Fc-эритропоэтин слитый белок с улучшенной фармакокинетикой
Патент 2370276
Авторы
- ДЖИЛИС Стивен Д. (US)
- КРЕСС Дороте (DE)
- ЛОДЕР Скотт (US)
- МАЛЕР Ханс-Кристиан (DE)
- МЮЛЛЕР Роберт (DE)
Правообладатели
Классы МПК
- A61K38 - Лекарственные препараты, содержащие пептиды (пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца A61K 31/00; циклические дипептиды, не имеющие в молекуле какой-либо другой пептидной связи кроме формирующей их ядро, наприме
- A61P7 - лекарственные средства для лечения нарушений состояния крови или внеклеточной жидкости
- A61K39/385 - гаптены или антигены, связанные с носителями
- C07K14/505 - эритропоэтин (ЭПО)
- C12N15/62 - ДНК последовательности, кодирующие белки при слиянии
Fc-эритропоэтин слитый белок с улучшенной фармакокинетикой
Иллюстрации
Изобретение относится к области медицины и касается Fc-эритропоэтин слитого белка с улучшенной фармакокинетикой. Сущность изобретения включает новые сиалилированные Fc-EPO слитые белки, предпочтительно включающие пару модификаций в Fc-части, а также в ЕРО части, которые имеют улучшенную фармакокинетику. В частности, Fc-EPO белки обладают длительным периодом полураспада в сыворотке крови и повышенной эффективностью in vivo. Fc-EPO слитые белки, синтезированные в клетках ВНК, обладают значительно более продолжительными периодами полураспада в сыворотке крови и повышенной эффективностью in vivo по сравнению с соответствующими Fc-EPO слитыми белками, полученными в других линиях клеток, таких как, например, клетки NS/0. Преимущество изобретения заключается в улучшении фармакокинетических свойств эритропоэтина. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 табл., 11 ил.
Реферат
Текст описания приведен в факсимильном виде.
1. Очищенный высоко сиалилированный димерный слитый белок, который существенно состоит из димерной Fc части, содержащей CH2 и CH3 домен IgG2 человека, шарнирный участок IgG человека, и человеческого эритропоэтина (ЕРО), где каждая цепь димерной Fc части является связанной посредством своего С-терминального конца непосредственно или с помощью линкерного пептида с N-терминальным концом молекулы ЕРО, при этом слитый белок обладает следующими свойствами:(i) молекула ЕРО включает 15-28 остатков сиаловой кислоты;(ii) участок Gln-Phe-Asn-Ser последовательности заменен Gln-Ala-Gln-Ser в пределах СН2 домена указанного IgG2, и(iii) аминокислотная последовательность участка Leu-Ser-Leu-Ser вблизи С-терминального конца СН3 домена указанного IgG2 заменена Ala-Thr-Ala-Thr.
2. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором дополнительно C-терминальный остаток Lys СН3 домена заменен Ala.
3. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором шарнирный участок имеет происхождение от IgG1 человека.
4. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.3, в котором указанный шарнирный участок IgG1 является модифицированным путем замены аминокислотного остатка Cys в пределах последовательности Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys шарнирного участка остатком Ser, образуя, таким образом, последовательность Pro-Lys-Ser-Ser-Asp-Lys в пределах шарнирного участка.
5. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором эритропоэтиновая часть включает, по крайней мере, одну из следующих аминокислотных замен:(i) остаток, отличный от цистеина, в положении 29 молекулы ЕРО,(ii) остаток, отличный от цистеина, в положении 33 молекулы ЕРО,(iii) остаток цистеина в положении 88 молекулы ЕРО и(iv) остаток цистеина в положении 139 молекулы ЕРО.
6. Димерный Fc-ЕРО слитый белок по п.5, в котором аминокислотный остаток, отличный от Cys, находится в положении 33 молекулы ЕРО вместо исходного остатка Cys, а остаток Cys находится в положении 88 молекулы ЕРО вместо исходного остатка Trp, что позволяет, таким образом, ЕРО части в пределах слитого белка образовывать Cys29-Cys88 дисульфидную связь.
7. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.6, в котором аминокислотный остаток, отличный от Cys, находящийся в положении 33, представляет собой Pro.
8. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором ЕРО часть включает одну или более мутаций, выбранных из группы:(i) Arg131→Glu131 (ii) Arg139→Glu139 (iii) His32→Gly32 (iv) Ser34→Arg34 (v) Pro90→Ala90.
9. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором линкерный пептид включает сайт гликозилирования.
10. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.9, в котором сайт гликозилирования включает аминокислотную последовательность Asn-Ala-Thr.
11. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором полная молекула IgG, включая шарнирный участок, имеет происхождение от IgG2.
12. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, который дополнительно включает СН1 домен.
13. Димерный Fc-EPO слитый белок по п.1, в котором слитый белок содержит 20-22 остатка сиаловой кислоты.
14. Димерный Fc-ЕРО слитый белок по п.1, включающий последовательность:EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLPPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTPRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE3STNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 14).
15. Димерный Fc-ЕРО слитый белок по п.1, включающий последовательность:EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLPPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQAQSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSATATPGAAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLWSSQPCEALQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR (SEQ ID NO: 15).
16. Молекула ДНК, кодирующая слитый белок по п.1.
17. Фармацевтическая композиция, приемлемая для лечения расстройств гематопоэза или гематопоэтической недостаточности у млекопитающего, включающая эффективное количество Fc-EPO слитого белка, охарактеризованного в п.1, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
18. Популяция очищенных высоко сиалилированных Fc-EPO слитых белков по п.1, приемлемых для введения млекопитающему, которую получают путем введения молекулы ДНК, кодирующей соответствующий Fc-EPO слитый белок, в клетку ВНК, экспрессии, изоляции и очистки популяции соответствующих Fc-EPO слитых белков, где указанная популяция имеет более длительный период полураспада в сыворотке крови по сравнению с популяцией соответствующих Fc-EPO слитых белков, синтезированных в клетках NS/0, PerC6 или 293.
19. Популяция очищенных Fc-EPO слитых белков по п.18, где указанная популяция слитых белков содержит в среднем 20-22 остатков сиаловой кислоты на очищенный Fc-EPO слитый белок.
20. Популяция очищенных Fc-EPO слитых белков по п.18 или 19, где ВНК клетка является адаптированной для роста в среде, не содержащей белка, или в суспензии.
21. Способ получения популяции высоко сиалилированных очищенных рекомбинантных Fc-EPO слитых белков по п.1, причем указанный способ включает следующие этапы:(i) конструирование молекулы ДНК, кодирующей соответствующий Fc-EPO слитый белок;(ii) трансформацию ВНК клетки с помощью указанной молекулы ДНК в среде, не содержащей белка, или в суспензии;(iii) экспрессию популяции Fc-слитых белков, кодируемых указанной молекулой ДНК,(iv) сбор, изоляцию и очистку указанной популяции Fc-EPO слитых белков.
22. Способ по п.21, в котором указанная синтезированная популяция слитых белков содержит в среднем 15-28 остатков сиаловой кислоты на очищенный Fc-EPO слитый белок.
23. Способ по п.21, в котором указанная синтезированная популяция слитых белков содержит в среднем 20-22 остатков сиаловой кислоты на очищенный Fc-EPO слитый белок.