HCV. Такие соединения можно использовать как противовирусные средства, в частности как анти-HCV средства. Представления о HCV-резистентных мутантах следует далее совершенствовать в направлении разработки эффективных способов лечения HCV.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к резистентной мутантной протеазе NS3/4A вируса гепатита С.

Таким образом, в некоторых аспектах изобретение включает в себя выделенные полинуклеотиды HCV, которые кодируют мутантные протеазы NS3/4A HCV или их биологически активные аналоги и фрагменты, в которых кодон, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, и/или кодон, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, мутирован так, что он не кодирует аланин в положении 156 и/или аспарагиновую кислоту в положении 168. Примеры таких мутаций, описанные здесь, включают в себя полинуклеотиды, в которых кодон, который соответствует кодону 156 полинуклеотида дикого типа, кодирует серин, валин или треонин. Другие показательные воплощения охватывают полинуклеотиды, в которых кодон полинуклеотида, который соответствует кодону 168 полинуклеотида дикого типа, кодирует аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аланин, глицин или тирозин. Любые комбинации мутаций в кодоне 156 и 168 рассматривают особо. Протеаза NS3/4A HCV дикого типа хорошо известна специалистам в данной области. Она кодируется полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1. Такая полинуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

В данном описании также рассматривают полипептиды или их биологически активные фрагменты, которые кодируются полинуклеотидами, рассматриваемыми здесь. Кроме того, изобретение охватывает векторы, которые содержат клетки хозяина, трансформированные или трансфицированные такими полинуклеотидами, и клеточные линии, которые содержат упомянутые полинуклеотиды. Способы и композиции для создания таких векторов, трансформации клеток хозяина и получения клеточных линий являются стандартными и общепринятыми методами, известными специалистам в данной области. Выделенные варианты HCV, которые содержат описываемые мутантные полинуклеотиды или белки, также являются частью данного изобретения.

Композиции, содержащие полинуклеотиды или белки или отдельно или в комбинации с другими композициями и компонентами, также рассматривают в описании.

В изобретении описывают способ обнаружения присутствия резистентного к лекарственному средству HCV в биологическом образце, включающий в себя определение присутствия описываемого полинуклеотида. Обычно такие способы включают в себя получение или выделение полинуклеотида из образца, определение последовательности полинуклеотида и оценку, присутствует ли в полинуклеотиде ассоциированная с резистентностью мутация, такая как одна или более мутаций, обсуждаемых в описании (например, мутация, которая кодирует серин, валин или треонин в остатке, который соответствует остатку 156, и/или кодирует глутаминовую кислоту, валин, аланин, глицин или тирозин в остатке, который соответствует остатку 168 протеазы NS3/4A HCV дикого типа).

Также рассматривают способы обнаружения или выявления, является ли HCV-инфекция у пациента резистентной к лекарственному средству, включающие в себя забор биологического образца от инфицированного HCV пациента и определение, содержит ли образец плазмы нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантную протеазу NS3/4A HCV, при этом присутствие мутантной протеазы NS3/4A HCV указывает, что пациент имеет резистентную к лекарству инфекцию, вызванную HCV.

В других аспектах рассматривают способы оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к VX-950, включающие в себя оценку, имеется ли у пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне, который кодирует остаток 156 протеазы NS3/4A вируса гепатита С дикого типа.

Следующие аспекты направлены на способы оценки, имеет ли инфицированный HCV пациент сниженную чувствительность или восприимчивость к ингибитору протеазы, включающие в себя оценку, присутствует ли у пациента ДНК протеазы NS3/4A вируса гепатита С, имеющая мутацию в кодоне, который кодирует остаток 156 протеазы NS3/4A вируса гепатита С дикого типа.

В изобретении, кроме того, рассматривают способы оценки кандидата на ингибитор или потенциального ингибитора HCV, включающие в себя введение вектора, содержащего полинуклеотид изобретения и ген-индикатор, кодирующий индикатор в клетку хозяина, культивирование клетки хозяина и определение индикатора в присутствии и в отсутствие ингибитора.

Другие способы исследования активности соединений против HCV включают в себя обеспечение мутантной протеазой, обсуждаемой в описании, и протеазного субстрата; контактирование с кандидатным или потенциальным ингибитором в присутствии субстрата и оценку или количественное определение ингибирования протеолитической активности протеазы.

