Бактерия, продуцирующая l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты

Бактерия, продуцирующая l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение имеет отношение к способам в области микробиологической промышленности. В частности, данное изобретение относится к способу производства L-аминокислоты посредством ферментации и к микроорганизму, используемому в данном способе.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аминокислоты, такие как L-лизин, L-глутаминовая кислота, L-треонин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин и L-фенилаланин, получают промышленным путем посредством ферментации с использованием микроорганизмов, которые относятся к родам Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida и им подобным. Для того, чтобы повысить продуктивность, в качестве таких микроорганизмов использовали штаммы, выделенные в природе, или их искусственные мутанты. Были заявлены различные способы усиления активностей ферментов биосинтеза L-глутаминовой кислоты с использованием технологии рекомбинантной ДНК, чтобы повысить способность продуцировать L-глутаминовую кислоту.

Продуктивность при получении L-аминокислот была значительно повышена с помощью селекции микроорганизмов, таких как микроорганизмы, приведенные выше, и совершенствования способов производства. Однако чтобы удовлетворить дальнейшее увеличение потребностей в будущем, по-прежнему требуется развитие способов более эффективного производства L-аминокислот.

В качестве способов получения аминокислот ферментацией метанола, который представляет собой сырье для ферментации, доступное в больших количествах при низкой стоимости, имеются традиционно известные способы с использованием микроорганизмов, которые относятся к роду Achromobacter или Pseudomonas (заявка на патент Японии (Kokoku) № 45-25273/1970), Protaminobacter (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 49-125590/1974), Protaminobacter или Methanomonas (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 50-25790/1975), Microcyclus (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 52-18886/1977), Methylobacillus (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 4-91793/1992), Bacillus (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 3-505284/1991) и так далее.

Однако до настоящего времени не был известен способ получения L-аминокислот с использованием бактерий Methylophilus. Хотя способы, описанные в EP 0 035 831 A, EP 0 037 273 A и EP 0 066 994 A, были известны как способы трансформации бактерий Methylophilus с использованием рекомбинантной ДНК, применение технологии рекомбинантной ДНК для повышения продуцирования аминокислот бактериями Methylophilus не было известно.

РАСКРЫТИЕ СУТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью согласно изобретению является предоставление новой бактерии, продуцирующей L-аминокислоту, и способа получения L-аминокислоты с использованием бактерии, продуцирующей L-аминокислоту.

В результате попыток авторов изобретения, посвященных достижению упомянутой выше цели, было обнаружено, что бактерии Methylophilus пригодны для получения L-аминокислот. Кроме того, хотя традиционно считается, что трудно получить ауксотрофные мутанты бактерий Methylophilus (FEMS Microbiology Rev. 39, 235-258 (1986) и Antonie van Leeuwenhoek 53, 47-53 (1987), авторы данного изобретения достигли успеха в получении ауксотрофных мутантов указанных бактерий. Таким образом, данное изобретение было осуществлено.

То есть, данное изобретение предоставляет следующее.

(1) Бактерия Methylophilus, обладающая способностью продуцировать L-аминокислоту.

(2) Бактерия Methylophilus по п. (1), где L-аминокислотой является L-лизин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-треонин.

(3) Бактерия Methylophilus по п. (1), которая обладает резистентностью к аналогу L-аминокислоты или ауксотрофией по L-аминокислоте.

(4) Бактерия Methylophilus по п. (1), у которой повышена активность ферментов биосинтеза L-аминокислоты.

(5) Бактерия Methylophilus по п. (1), у которой повышены активность дигидродипиколинатсинтазы и активность аспартокиназы, и при этом бактерия обладает способностью продуцировать L-лизин.

(6) Бактерия Methylophilus по п. (1), у которой повышена активность дигидродипиколинатсинтазы, и при этом бактерия обладает способностью продуцировать L-лизин.

(7) Бактерия Methylophilus по п. (1), у которой повышена активность аспартокиназы, и при этом бактерия обладает способностью продуцировать L-лизин.

