Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения

Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США номер 60/472844, поданной 23 мая 2003 г., и предварительной заявки на патент США номер 60/547975, поданной 26 февраля 2004 г., включенных в данное описание во всей своей полноте в качестве ссылки.

Данное изобретение проведено при правительственной поддержке в рамках NIH Intramural Research Project #Z01-AI-000224. Правительство имеет определенные права на изобретение.

Уровень техники изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым способам диагностики, прогнозирования, мониторинга прогресса и лечения нарушений, происходящих из-за нарушенной иммунной системы (например, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания и отторжение трансплантата, и злокачественные опухоли, и инфекционные заболевания), связанных с индуцируемым глюкокортикоидами TNF-рецептором (GITR) и лигандом, ассоциированным с GITR (GITRL), и со связанными с ними модуляторами. Настоящее изобретение далее относится к новым терапевтическим средствам и терапевтическим мишеням и к способу скрининга и оценки тестируемых соединений на предмет вмешательства (лечения) и предотвращения нарушений, происходящих от нарушенной регуляции иммунной системы, что связано с GITR и GITRL.

Уровень техники

В общем, T-лимфоциты ответственны за клеточно-опосредованный иммунитет и играют регуляторную роль путем усиления или подавления ответов других лейкоцитов. Существует представление о том, что Т-лимфоциты играют роль в подавлении иммунных реакций (см., например, Gershon et al. (1970) Immunology 18: 723-35). Однако антигены-мишени для данных супрессорных клеток и механизмы, контролирующие их функцию, пока являются объектами исследования.

Одна из популяций регуляторных T-клеток, которая генерируется в тимусе, отличается от эффекторных Т-клеток экспрессией уникальных мембранных антигенов. Данные регуляторные Т-клетки составляют субпопуляцию CD4⁺ T-клеток (т.е. T-клеток, которые экспрессируют CD4-антиген), которые совместно экспрессируют CD25-антиген. CD25 также известен как α-цепь рецептора интерлейкина-2 (IL-2R). Совместный перенос или реконституция в Т-клетки CD25⁺ ассоциированы с предотвращением воспалительных повреждений и аутоиммунитета у различных экспериментальных животных (см. Shevach (2000) Ann. Rev. Immunol. 18: 423-49 и приведенные там ссылки). CD4⁺CD25⁺ T-клетки также ассоциированы с ингибированием активации T-клеток in vitro и адаптивного подавления CD4⁺CD25^- T-клеток в совместной культуре (Shevach, выше).

Более двух десятилетий назад было продемонстрировано, что аутореактивные T-клетки избегают механизмов центральной толерантности и существуют на периферии под контролем регуляторных Т-клеток тимусного происхождения. В 1995 г. Sakaguchi и его коллеги продемонстрировали, что малая популяция CD4⁺ T-клеток, которые в природе экспрессируют α-цепь IL-2R (т.е. CD25), вовлечена в контроль органоспецифических аутореактивных T-клеток (Sakaguchi et al. (1995) J. Immunol. 155: 1151-64). Конкретно они продемонстрировали, что перенос CD4⁺CD25^- T-клеток иммунодефицитным хозяевам вызывает спектр аутоиммунных реакций, которые могут предотвращаться совместным переносом CD4⁺CD25⁺ T-клеток (Sakaguchi et al., выше). Последующие исследования связали CD4⁺CD25⁺ регуляторные T-клетки с подавлением иммунных реакций на вирусные, бактериальные и протозойные инфекции (Aseffa et al. (2002) J. Immunol. 169:3232-41; Belkaid et al. (2002) Nature 420: 502-07; Hisaeda et al. (2004) Nat. Med. 10:29-30; Kursar et al. (2002) J. Exp. Med. 196:1585-92; Lundgren et al. (2003) Infect. Immun. 71:1755-62; Maloy et al. (2003) J. Exp. Med. 197:111-19). Вместе данные исследования предоставили доказательство того, что удаление CD4⁺CD25⁺ T-клеток усилило иммунный ответ. Сделано много попыток для определения активации и супрессии данными CD4⁺CD25⁺ T-клетками. Данные клетки представляют собой уникальную родословную клеток тимусного происхождения, которые мощно подавляют эффекторную функцию Т-клеток in vitro и in vivo.