В других аспектах представляют способы идентификации соединения как ингибитора резистентной к лекарству протеазы, рассматриваемой в описании, исследованием активности такой протеазы в отсутствие соединения; исследованием активности протеазы в присутствии соединения; сравнением результатов исследований, проводимых в присутствии и отсутствие соединения, при этом любое снижение протеазной активности как результат присутствия соединения указывает, что соединение является ингибитором протеазы.

Также описывают способы идентификации соединений, которые способны восстанавливать активность VX-950, при этом протеаза NS3/4A становится резистентной к VX-950, способы, при которых резистентная протеаза контактирует с соединением, и способность VX-950 ингибировать активность протеазы оценивают в присутствии такого соединения.

В данном изобретении используют тот факт, что установлена трехмерная структура протеазы NS3/4A (смотри, например, WO 98/11134). Используя такие методы и рекомендации данного изобретения, получают трехмерную модель резистентной протеазы изобретения; соединения конструируют или выбирают для взаимодействия с трехмерной структурой мутантной протеазы и оценивают способность соединения связывать протеазу или взаимодействовать с ней (например, молекулярным моделированием). Типичные трехмерные модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре протеазы NS3/4A (фигура 1 и фигура 2). Такие модели можно получать по способам, выполняемым на компьютере, способам или методом рентгеновской кристаллографии. Полученные результаты можно сравнивать с данными, установленными для протеазы дикого типа.

Соединение может быть идентифицировано из комбинаторной химической библиотеки или получено методом рационального конструирования лекарственного средства. В показательных воплощениях соединение является соединением, полученным методом рационального конструирования лекарственного средства и установленным на основании структуры VX-950. В других показательных воплощениях идентифицированное соединение готовят в виде композиции, содержащей соединение и фармацевтически подходящий носитель, адъювант или наполнитель. Предпочтительно, композиция содержит соединение в количестве эффективном, чтобы ингибировать сериновую протеазу NS3/4A. Более предпочтительно, композицию составляют для введения пациенту. Композиции также могут содержать дополнительное средство, выбранное из иммуномодулирующего средства, противовирусного средства, второго ингибитора протеазы HCV, ингибитора другой мишени в цикле жизни HCV, ингибитора цитохрома Р-450 или их комбинаций.

Другие способы изобретения, предполагающие ингибирование активности протеазы NS3/4A вируса гепатита С, включают в себя стадию контактирования сериновой протеазы с таким соединением или композицией. В следующих аспектах рассматривают способы лечения инфекционного заболевания HCV у пациента, включающие в себя стадию введения пациенту такого соединения композиции.

В дополнительных аспектах рассматривают способы лечения или ослабления инфекции, вызванной HCV, у пациента, включающие в себя определение, имеет ли пациент HCV-инфекцию, которая резистентна к терапии с использованием обсуждаемого в описании способа, который обеспечивает обнаружение описываемых мутаций и лечение пациента композицией или терапией, направленной на лечение резистентной к лекарственному средству инфекции HCV.

В других дополнительных аспектах обсуждают способы элиминации или снижения заражения HCV биологического образца или медицинского или лабораторного оборудования, включающие в себя стадию контактирования биологического образца или медицинского или лабораторного оборудования с соединением, идентифицированным, как описывают в заявке. В следующих воплощениях биологический образец или медицинское или лабораторное оборудование инфицировано резистентным к лекарству штаммом HCV, что устанавливают по описанным способам определения.

Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и специальные примеры, указывающие на предпочтительные воплощения изобретения, представляются только для иллюстрации, так как различные изменения и модификации в пределах идеи и сферы действия изобретения станут очевидными специалистам в данной области из предлагаемого подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующие чертежи составляют часть данного описания и включены для дальнейшей иллюстрации аспектов данного изобретения. Изобретение может быть понято лучше благодаря ссылкам на чертежи в сочетании с подробным описанием специальных воплощений, представляемых в описании.

Фигура 1: Рентгеновские структуры двух комплексов протеаза NS3 HCV - протеазный ингибитор (PI) BILN 2061 и VX-950. Две ко-комплексные структуры установлены и нанесены на схему (VX-950 голубым цветом и BILN 2061 красным цветом). Три остатка, изображенные в виде шар-и-палочка (R123, R155 и D168), образуют солевые мостиковые связи в структуре BILN 2061, а не в структуре VX-950. Удаление отрицательного заряда в D168 приводит к потере ограничения R155 и последующей потере упаковки большого Р2 BILN 2061 и увеличению стоимости десольватации. R155 не ограничен посредством D168 в структуре VX-950, а мутация D168V не влияет на его связывание.