(8) Бактерия Methylophilus по любому из пп. с (5) по (7), у которой активность или активности одного, двух или трех ферментов, выбранных из дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидродипиколинатредуктазы и диаминопимелатдекарбоксилазы, усилена/усилены.

(9) Бактерия Methylophilus по п. (5), у которой активность дигидродипиколинатсинтазы и активность аспартокиназы повышены путем трансформации посредством введения в клетки ДНК, кодирующей дигидродипиколинатсинтазу, которая не подвергается ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, и ДНК, кодирующей аспартокиназу, которая не подвергается ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

(10) Бактерия по п.(1), где активности аспартокиназы, гомосериндегидрогеназы, гомосеринкиназы и треонинсинтазы повышены, и бактерия обладает способностью продуцировать L-треонин.

(11) Бактерия по любому из пп. с (1) по (10), где бактерией Methylophilus является Methylophilus methylotrophus.

(12) Способ получения L-аминокислоты, который включает в себя культивирование бактерии Methylophilus, которая охарактеризована в любом из указанных выше пп. с (1) по (11), в среде, чтобы продуцировать и накопить L-аминокислоту в культуре, и сбор L-аминокислоты из культуры.

(13) Способ по п. (12), при котором среда содержит метанол в качестве основного источника углерода.

(14) Способ получения бактериальных клеток бактерии Methylophilus с повышенным содержанием L-аминокислоты, который включает в себя культивирование бактерии Methylophilus, охарактеризованной в любом из указанных выше пунктов с (1) по (11), в среде, чтобы продуцировать и накопить L-аминокислоту в бактериальных клетках данной бактерии.

(15) Способ получения бактериальных клеток бактерии Methylophilus по п. 14, где L-аминокислотой является L-лизин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-треонин.

(16) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (А) или (B):

(А) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или

(В) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью аспартокиназы.

(17) ДНК по п. (16), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (а) или (b):

(а) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 510 до нуклеотида номер 1736 SEQ ID NO: 5; или

(b) ДНК, которая способна гибридизоваться с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 510 до нуклеотида номер 1736 SEQ ID NO: 5 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью аспартокиназы.

(18) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (С) или (D):

(С) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или

(D) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты.

(19) ДНК по п. (18), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (с) или (d):

(с) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 98 до нуклеотида номер 1207 SEQ ID NO: 7; или

(d) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 98 до нуклеотида номер 1207 SEQ ID NO: 7 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты.

(20) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (E) или (F):

(E) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или

(F) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью дигидродипиколинатсинтазы.

(21) ДНК по п. (20), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (e) или (f):

(e) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 1268 до нуклеотида номер 2155 SEQ ID NO: 9; или

(f) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 1268 до нуклеотида номер 2155 SEQ ID NO: 9 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью дигидродипиколинатсинтазы.

(22) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (G) или (H):

(G) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или

(H) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью дигидродипиколинатредуктазы.

(23) ДНК по п. (22), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (g) или (h):

(g) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 2080 до нуклеотида номер 2883 SEQ ID NO: 11; или

(h) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 2080 до нуклеотида номер 2883 SEQ ID NO: 11 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью дигидродипиколинатредуктазы.

(24) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (I) или (J):

(I) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или

(J) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью диаминопимелатдекарбоксилазы.

(25) ДНК по п. (24), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (i) или (j):

(i) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 751 до нуклеотида номер 1995 SEQ ID NO: 13; или

(j) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 751 до нуклеотида номер 1995 SEQ ID NO: 13 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью диаминопимелатдекарбоксилазы.

В данном описании «способность продуцировать L-аминокислоту» относится к способности накапливать значительное количество L-аминокислоты в среде или к увеличению содержания аминокислоты в бактериальных клетках, в том случае, когда микроорганизм согласно изобретению культивируют в среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показан способ получения плазмиды RSF24P, имеющей мутантный dapA. «dapA*24» относится к мутантному dapA, который кодирует мутантный фермент DDPS, в котором остаток гистидина 118 заменен остатком тирозина.