В некоторых исследованиях in vitro выявлено, что CD4⁺CD25⁺ клетки подавляют пролиферацию CD4⁺ T-клеток в ответ и на митогены, и антигены путем выключения транскрипции IL-2 (например, Thornton and Shevach (1998) J. Exp. Med. 188:287-96; Takahashi et al. (1998) Int. Immunol. 10:1969-80). Совместного переноса CD4⁺CD25⁺ T-клеток in vivo с аутореактивными CD4⁺ T-клетками достаточно для подавления индукции и эффекторной фазы органоспецифического аутоиммунитета (Suri-Payer et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:669-77; Suri-Payer et al. (1998) J.Immunol. 160:1212-18). Другие свойства CD4⁺CD25⁺ T-клеток включают в себя слабую реакционную способность в ответ на стимуляцию T-клеточного рецептора (TCR) в отсутствие экзогенного IL-2, иммуносупрессию путем межклеточного взаимодействия и необходимость в передаче сигнала с TCR для индукции их супрессорного фенотипа (однако, если они активируются, их супрессорная функция независима от антигенного стимула). Также продемонстрировано, что само приобретение экспрессии CD25, которое может достигаться стимуляцией CD4⁺CD25^- T-клеток, не индуцирует супрессорного фенотипа. Известно, что данные CD4⁺CD25⁺ T-клетки существуют у людей (Shevach (2001) J. Exp. Med. 193:F1-F6).

В одном из исследований продемонстрировано, что для генерирования регуляторных CD4⁺CD25⁺ T-клеток требуется измененная селекция в тимусе (Jordan et al. (2001) Nat. Immunol. 2:301-06). Кроме того, в исследованиях с нокаут-мышами продемонстрировано, что молекулы, вовлеченные в синтез и реакционную способность IL-2, требуются для генерирования данных клеток; мыши, генетически дефицитные по IL2, или IL2Rβ, или по B7.1 (CD80) и B7.2 (CD86), или по CD28, все характеризуются сильным снижением количества CD4⁺CD25⁺ клеток, и в результате этого лимфаденопатией и гиперпролиферацией периферии у некоторых из данных мышей (Papiernik et al. (1998) Int. Immunol. 10:371-78; Salomon et al. (2000) Immunity 12:431-40; Kumanogoh et al. (2001) J. Immunol. 166:353-60).

До недавнего времени в данной области не удавалось определить механизмы, вовлеченные в опосредованное CD4⁺CD25⁺ подавление иммунной системы, например антигенная специфичность, молекулы, вовлеченные в приобретение подавления, и молекулы клеточной поверхности или короткодействующие цитокины, вовлеченные в эффекторную фазу подавления; молекулярные мишени CD25⁺ T-клеток, используемые при модулировании аутоиммунитета, также оставались большей частью неизвестными. В настоящее время было продемонстрировано, путем оценки дифференциальной экспрессии генов с использованием анализа генных чипов на CD4⁺CD25⁺ и CD4⁺CD25^- T-клетках, что существуют некоторые дифференциальные зависимые от CD25⁺ гены (McHugh et al. (2002) Immunity 16:311-23; см. также заявку на патент США 10/194754, включенную в данное описание во всей своей полноте в качестве ссылки). Данные гены, которые, как было определено, преимущественно экспрессируются в CD4⁺CD25⁺ T-клетках, могут служить мишенями для терапевтического воздействия и способов скрининга аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний и отторжения трансплантата, а также злокачественных опухолей и инфекционных заболеваний.