Фигура 2: Мутация A156S вызывает потерю связывания вследствие пространственного столкновения с VX-950, а не с BILN 2061. Рентгеновские структуры VX-950 (верхний слева, голубой) или BILN 2061 (нижний слева, красный) с А156 дикого типа ярко освещены желтым цветом. Модели мутации A156S (серый цвет) с VX-950 (верхний правый, голубой) или с BILN 2061 (нижний правый, красный). Рассматривали все допустимые углы скручивания для боковой цепи серина в мутированном остатке.

Фигура 3: Мутация A156V вызывает потерю связывания PIs вследствие пространственного столкновения или с VX-950 или с BILN 2061. Модели мутации A156V (серый цвет) с VX-950 (слева, голубой цвет) или BILN 2061 (справа, красный цвет).

Фигура 4: Химические структуры VX-950 (A) и BILN 2061 (B).

Фигура 5: Получение содержащих репликон клеток HCV, которые резистентны к VX-950. Субгеномные, содержащие репликон клетки Con1 HCV серийно пассировали в присутствии G418 и увеличивающейся концентрации VX-905 (A), как описывают в разделе «Материалы и методы». Содержащие репликон клетки размножали и свежий PI добавляли в среду дважды в неделю. Затененные площади указывают на период времени, во время которого содержащие репликон клетки характеризовались незначительным ростом или отсутствием общего роста, что сопровождалось сопутствующей массивной гибелью клеток. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток в различные периоды времени (отмечено расширенными стрелками) во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт RT-PCR (ПЦР-ОТ), охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу или после субклонирования в ТА-вектор. Значения IC₅₀ для VX-950 относительно серии А или содержащих репликон клеток дикого типа определяли на 56 день в стандартном 48-часовом исследовании (В).

Фигура 6: Получение содержащих репликон клеток HCV, которые резистентны к BILN 2061. Субгеномные, содержащие репликон клетки Con1 HCV серийно пассировали в присутствии G418 и увеличивающейся концентрации BILN 2061 (A), как описывают в разделе «Материалы и методы». Содержащие репликон клетки размножали и свежий PI добавляли в среду дважды в неделю. Затененные площади указывают на период времени, во время которого содержащие репликон клетки характеризовались незначительным ростом или отсутствием общего роста, что сопровождалось сопутствующей массивной гибелью клеток. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток в различные временные точки (отмечено расширенными стрелками) во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт RT-PCR (ПЦР-ОТ), охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу, или после субклонирования в ТА-вектор. Значения IC₅₀ для BILN 2061 относительно серии В или содержащих репликон клеток дикого типа определяли на 59 день в стандартном 48-часовом исследовании (В).

Фигура 7: Модели комплексов протеаза:ингибитор. Белок представлен в виде рисунка, сделанного на основании вторичной структуры, в светло-сером цвете. Ингибиторы изображены как шар-и-палочка (VX-950 пурпурным цветом, а BILN 2061 желтым цветом) с азотами, окрашенными в голубой цвет, кислородами, окрашенными в красный цвет, и серой - в оранжевый цвет. Боковые цепи ключевых остатков изображены в виде палочек с различной окраской: Ala156 (зеленый), Asp168 (оранжевый) и Arg123 (оранжевый). Модель боковая цепь Arg155 BILN 2061:протеаза показана голубым цветом, а модель боковая цепь Arg155 VX-950:протеаза окрашена оранжевым цветом. Названные боковые цепи изображены в виде поверхностей из точек. Каталитическая триада, Ser139, His57 и Asp81 отмечена серым цветом. (Фигура создана с помощью Молекулярных графических систем PyMOL Molecular Graphics Systems, DeLano Scientific LLC, San Carlos, California, U.S.A. Copyright © 1998-2003).

Фигура 8: Получение двойных-резистентных репликонов из VX-950-резистентных, содержащих репликон клеток. (А) VX-950-резистентные, содержащие репликон клетки серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418, 14 мкМ VX-950 и возрастающих концентраций BILN 2061. Содержащие репликон клетки размножали и свежие VX-950 и BILN 2061 добавляли в среду дважды в неделю, что показано с помощью заполненных прямоугольников и треугольников соответственно. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток на 32 день во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт ПЦР-ОТ, охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу, или после субклонирования в ТА-вектор. (В) Представлено титрование VX-950 против серии А (VX-950-резистентная) (заполненные прямоугольники) или серии С (двойная резистентность) (открытые прямоугольники) содержащих релипкон клеток на 52 день посредством VX-950. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с VX-950. (С) Представлено титрование BILN 2061 против серии А (VX-950-резистентная) (заполненные треугольники) или серии С (двойная резистентность) (открытые треугольники) содержащих репликон клеток на 52 день посредством BILN 2061. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с BILN 2061.