На фиг. 2 показан способ получения плазмиды RSFD80, имеющей мутантный dapA и мутантный lysC. «lysC*80» относится к мутантному lysC, который кодирует мутантную AKIII, где остаток треонина 352 заменен остатком изолейцина.

На фиг. 3 показана аспартокиназная активность трансформированных штаммов E. coli, содержащих ген ask.

На фиг. 4 показана активность дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты трансформированных штаммов E. coli, содержащих ген asd.

На фиг. 5 показана дигидродипиколинатсинтазная активность трансформированных штаммов E. coli, содержащих ген dapA.

На фиг. 6 показана дигидродипиколинатредуктазная активность трансформированного штамма E. coli, содержащего ген dapB.

На фиг. 7 показана диаминопимелатдекарбоксилазная активность трансформированных штаммов E. coli, содержащих ген lysA.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

<1> Микроорганизм данного изобретения.

Микроорганизмом согласно изобретению является бактерия, относящаяся к роду Methylophilus и обладающая способностью продуцировать L-аминокислоту. Бактерия Methylophilus согласно изобретению включает в себя, например, штамм Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) и так далее. Штамм Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) доступен для приобретения из национальных коллекций промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria) (адрес: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).

L-аминокислоты, полученные согласно изобретению, включают в себя L-лизин, L-глутаминовую кислоту, L-треонин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, L-триптофан, L-фенилаланин, L-тирозин и так далее. Можно получать один или большее количество типов таких аминокислот.

Бактерии Methylophilus, обладающие способностью продуцировать L-аминокислоты, могут быть получены посредством придания способности продуцировать L-аминокислоты штаммам бактерий Methylophilus дикого типа. Чтобы придать способность продуцировать L-аминокислоты, могут быть использованы способы, традиционно принятые в селекции коринеформных бактерий, бактерий Escherichia и им подобных, такие как способы получения ауксотрофных мутантных штаммов, штаммов, резистентных к аналогам L-аминокислот, или мутантных штаммов в отношении контроля метаболических процессов, и способы получения рекомбинантных штаммов, в которых повышены активности ферментов биосинтеза L-аминокислот (смотри “Amino Acid Fermentation” the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1^st Edition, опубликованная 30 мая, 1986, pp. 77-100). При селекции бактерий, продуцирующих аминокислоты, такие характеристики, как ауксотрофия, резистентность к аналогу L-аминокислоты и мутация метаболического контроля, можно придать бактериям отдельно или в комбинации из двух или большего количества характеристик. Активность ферментов биосинтеза L-аминокислот может быть усилена для каждого в отдельности или для комбинации одного или большего количества ферментов. Кроме того, придание таких характеристик, как ауксотрофия, резистентность к аналогу L-аминокислоты и мутация метаболического контроля, можно комбинировать с усилением активности ферментов биосинтеза L-аминокислот.

Например, бактерии, продуцирующие L-лизин, получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-гомосерину или L-треонину и L-метионину (заявка на патент Японии (Kokoku) № 48-28078/1973 и 56-6499/1981), мутанты, проявляющие ауксотрофию по инозиту или уксусной кислоте (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 55-9784/1980 и 56-8692/1981), или мутанты, которые устойчивы к оксализину, лизингидроксамату, S-(2-аминоэтил)цистеину, γ-метиллизину, α-хлоркапролактаму, DL-α-амино-ε-капролактаму, α-аминолауриллактаму, аналогу аспарагиновой кислоты, сульфамидному лекарственному препарату, хиноиду или N-лауроиллейцину.

Кроме того, бактерии, продуцирующие L-глутаминовую кислоту, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по олеиновой кислоте или ей подобному. Бактерии, продуцирующие L-треонин, могут быть получены при селекции как мутанты, устойчивые к α-амино-β-гидроксивалериановой кислоте. Бактерии, продуцирующие L-гомосерин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-треонину, или мутанты, устойчивые к аналогам L-фенилаланина. Бактерии, продуцирующие L-фенилаланин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-тирозину. Бактерии, продуцирующие L-изолейцин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-лейцину. Бактерии, продуцирующие L-пролин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-изолейцину.