Значимо то, что один из генов, который, как было определено, дифференциально экспрессировался в CD25⁺ клетках, является индуцируемым глюкокортикоидами TNF-рецептором (GITR) (McHugh et al., выше). GITR, трансмембранный белковый рецептор клеточной поверхности, является представителем надсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR). Как было продемонстрировано, GITR конститутивно присутствует на неактивированных T-клетках (Gavin et al. (2002) Nat. Immunol. 3:33-41; McHugh et al., выше; Shimizu et al. (2002) Nat. Immunol. 3:135-42). GITR связывается с другим трансмембранным белком, называемым лиганд GITR (GITRL). Антитела-агонисты GITR, как было показано, отменяют супрессорную активность CD4⁺CD25⁺ T-клеток, что демонстрирует функциональную роль GITR в регуляции активности данных клеток (McHugh et al., выше). Другое исследование подтвердило, что стимуляция GITR специфичным моноклональным антителом отменяла опосредованную CD4⁺CD25⁺ T-клетками супрессию, с индукцией таким образом аутоиммунитета (Shimizu et al., выше). Данные исследования ведут к предположению, что GITR является более надежным маркером CD4⁺CD25⁺ T-клеток (Uraushihara et al. (2003) J. Immunol. 171:708-16); однако не только экспрессия GITR характерна для этой субпопуляции, поскольку положительная регуляция GITR также происходит после активации CD4⁺CD25^- T-клеток (McHugh et al., выше; Shimizu et al., выше).

Поскольку GITR, как было показано, значим при регуляции супрессорной активности CD4⁺CD25⁺ T-клеток в отношении CD4⁺CD25^- T-клеток, требуется идентифицировать и охарактеризовать новые молекулы, которые взаимодействуют с GITR. Такие новые молекулы, которые взаимодействуют с GITR, описаны в данном описании. Кроме того, предоставлены модуляторы данных молекул.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к нуклеотидной и аминокислотной последовательностям нового мышиного гомолога человеческого GITRL. Настоящее изобретение также относится к антителам против мышиного GITRL. Настоящее изобретение также относится к способам как отмены иммуносупрессии путем индукции агонистического связывания GITR-GITRL, так и восстановления или усиления иммуносупрессии путем ингибирования связывания GITR-GITRL, например, путем применения нейтрализующих антител, которые ингибируют активность GITRL (например, которые блокируют взаимодействие между GITR и GITRL). Такая отмена или восстановление/усиление иммуносупрессии благоприятно для лечения различных нарушений, возникающих в результате разрегулированных иммунных реакций, например аутоиммунных нарушений, воспалительных заболеваний и отторжения трансплантата, и злокачественных опухолей и инфекционных заболеваний. Способы по настоящему изобретению направлены на манипулирование GITRL и GITR, включая, но без ограничения, мышиный GITRL и GITR и их гомологи; в состав данных гомологов специфично включен человеческий GITRL и человеческий GITR.