Фигура 9: Получение двойных-резистентных репликонов из BILN 2061-резистентных, содержащих репликон клеток. (А) BILN 2061-резистентные, содержащие репликон клетки серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418, 7 или 14 мкМ VX-950 и возрастающих концентраций BILN 2061. Содержащие репликон клетки размножали и свежие VX-950 и BILN 2061 добавляли в среду дважды в неделю, что показано с помощью заполненных прямоугольников и треугольников соответственно. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток на 32 день во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт ПЦР-ОТ, охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу, или после субклонирования в ТА-вектор. (В) Представлено титрование VX-950 против серии В (BILN 2061-резистентная) (заполненные прямоугольники) или серии D (двойная резистентность) (открытые прямоугольники) содержащих репликон клеток на 52 день посредством VX-950. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с VX-950. (С) Показано титрование BILN 2061 против серии В (BILN 2061-резистентная) (заполненные треугольники) или серии D (двойная резистентность) (открытые треугольники) содержащих репликон клеток на 52 день посредством BILN 2061. Уровень РНК HCV определяли после 48-часовой инкубации с BILN 2061.

Фигура 10: Получение двойных-резистентных репликонов из «наивных» содержащих репликон клеток. Субгеномные, содержащие репликон клетки HCV серийно пассировали в присутствии 0,25 мг/мл G418 и возрастающих концентраций VX-950 и BILN 2061. Содержащие репликон клетки размножали и свежие VX-950 и BILN 2061 добавляли в среду дважды в неделю, что показано с помощью заполненных прямоугольников и ромбами соответственно. Изолированная область указывает период времени, во время которого содержащие репликон клетки характеризуются небольшим ростом или полным отсутствием роста, что сопровождается сопутствующей массивной гибелью клеток. Тотальную клеточную РНК содержащих репликон клеток в различные периоды времени, указанные открытыми стрелками, во время селекции резистентности экстрагировали, и продукт ПЦР-ОТ, охватывающий сериновую протеазу NS3 HCV, секвенировали или сразу или после субклонирования в ТА-вектор.

Фигура 11: Схемы конформаций боковой цепи Thr156 в зависимости от связывания ингибитора. Толстые линии изображают боковую цепь Thr156 мутантного фермента и боковую цепь Р2 ингибитора или субстрата. Также рассматривали такие же три конформации для боковой цепи Val156. Последние (-60/180°) конформации имели наиболее низкую энергию для любой мутации, но плохо связывали оба ингибитора.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

В данном изобретении установлено, что штаммы HCV подвергаются определенным мутациям в присутствии некоторых терапевтических соединений, которые делают штаммы HCV резистентными к терапевтическому потенциалу таких соединений. В особых воплощениях установлено, что протеаза NS3/4A вируса гепатита С мутируется в такие резистентные мутанты HCV так, что мутанты оказываются резистентными к соединениям-ингибиторам протеаз. Упомянутые данные можно использовать при создании терапий для лечения инфекций HCV.

В специальных воплощениях установлено, что аминокислотный остаток 156 NS3/4A HCV дикого типа (последовательность которой представляют как SEQ ID NO:2) чувствителен к мутации. Мутация названного остатка приводит к резистентности HCV к терапевтическому воздействию протеазными ингибиторами. В одном воплощении показано, что кодон 156 дикого типа, который в NS3/4A HCV дикого типа кодирует аланин, мутирован в кодон, который кодирует серин в том же соответствующем положении в полипептиде NS3/4A HCV. В другом воплощении кодон мутирован в кодон, который кодирует валин в том же соответствующем положении в полипептиде NS3/4A HCV. В еще одном воплощении треонин кодирован в том же соответствующем положении в NS3/4A HCV.

Учитывая вышеприведенные данные, изобретение обеспечивает ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует серин. В другом воплощении данного изобретения обеспечивают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует валин. В еще одном воплощении обеспечивают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует треонин.