Более того, как указано в примерах далее, штаммы, которые продуцируют один или большее количество видов разветвленных аминокислот (L-валин, L-лейцин и L-изолейцин), могут быть получены как штаммы, проявляющие ауксотрофию по казаминовой кислоте.

Чтобы получить мутанты бактерий Methylophilus, авторы изобретения сначала изучили детали оптимальных условий мутагенеза с использованием в качестве показателя частоты появления штаммов, резистентных к стрептомицину. В результате максимальная частота появления резистентных к стрептомицину штаммов была получена в том случае, когда степень выживаемости после мутагенеза составляла примерно 0,5%, и авторы достигли цели в получении ауксотрофных штаммов при данных условиях. Авторы также достигли успеха в получении ауксотрофных штаммов, получить которые считалось трудным, посредством значительного увеличения масштаба скрининга мутантов по сравнению с проводимым ранее для E. coli, и так далее.

Как описано выше, поскольку было обнаружено, что мутанты можно получить путем мутагенеза бактерий Methylophilus в соответствующих условиях, стало возможным легко получать желаемые мутанты, выбирая такие подходящие условия, при которых степень выживаемости после мутагенеза должна соответствовать примерно 0,5%, в зависимости от способа мутагенеза.

Способы мутагенеза для получения мутантов бактерий Methylophilus включают в себя УФ-облучение и обработку мутагенными средствами, используемыми при обычных мутагенных обработках, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистая кислота. Бактерии Methylophilus, обладающие способностью продуцировать L-аминокислоты, также можно получить путем селекции мутантов бактерий Methylophilus природного происхождения.

Мутанты, устойчивые к аналогам L-аминокислот, можно получить, например, инокулируя мутантные бактерии Methylophilus на агаризованную среду, содержащую аналог L-аминокислоты в различных концентрациях, и отбирая штаммы, которые формируют колонии.

Ауксотрофные мутанты можно получить, давая возможность бактериям Methylophilus формировать колонии на агаризованной среде, содержащей целевое питательное вещество (например, L-аминокислоту), получением реплик колоний на агаризованной среде, не содержащей указанного питательного вещества, и отбором штаммов, которые не могут расти на агаризованной среде, не содержащей питательного вещества.

Способы придания или усиления способности продуцировать L-аминокислоты посредством повышения активности ферментов биосинтеза L-аминокислот будут показаны на примерах ниже.

[L-лизин]

Способность продуцировать L-лизин можно придать, например, усиливая активность дигидродипиколинатсинтазы и/или активность аспартокиназы.

Активность дигидродипиколинатсинтазы и/или активность аспартокиназы бактерий Methylophilus можно повысить путем лигирования фрагмента гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и/или фрагмента гена, кодирующего аспартокиназу, с вектором, который функционирует в бактериях Methylophilus, предпочтительно с вектором мультикопийного типа, чтобы создать рекомбинантную ДНК, и введением его в бактерию-хозяина Methylophilus, чтобы трансформировать хозяина. В результате увеличения числа копий гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и/или гена, кодирующего аспартокиназу, в клетках трансформированного штамма активность или активности ферментов повысятся. Далее дигидродипиколинатсинтаза, аспартокиназа и аспартокиназа III также обозначаются сокращениями DDPS, AK и AKIII, соответственно.