Настоящее изобретение относится к новым выделенным и очищенным полинуклеотидам и полипептидам, относящимся к новому лиганду GITR (GITRL). Изобретение также относится к антителам против GITRL, а также к способам лечения, диагностики, прогнозирования и мониторинга прогресса аутоиммунных нарушений, воспалительных заболеваний и отторжения трансплантата и злокачественных опухолей и инфекционных заболеваний. В одном из вариантов осуществления изобретения описанные способы и молекулы могут применяться для манипуляции исходом иммунного ответа во время лечения заболевания или нарушения, включая аутоиммунные нарушения, воспалительные заболевания и отторжение трансплантата и злокачественные опухоли и инфекционные заболевания. В другом варианте осуществления описанные полинуклеотиды и полипептиды по изобретению, блокирующие или ингибирующие взаимодействие между GITR и GITRL, например, путем отрицательной регуляции экспрессии или активности GITRL или путем связывания с GITRL, но не индуцирующие передачу сигнала с GITR, могут применяться для отмены или усиления супрессии иммунной системы. В другом варианте осуществления взаимодействие между GITR и GITRL может блокироваться или ингибироваться малой молекулой. Специалисту в данной области будет очевидно, что данные типы регуляции (т.е. данные варианты осуществления) являются наиболее благоприятными для лечения аутоиммунных нарушений и некоторых воспалительных заболеваний и сходных или связанных нарушений, а также для лечения отторжения трансплантата. В другом варианте осуществления описанные полинуклеотиды и полипептиды по изобретению, которые индуцируют передачу сигнала с GITR, например, путем положительной регуляции экспрессии или активности GITRL или путем агонистического связывания с GITR, могут использоваться для обращения, блокирования или отмены супрессии иммунной системы. В другом варианте осуществления взаимодействие между GITR и GITRL может усиливаться или имитироваться малой молекулой. Специалисту в данной области будет очевидно, что данные типы регуляции являются наиболее благоприятными для лечения злокачественных опухолей и подобных заболеваний, а также инфекционных заболеваний. Специалисту в данной области также известны вероятные преимущества комбинации данных новых способов лечения с общепринятыми и другими способами лечения.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты функционально связана, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии. В другом варианте осуществления предоставляется клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная данной молекулой нуклеиновой кислоты.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному аллелю SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному гену, включающему в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, или с комплементарной ей последовательностью.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент, который кодирует активный фрагмент белка. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент функционально связаны, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии. В другом варианте осуществления предоставляется клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная выделенной молекулой нуклеиновой кислоты или ее фрагмента, функционально связанной, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии. В другом варианте осуществления изобретение относится к не относящемуся к человеку трансгенному животному, в котором соматические и зародышевые клетки содержат данную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или ее фрагмент. В другом варианте осуществления изобретение относится к не относящемуся к человеку трансгенному животному, в котором соматические и зародышевые клетки содержат ДНК, включающую в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному белку, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую выделенной нуклеиновой кислотой, которая специфично гибридизуется в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, или с комплементарной ей последовательностью. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее активный фрагмент.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комлементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, или ее фрагмент, где экспрессия данной нуклеиновой кислоты в клетке приводит к сниженной продукции GITRL. В другом варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты или ее фрагмент функционально связаны, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии. В другом варианте осуществления предоставляется клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная данной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты или ее фрагментом, функционально связанной, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии. В другом варианте осуществления изобретение относится к не относящемуся к человеку трансгенному животному, в котором соматические и зародышевые клетки содержат данную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или ее фрагмент.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, комплементарному мРНК, соответствующей молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 или ее фрагмент, где олигонуклеотид ингибирует экспрессию GITRL. В другом варианте осуществления изобретение относится к молекуле siРНК (короткой интерферирующей РНК), соответствующей молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 или ее фрагмент, где молекула siРНК ингибирует экспрессию GITRL.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу, способному к специфичному связыванию выделенного белка, содержащего аминокислотную последовательность, кодируемую выделенной нуклеиновой кислотой, которая специфично гибридизуется в условиях высокой жесткости с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, или с комплементарной ей последовательностью. В другом варианте осуществления антитело нейтрализует активность GITRL. В другом варианте осуществления антитело представляет собой 5F1, имеющее номер ATCC PTA-5336, или 10F12, имеющее номер ATCC PTA-5337. В другом варианте осуществления антитело включает в себя антигенсвязывающие фрагменты 5F1 или 10F12. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу, способному специфично связывать выделенный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее активный фрагмент. В другом варианте осуществления антитело нейтрализует активность GITRL. В другом варианте осуществления антитело представляет собой 5F1, имеющее номер ATCC PTA-5336, или 10F12, имеющее номер ATCC PTA-5337. В другом варианте осуществления антитело содержит антигенсвязывающие фрагменты 5F1 или 10F12.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу скрининга тестируемых соединений, способных ингибировать или блокировать взаимодействие GITRL с GITR, включающему стадии контакта образца, содержащего GITRL и GITR, с тестируемым соединением, и определения того, снижено ли взаимодействие GITRL с GITR в образце по сравнению с взаимодействием GITRL с GITR в образце, не контактировавшем с данным соединением, за счет чего снижение взаимодействия GITRL с GITR в образце, контактировавшем с данным соединением, идентифицирует соединение как то, которое ингибирует или блокирует взаимодействие GITRL с GITR. В другом варианте осуществления идентифицированное соединение применяют в способе лечения субъекта при риске или поставленном диагнозе аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или отторжения трансплантата, причем данный способ включает стадии выделения из субъекта T-клеток, обработки выделенных T-клеток идентифицированным соединением и переноса Т-клеток обратно субъекту. В другом варианте осуществления идентифицированное соединение применяют в способе лечения субъекта при риске или поставленном диагнозе аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или отторжения трансплантата, причем данный способ включает введение субъекту идентифицированного соединения. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу оценки у субъекта эффективности идентифицированного соединения, включающему стадии выявления первого количества эффекторных Т-клеток у субъекта перед введением субъекту данного соединения, выявления второго числа эффекторных Т-клеток у субъекта после введения субъекту данного соединения и сравнения первого количества и второго количества, причем значимое снижение второго значения количества эффекторных Т-клеток по сравнению с первым значением указывает на то, что данное соединение эффективно при лечении у субъекта аутоиммунного нарушения, воспалительного заболевания или отторжения трансплантата. В другом варианте осуществления эффекторные Т-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу скрининга тестируемых соединений, способных усиливать или имитировать взаимодействие GITRL с GITR, включающему стадии контакта образца, содержащего GITRL и GITR, с тестируемым соединением и определения того, повышается ли взаимодействие GITRL с GITR в образце по сравнению с взаимодействием GITRL с GITR в образце, не контактировавшем с данным соединением, за счет чего такое повышение взаимодействия GITRL с GITR в образце, контактировавшем с данным соединением, идентифицирует данное соединение как то, которое усиливает или имитирует взаимодействие GITRL с GITR. В другом варианте осуществления идентифицированное соединение применяют в способе лечения субъекта при риске или поставленном диагнозе злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, причем данный способ включает стадии выделения из субъекта T-клеток, обработки выделенных T-клеток идентифицированным соединением и переноса Т-клеток обратно субъекту. В другом варианте осуществления идентифицированное соединение применяют в способе лечения субъекта при риске или поставленном диагнозе злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, причем данный способ включает введение субъекту идентифицированного соединения. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу оценки у субъекта эффективности идентифицированного соединения, включающему стадии выявления первого количества эффекторных Т-клеток у субъекта перед введением субъекту данного соединения, выявления второго количества эффекторных Т-клеток у субъекта после введения субъекту данного соединения и сравнения первого количества и второго количества, причем значимое повышение второго значения количества эффекторных Т-клеток по сравнению с первым значением указывает на то, что данное соединение эффективно при лечении у данного субъекта злокачественной опухоли или инфекционного заболевания. В другом варианте осуществления эффекторные Т-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу диагностики у субъекта аутоиммунного нарушения, воспалительного заболевания или отторжения трансплантата, включающему стадии выявления тестируемого количества продукта гена GITRL в образце от субъекта и сравнения тестируемого количества с нормальным количеством продукта гена GITRL в контрольном образце, за счет чего тестируемое количество, значимо превышающее нормальное количество, предоставляет позитивное указание на диагноз аутоиммунного нарушения, воспалительного заболевания или отторжения трансплантата. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу диагностики у субъекта злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающему стадии выявления тестируемого количества продукта гена GITRL в образце от субъекта и сравнения тестируемого количества с нормальным количеством продукта гена GITRL в контрольном образце, причем тестируемое количество, которое значимо ниже нормального количества, предоставляет позитивное указание на диагноз злокачественной опухоли или инфекционного заболевания.