В следующих воплощениях установлено, что в некоторых воплощениях кодон 156 является кодом, который кодирует валин, серин или треонин по остатку 156, который обычно является остатком аланина в нативной/дикого типа NS3/4A HCV, и имеется другая мутация, в которой кодон по остатку 168 нативной/дикого типа NS3/4A HCV, который обычно является остатком аспарагиновой кислоты, мутирован в остаток валина, аланина, глицина или тирозина. Хотя в определенных воплощениях предполагают, что мутантная протеаза NS3/4A HCV может содержать мутации в положениях как 156, так и 165, считают, что мутанты, которые содержат одиночные мутации, также являются частью данного изобретения.

Специальные аспекты изобретения включают в себя ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент или аналог), в которой кодон 156 ДНК кодирует валин или треонин, а кодон 168 кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту. В другом воплощении данного изобретения обеспечивают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент или аналог), в которой кодон 168 ДНК кодирует валин. В следующем воплощении данного изобретения предусматривают ДНК HCV, кодирующую протеазу NS3/4A HCV (или ее фрагмент или аналог), в которой кодон 168 ДНК кодирует аланин, глицин или тирозин.

Система нумерации для ДНК данного изобретения находится в соответствии с последовательностью SEQ ID NO.1. ДНК согласно данному изобретению может быть выведена из SEQ ID NO.1. ДНК можно получать методом твердофазного синтеза или рекомбинантными способами. В специальных воплощениях сайт-направленный мутагенез последовательности SEQ ID NO:2 используют для того, чтобы получить один или другой из мутантов, описываемых в описании.

Следует признать, что белковые мутации могут быть полными (то есть весь или почти весь белок превращают в мутантный белок), частичными или отсутствовать (то есть никакой или почти никакой мутации). Поэтому композиция или способ данного изобретения могут включать в себя смесь белка дикого типа и мутантного белка.

В соответствии с другим воплощением данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 является серином.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 представляет собой валин.

В еще одном воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 представляет собой треонин.

В следующем воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 156 представляет собой валин или треонин, а аминокислота 168 представляет собой аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают выделенный белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 168 представляет собой валин.

В другом воплощении данного изобретения обеспечивают белок протеазы NS3/4A HCV (или его фрагмент, или аналог), содержащий аминокислоту 156 протеазы, при этом аминокислота 168 представляет собой аланин, глицин или тирозин.

ДНК и белки согласно данному изобретению можно модифицировать, используя стандартные методы. Например, ДНК может содержать модификацию для присоединения ДНК к твердому носителю. Белки могут содержать ковалентно-присоединенное маркерное соединение.

ДНК или белки согласно данному изобретению могут быть в виде формы, читаемой на компьютере, включающей в себя читаемые на компьютере носители и/или базы данных, читаемые на компьютере, не ограничиваясь названными формами (смотри, например, WO 98/11134).

Что касается некоторых применений, ДНК согласно данному изобретению может быть вставлена в вектор. Любой подходящий вектор может относиться к сфере действия изобретения. Подходящие векторы известны в данной области. В одном воплощении предусматривают вектор экспрессии. В другом воплощении предусматривают вирусный вектор. Вектор может быть клонирующим средством или может дополнительно содержать регуляторные последовательности, такие как промотер, усилители и терминаторы или сигналы полиаденилирования.

Соответственно данное изобретение также обеспечивает вектор, содержащий ДНК протеазы NS3/4A HCV (или ее фрагмент, или аналог), в котором:

кодон 156 ДНК кодирует серин;

кодон 156 ДНК кодирует валин;

кодон 156 ДНК кодирует треонин;

кодон 156 ДНК кодирует валин или треонин, а кодон 168 кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту;

кодон 168 ДНК кодирует валин;

кодон 168 ДНК кодирует аланин;

кодон 168 ДНК кодирует глицин и/или

кодон 168 ДНК кодирует тирозин.

В другом воплощении обеспечивают экспрессирующий вектор. В следующем воплощении обеспечивают вирусный вектор. Вектор может быть средством клонирования или может дополнительно содержать регуляторные последовательности, такие как промотер, усилители и терминаторы или сигналы полиаденилирования. Названные векторы можно использовать в любой подходящей клетке хозяина. Клетки хозяина известны в данной области.