В качестве микроорганизма, предоставляющего ген, который кодирует DDPS, и ген, который кодирует АК, могут быть использованы любые микроорганизмы, при условии, что они имеют гены, обеспечивающие экспрессию активности DDPS и активности АК у микроорганизмов, относящихся к роду Methylophilus. Такими микроорганизмами могут быть штаммы дикого типа или полученные от них мутантные штаммы. В частности, примеры таких микроорганизмов включают в себя штамм К-12 E. coli (Escherichia coli), штамм AS1 Methylophilus methylotrophus (NCIMB10515) и так далее. Так как найдены нуклеотидные последовательности обоих генов - гена, кодирующего DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297, (1986)), и гена, кодирующего AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), полученных от бактерии Escherichia, указанные гены могут быть получены ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидных последовательностей этих генов, и хромосомной ДНК такого микроорганизма как E. coli K-12 или ему подобного, в качестве матрицы. В качестве конкретных примеров ниже будут даны пояснения относительно dapA и lysC, полученных из E. coli. Однако гены, используемые в данном изобретении, не ограничены указанными выше генами.

Предпочтительно, чтобы DDPS и АК, используемые согласно изобретению, не претерпевали ингибирования L-лизином по принципу обратной связи. Известно, что DDPS дикого типа, полученная из E. coli, претерпевает ингибирование L-лизином по принципу обратной связи, и что AKIII дикого типа, полученная из E. coli, претерпевает супрессию и ингибирование по принципу обратной связи L-лизином. Поэтому dapA и lysC, вводимые в бактерии Methylophilus, предпочтительно кодируют DDPS и AKIII, имеющие мутацию, которая десенсибилизирует к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи. В дальнейшем DDPS, имеющая мутацию, которая десенсибилизирует к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, также называется «мутантной DDPS», и ДНК, кодирующая мутантную DDPS, также именуется «мутантным dapA». AKIII, полученная из E. coli, имеющая мутацию, которая десенсибилизирует к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, также называется «мутантной AKIII», и ДНК, кодирующая мутантную AKIII, также именуется «мутантным lysC».

Согласно данному изобретению, необязательно необходимо, чтобы DDPS и АК были мутантными. Известно, например, что DDPS, полученная из бактерий Corynebacterium, не подвергается ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Нуклеотидная последовательность dapA дикого типа, полученного из E. coli, приведена в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность DDPS дикого типа, кодируемая указанной нуклеотидной последовательностью, иллюстрируется SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность lysC дикого типа, полученного из E. coli, иллюстрируется SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность ATIII дикого типа, кодируемая указанной нуклеотидной последовательностью, иллюстрируется SEQ ID NO: 4.

ДНК, кодирующая мутантную DDPS, которая не подвергается ингибированию по принципу обратной связи L-лизином, включает в себя ДНК, кодирующую DDPS, которая имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 2, где остаток гистидина 118 заменен остатком тирозина. ДНК, кодирующая мутантную AKIII, которая не подвергается ингибированию по принципу обратной связи L-лизином, включает в себя ДНК, кодирующую AKIII, которая имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 4, где остаток треонина 352 заменен остатком изолейцина.

Плазмидой, используемой для клонирования гена, может быть любая плазмида, при условии, что она может реплицироваться в микроорганизме, таком как бактерии Escherichia и им подобные, и в частности, включая pBR322, pTWV228, pMW119, pUC19, и так далее.

Вектором, который функционирует в бактериях Methylophilus, является, например, плазмида, которая может автономно реплицироваться в бактериях Methylophilus. В частности, можно упомянуть RSF1010, который представляет собой вектор широкого спектра хозяев, и его производные, например, pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161-167, (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53, (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) и так далее.

Чтобы приготовить рекомбинантную ДНК лигированием dapA и lysC с вектором, который функционирует в бактериях Methylophilus, вектор переваривают ферментом рестрикции, который соответствует концу фрагмента ДНК, содержащего dapA и lysC. Лигирование обычно выполняют с использованием лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4. dapA и lysC могут быть индивидуально включены в отдельные векторы или в один вектор.