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения субъекта при риске или поставленном диагнозе аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или отторжения трансплантата, включающему введение субъекту антагониста GITR. В другом варианте осуществления способ относится к введению антагониста GITR, так что поддерживается чувствительность эффекторных T-клеток у субъекта к подавлению CD4⁺CD25⁺ регуляторными Т-клетками (например, в количестве, эффективном для сохранении такой чувствительности). В другом варианте осуществления антагонист GITR выбран из группы, состоящей из нейтрализующего антитела против GITRL, нейтрализующего антитела против GITR, слитого белка, содержащего GITR, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITR, низкомолекулярного антагониста, антисмысловой в отношении GITRL молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы нуклеиновой кислоты siРНК против GITRL. В другом варианте осуществления аутоиммунное нарушение или воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, энцефаломиелита, остеоартрита, рассеянного склероза, аутоиммунного гастрита, системной красной волчанки, псориаза и других воспалительных дерматозов, диабета I типа, астмы, аллергии и воспалительных заболеваний толстого кишечника, включая болезнь Крона и язвенный колит.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения субъекта при риске или поставленном диагнозе злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающему введение субъекту агониста GITR. В другом варианте осуществления способ включает введение агониста GITR, так что агонист GITR предоставляет костимуляторный сигнал эффекторным Т-клеткам у субъекта и делает их менее чувствительными к подавлению CD4⁺CD25⁺ регуляторными T-клетками субъекта (например, в количестве, эффективном для предоставления такого сигнала). В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL, активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, и агонистического в отношении GITR антитела.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции пролиферации популяции клеток, содержащей эффекторные T-клетки, включающему введение в клеточную популяцию агониста GITR. В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL, активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, и агонистического в отношении GITR антитела. В другом варианте осуществления эффекторные T-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования пролиферации популяции клеток, содержащей эффекторные T-клетки, включающему введение в клеточную популяцию антагониста GITR. В другом варианте осуществления антагонист GITR выбран из группы, состоящей из нейтрализующего антитела против GITRL, нейтрализующего антитела против GITR, слитого белка, содержащего GITR, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITR, низкомолекулярного антагониста, антисмысловой в отношении GITRL молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы нуклеиновой кислоты siРНК против GITRL. В другом варианте осуществления эффекторные T-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки. В другом варианте осуществления антагонист GITR представляет собой 5F1 или 10F12.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования или блокирования супрессии клеточной популяции, содержащей эффекторные Т-клетки, в присутствии CD4⁺CD25⁺ регуляторных Т-клеток, включающему введение в клеточную популяцию агониста GITR. В другом варианте осуществления способ включает введение агониста GITR, так что агонист GITR предоставляет костимуляторный сигнал эффекторным Т-клеткам у субъекте и делает их менее чувствительными к подавлению CD4⁺CD25⁺ регуляторными T-клетками субъекта (например, в количестве, эффективном для предоставления такого сигнала). В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL, активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, и агонистического в отношении GITR антитела. В другом варианте осуществления эффекторные T-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу супрессии клеточной популяции, содержащей эффекторные T-клетки, в присутствии CD4⁺CD25⁺ регуляторных T-клеток, включающему введение в клеточную популяцию антагониста GITR. В другом варианте осуществления способ включает введение антагониста GITR, так что поддерживается чувствительность эффекторных T-клеток к подавлению CD4⁺CD25⁺ регуляторными T-клетками (например, в количестве, эффективном для поддержания такой чувствительности). В другом варианте осуществления антагонист GITR выбран из группы, состоящей из нейтрализующего антитела против GITRL, нейтрализующего антитела против GITR, слитого белка, содержащего GITR, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITR, низкомолекулярного антагониста, антисмысловой в отношении GITRL молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы нуклеиновой кислоты siРНК против GITRL. В другом варианте осуществления эффекторные T-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки. В другом варианте осуществления антагонист GITR представляет собой 5F1 или 10F12.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку данной популяции клеток выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 или ее фрагменту, где экспрессия данной молекулы нуклеиновой кислоты приводит к сниженной продукции GITRL. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку популяции клеток антисмысловым олигонуклеотидом, комплементарным мРНК, соответствующей молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 или ее фрагмент, где олигонуклеотид ингибирует экспрессию GITRL.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку популяции клеток молекулой siРНК, направленной на мРНК, соответствующую молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку популяции клеток молекулой siРНК, направленной на мРНК, соответствующую выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку популяции клеток антисмысловым нуклеотидом против молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей GITRL. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку популяции клеток молекулой siРНА, направленной против мРНК, кодирующей GITRL.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу индукции экспрессии GITRL в популяции клеток, включающему обработку популяции клеток путем трансформации или трансфекции популяции клеток выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, или выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент, который кодирует активный фрагмент белка, где данная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии.