Таким образом, в данном изобретении также предусматривают клетки хозяина, содержащие ДНК протеазы NS3/4A, в которой кодон 156 ДНК кодирует серин; кодон 156 ДНК кодирует валин; кодон 156 ДНК кодирует треонин; кодон 156 ДНК кодирует валин или треонин, а кодон 168 кодирует аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту; кодон 168 ДНК кодирует валин; кодон 168 ДНК кодирует аланин; кодон 168 ДНК кодирует глицин и/или кодон 168 ДНК кодирует тирозин. Экспрессия ДНК будет обеспечивать клетку хозяина, содержащую протеазу, имеющую А156 с мутацией в серин; А156 с мутацией в валин; А156 с мутацией в треонин; А156 с мутацией в валин или треонин и D168 с мутацией в глутаминовую кислоту; D168 с мутацией в валин; D168 с мутацией в аланин; D168 с мутацией в глицин и/или D168 с мутацией в тирозин. Также обеспечивают линии клеток, содержащие ДНК или белки согласно данному изобретению.

Изобретение также обеспечивает вариант HCV, содержащий ДНК согласно данному изобретению или белок согласно данному изобретению и композиции, содержащие ДНК и белки.

Варианты HCV, а также ДНК и/или белки согласно изобретению можно использовать для обнаружения лекарственного средства, а также для мониторинга соответствующих терапий HCV.

Таким образом, в другом воплощении данное изобретение обеспечивает способ обнаружения присутствия HCV в биологическом образце, включающий в себя определение присутствия ДНК согласно данному изобретению. Упомянутые способы могут включать в себя стадии a) получения (или экстракции) ДНК; b) определения последовательности ДНК; с) установления или предположения, кодирует ли в ДНК кодон 156 серин, кодирует ли кодон 156 валин, кодирует ли кодон 156 полинуклеотида треонин, кодирует ли кодон 156 валин или треонин и кодирует ли кодон 168 аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту, кодирует ли кодон 168 валин или кодирует ли кодон 168 аланин, глицин или тирозин. В некоторых воплощениях биологический образец, содержащий HCV, получают от млекопитающего, которое инфицировано HCV. Обнаружение присутствия такой ДНК можно использовать в диагностических целях, чтобы служить указанием практикующему врачу, что индивидуум является индивидуумом, у которого инфекция HCV, вероятно, будет резистентной или иным образом нечувствительной к лечению протеазными ингибиторами. Учитывая такое указание, специалист профессионал может модифицировать способ лечения субъекта, имеющего такую инфекцию, например, кроме увеличения дозы терапии, применением дополнительных способов лечения, использующих средства, к которым штамм HCV, инфицирующий субъекта, не резистентен.

Способы данного изобретения могут требовать получения определенных количеств ДНК. Как должен признать практикующий специалист, ДНК следует получать, а затем амплифицировать. Стандартные методы (например, ПЦР, гибридизация) можно использовать при практическом применении данного изобретения. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области.

Данное изобретение также обеспечивает способы лечения или предупреждения инфекции HCV посредством непрерывного контроля мутаций, рассматриваемых в изобретении. Если резистентный мутант присутствует в HCV, тогда пациента можно лечить соответственно. Такой способ будет включать в себя: а) забор образца (например, образец плазмы, PMBC, клетка печени или другой образец) у пациента, инфицированного HCV; и b) оценку, содержит ли образец плазмы нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазу NS3/4A HCV, содержащую мутацию в кодоне 156; при этом мутация приводит к замещению аланина серином. Подобные способы можно выполнять посредством замещения 156-аланина мутацией на серин с другими мутациями, описанными в описании. Соответственно подобные способы могут включать в себя идентификацию А156 с мутацией на серин (или другой мутацией, охарактеризованной в описании) и другую мутацию протеазы. Все названные способы будут включать в себя получение ДНК, амплификацию ДНК и определение последовательности ДНК.

Данное изобретение также обеспечивает способы оценки эффективности лечения ингибиторами протеазы NS3/4A пациента, инфицированного HCV. Такие способы включают в себя: а) забор образца (например, образца плазмы) от пациента, инфицированного HCV; и b) оценку, содержит ли образец плазмы нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазу NS3/4A HCV, имеющую мутацию в кодоне 156; при этом мутация приводит к замещению аланина серином. Подобные способы можно выполнять с другими мутациями данного изобретения.

Способы данного изобретения предназначены для идентификации резистентных мутантов у пациентов, которым вводили ингибиторы протеазы HCV. Описанный способ можно практически применять пациенту, которого лечат или лечили. Упомянутые и другие диагностические методы известны в данной области (смотри, например, US 5631128 и US 648