В качестве плазмиды, содержащей мутантный dapA, кодирующий мутантную DDPS, и мутантный lysC, кодирующий мутантную AKIII, была известна плазмида RSFD80 с широким спектром хозяев (WO95/16042). Штамм JM109 E. coli, трансформированный указанной плазмидой, назван AJ12396 и помещен на хранение в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (почтовый индекс 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) 28 октября 1993 г. и получил инвентарный номер FERM P-13936, и перенесен для международного депонирования по условиям Будапештского соглашения 1 ноября 1994 г., и получил инвентарный номер FERM BP-4859. RSFD80 можно получить из штамма AJ12396 известным способом.

Мутантный dapA, имеющийся в RSFD80, имеет нуклеотидную последовательность dapA дикого типа SEQ ID NO: 1, включая замену С в нуклеотиде номер 623 на Т. Поэтому кодируемая мутантная DDPS имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, включая замену остатка гистидина 118 на остаток тирозина. Мутантный lysC, имеющийся в RSFD80, имеет нуклеотидную последовательность lysC дикого типа SEQ ID NO: 3, включая замену С в нуклеотиде номер 1638 на Т. Поэтому кодируемая мутантная AKIII имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, включая замену остатка треонина 352 на остаток изолейцина.

Для того чтобы ввести рекомбинантную ДНК, полученную, как описано выше, в бактерии Methylophilus, можно использовать любой способ, при условии, что он обеспечивает достаточную эффективность трансформации. Например, можно использовать электропорацию (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

Активность DDPS и/или активность АК также может быть повышена при наличии множественных копий dapA и/или lysC в хромосомной ДНК бактерий Methylophilus. Чтобы ввести множественные копии dapA и/или lysC в хромосомную ДНК бактерий Methylophilus, проводят гомологичную рекомбинацию с использованием в качестве мишени последовательности, которая представлена в хромосомной ДНК бактерий Methylophilus множеством копий. В качестве последовательности, присутствующей в хромосомной ДНК во множестве копий, можно использовать повторяющуюся ДНК, инвертированные повторы, имеющиеся на конце транспозируемого элемента, и им подобные. В альтернативном случае, как заявлено в опубликованной заявке на патент Японии (Kokai) № 2-109985/1990, множественные копии dapA и/или lysC могут быть введены в хромосомную ДНК посредством их встраивания в транспозон, чтобы их перенести. В обоих способах в результате увеличенного количества копий dapA и/или lysC в трансформированных штаммах активность DDPS и активность АК будут повышены.

Кроме указанной выше амплификации генов, активность DDPS и/или активность АК может быть повышена путем замены последовательности, контролирующей экспрессию, такой как промоторы dapA и/или lysC, более сильными промоторами (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 1-215280/1989). В качестве сильных промоторов известны, например, промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор P_R и промотор P_L фага лямбда, промотор tet, промотор amyE, промотор spac и так далее. Замещение этими промоторами усиливает экспрессию dapA и/или lysC, и таким образом активность DDPS и активность АК повышаются. Усиление последовательностей, контролирующих экспрессию, можно комбинировать с увеличением числа копий dapA и/или lysC.

Чтобы приготовить рекомбинантную ДНК лигированием фрагмента гена и вектора, вектор переваривают ферментом рестрикции, соответствующим концу фрагмента гена. Лигирование обычно выполняют с помощью лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4. В качестве способов переваривания, лигирования и других способов для ДНК, подготовки хромосомной ДНК, ПЦР, получения плазмидной ДНК, трансформации, конструирования олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров, и так далее, можно использовать стандартные способы, хорошо известные специалистам в данной области. Указанные способы описаны в Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) и так далее.

В дополнение к повышению активности DDPS и/или активности АК также может быть повышена активность другого фермента, вовлеченного в биосинтез L-лизина. К таким ферментам относятся ферменты пути метаболизма диаминопимелата, такие как дигидродипиколинатредуктаза, диаминопимелатдекарбоксилаза, диаминопимелатдегидрогеназа (WO96/40934 для всех вышеуказанных ферментов), фосфоенолпируваткарбоксилаза (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 60-87788/1985), аспартатаминотрансфераза (опубликованная заявка на патент Японии (Kokoku) № 6-102028/1994), диаминопимелатэпимераза, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты и так далее, или ферменты пути метаболизма аминоадипата, такие как гомоаконитатгидратаза, и так далее. Предпочтительно повышают активность по меньшей мере одного фермента из дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, дегидродипиколинатредуктазы и диаминопимелатдекарбоксилазы.