В другом варианте осуществления изобретение относится к популяции эффекторных Т-клеток, контактировавших in vitro или ex vivo с агонистом GITR. В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL или активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, низкомолекулярного агониста и агонистического в отношении GITR антитела. В другом варианте осуществления эффекторные Т-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения у субъекта злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, причем данный способ включает стадии получения популяции эффекторных T-клеток, обработки данной популяции агонистом GITR и введения обработанной популяции субъекту, пораженному злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием. В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL, активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, низкомолекулярного агониста и агонистического в отношении GITR антитела. В другом варианте осуществления субъект подвержен злокачественной опухоли, и обработанную популяцию используют в качестве противоопухолевой вакцины.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей агонист GITR и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL, активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, низкомолекулярного агониста и агонистического в отношении GITR антитела.

В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антагонист GITR и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления антагонист GITR выбран из группы, состоящей из нейтрализующего антитела против GITRL, нейтрализующего антитела против GITR, слитого белка, содержащего GITR, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITR, низкомолекулярного антагониста, антисмысловой в отношении GITRL молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы нуклеиновой кислоты siРНК против GITRL. В другом варианте осуществления антитело содержит антигенсвязывающие фрагменты 5F1 или 10F12.

В другом варианте осуществления изобретение относится к вакцинному адъюванту, содержащему агонист GITR и антиген, выбранный из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, антигена грибов, паразитарного антигена, ракового антигена, ассоциированного с опухолью антигена или их фрагментов. В другом варианте осуществления агонист GITR выбран из группы, состоящей из GITRL, активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITRL, низкомолекулярного агониста и агонистического в отношении GITR антитела.

В другом варианте осуществления изобретение относится к вакцинному адъюванту, содержащему антагонист GITR и антиген, выбранный из группы, состоящей из аутоантигена, белка амилоидного пептида, аллоантигена, антигена трансплантата, аллергена и их фрагментов. В другом варианте осуществления антагонист GITR выбран из группы, состоящей из нейтрализующего антитела против GITRL, нейтрализующего антитела против GITR, слитого белка, содержащего GITR, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITR, низкомолекулярного антагониста, антисмысловой в отношении GITRL молекулы нуклеиновой кислоты и молекулы нуклеиновой кислоты siРНК против GITRL. В другом варианте осуществления антитело содержит антигенсвязывающие фрагменты 5F1 или 10F12.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу скрининга тестируемых соединений на способность нейтрализовать активность GITRL, включающему стадии контакта с данным соединением образца, содержащего GITRL и нейтрализующее антитело, и определения того, снижается ли взаимодействие GITRL с нейтрализующим антителом в образце относительно взаимодействия GITRL с нейтрализующим антителом в образце, не контактировавшем с данным соединением, причем снижение взаимодействия GITRL с нейтрализующим антителом в образце, контактировавшем с соединением, идентифицирует соединение как то, которое ингибирует или блокирует взаимодействие GITRL с нейтрализующим антителом. В другом варианте осуществления антитело представляет собой 5F1 или 10F12.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу предоставления костимуляторного сигнала популяции клеток, содержащей эффекторные Т-клетки, причем данный способ включает введение агониста GITR. В другом варианте осуществления агонист GITR представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из GITRL или активного фрагмента GITRL, слитого белка, содержащего GITRL, слитого белка, содержащего активный фрагмент GITR, и агонистического антитела против GITR. В другом варианте осуществления эффекторные Т-клетки представляют собой CD4⁺ T-клетки или CD8⁺ T-клетки.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показано выравнивание (основанное на матрице аминокислотных замен BLOSUM62; см. Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19) аминокислотных последователь