Аспартокиназа, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидродипиколинатсинтаза, дигидродипиколинатредуктаза и диаминопимелатдекарбоксилаза, полученные из Methylophilus methylotrophus, будут описаны далее.

Кроме того, у микроорганизмов согласно изобретению может быть снижена активность фермента, который катализирует реакцию образования другого соединения, отличного от L-лизина, посредством ответвления пути биосинтеза L-лизина, или они могут быть дефицитны по такому ферменту. Фермент, который катализирует реакцию образования не L-лизина, а другого соединения, посредством ответвления пути биосинтеза L-лизина, включает гомосериндегидрогеназу (смотри WO95/23864).

Аналогично вышеупомянутые способы повышения активности фермента, вовлеченного в биосинтез L-лизина, могут быть использованы для других аминокислот, указанных ниже.

[L-глутаминовая кислота]

Способность продуцировать L-глутаминовую кислоту можно придать бактериям Methylophilus, например, путем введения ДНК, которая кодирует любой из ферментов, включая глутаматдегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 61-268185/1986), глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу, изоцитратдегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 62-166890/1987 и 63-214189/1988), аконитатгидратазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 62-294086/1987), цитратсинтазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 62-201585/1987 и 63-119688/1988), фосфоенолпируваткарбоксилазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 60-87788/1985 и 62-55089/1987), пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктокиназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 63-102692/1988), глюкозофосфатизомеразу, глутамин-оксоглутаратаминотрансферазу (WO99/07853) и так далее.

Кроме того, у микроорганизмов согласно изобретению может быть снижена активность фермента, который катализирует реакцию образования другого соединения, отличного от L-глутаминовой кислоты, посредством ответвления пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, или они могут быть дефицитны по такому ферменту. Фермент, который катализирует реакцию образования не L-глутаминовой кислоты, а другого соединения посредством ответвления пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, включает в себя α-кетоглутаратдегидрогеназу (αKGDH), изоцитратлиазу, фосфатацетилтрансферазу, ацетаткиназу, синтазу ацетооксикислоты, ацетолактатсинтазу, формиатацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу, глутаматдекарбоксилазу, 1-пирролин-дегидрогеназу и так далее.

[L-треонин]

Способность продуцировать L-треонин можно придать или повысить, например, усиливая активности аспартокиназы, гомосериндегидрогеназы, гомосеринкиназы и треонинсинтазы. Активности указанных ферментов можно повысить, например, путем трансформации бактерий Methylophilus с использованием рекомбинантной плазмиды, содержащей оперон треонина (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 55-131397/1980, 59-31691/1984 и 56-15696/1981 и опубликованная заявка на патент Японии (Kohyo) № 3-501682/1991).

Способность к продуцированию также можно придать или повысить путем амплификации или введения оперона треонина, содержащего ген, кодирующий аспартокиназу, которая десенсибилизирована к ингибированию L-треонином по принципу обратной связи (опубликованная заявка на патент Японии (Kokoku) № 1-29559/1989), ген, кодирующий гомосериндегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 60-012995/1985), или ген, кодирующий гомосеринкиназу и гомосериндегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 61-195695/1986).

Кроме того, способность продуцировать L-треонин можно повысить путем введения ДНК, кодирующей мутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу, имеющую мутацию десенсибилизации к ингибированию аспарагиновой кислотой по принципу обратной связи.

[L-валин]

Способность продуцировать L-валин можно придать, например, путем введения в бактерии Methylophilus гена биосинтеза L-валина, механизм регуляции которого в значительной степени десенсибилизирован. Также можно ввести мутацию, которая в значительной степени десенсибилизирует механизм регуляции гена биосинтеза L-валина, который несет микроорганизм, относящийся к роду Methylophilus.

Примеры гена биосинтеза L-валина включают в себя, например, оперон ilvGMEDA E. coli. Треониндезаминаза, кодируемая геном ilvA, катализирует реакцию дезаминирования, превращающую L-треонин в 2-кетомасляную кислоту, которая является определяющим скорость этапом биосинтеза L-изолейцина. Поэтому для того, чтобы добиться эффективного усиления реакций синтеза L-валина, предпочтительно использовать оперон, который не экспрессирует активность треониндезаминазы. Примеры оперона ilvGMEDA, который не экспрессирует такой треониндезаминазной активности, включают в себя оперон ilvGMEDA, в котором в ilvA введена мутация элиминирования активности треониндезаминазы, или ilvA нарушен, и оперон, в котором ilvA делетирован.

Так как оперон ilvGMEDA претерпевает контроль экспрессии оперона (ослабление) L-валином и/или L-изолейцином и/или L-лейцином, район, необходимый для ослабления, предпочтительно удаляют или подвергают мутации, чтобы ликвидировать чувствительность к супрессии экспрессии L-валином.

Оперон ilvGMEDA, который не экспрессирует треониндезаминазную активность и который лишен чувствительности к ослаблению, как описано выше, можно получить, подвергая оперон ilvGMEDA дикого типа мутагенной обработке или модифицируя его с помощью технологии рекомбинации генов (смотри WO96/06926).

[L-лейцин]

Способность продуцировать L-лейцин можно придать или повысить, например, введением в микроорганизм, относящийся к роду Methylophilus, гена биосинтеза L-лейцина, механизм регуляции которого в значительной степени десенсибилизирован, в дополнение к указанным выше характеристикам, необходимым для продукции L-валина. Также можно ввести такую мутацию, при которой механизм регуляции гена биосинтеза L-лейцина в микроорганизме, относящемся к роду Methylophilus, будет в значительной степени элиминирован. Примеры указанного гена включают в себя, например, ген leuA, который дает фермент, ингибирование которого L-лейцином в значительной степени устранено.

[L-изолейцин]

Способность продуцировать L-изолейцин можно придать, например, введением оперона thrABC, содержащего ген thrA, кодирующий аспартокиназу I/гомосериндегидрогеназу I, полученную из E. coli, который в значительной степени десенсибилизирован к ингибированию L-треонином, и оперона ilvGMEDA, который содержит ген ilvA, кодирующий треониндезаминазу, который в значительной степени десенсибилизирован к ингибированию L-изолейцином и район которого, необходимый для ослабления, удален (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 8-47397/1996).

[Другие аминокислоты]

Биосинтез L-триптофана, L-фенилаланина, L-тирозина, L-треонина и L-изолейцина можно усилить, повышая способность бактерий Methylophilus продуцировать фосфоенолпируват (WO97/08333).

Способность продуцировать L-фенилаланин и L-тирозин повышали путем амплификации или введения десенсибилизированного гена хоризматмутазы-префенатдегидратазы (CM-PDT) (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 5-236947/1993 и 62-130693/1987) и десенсибилизированного гена 3-дезокси-D-арабиногептулонат-7-фосфатсинтазы (DS) (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 5-236947/1993 и 61-124375/1986).

Способность продуцировать L-триптофан повышают путем амплификации или введения триптофанового оперона, содержащего ген, кодирующий десенсибилизированную антранилатсинтазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) № 57-71397/1982, 62-244382/1987 и патент США № 4371614).

В данном описании выражение «активность фермента повышена» обычно относится к тому, что внутриклеточная активность фермента выше, чем активность у штамма дикого типа, и к тому случаю, когда штамм, в котором активность фермента повышена, получают путем модификации с использованием технологии рекомбинации генов или подобным способом, при этом внутриклеточная активность фермента выше, чем активность у штамма до модификации. Выражение «активность фермента снижена» обычно относится к тому, что внутрик