Способ получения композиции, содержащей высушенные бактерии, и ее применение

Способ получения композиции, содержащей высушенные бактерии, и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения содержащей высушенные микроорганизмы композиции, который приводит к повышенной жизнеспособности микроорганизма, и к применению композиций высушенного микроорганизма, получаемых улучшенным способом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В сельском хозяйстве известно использование инокулятов, содержащих определенные типы микроорганизмов. Как правило, инокуляты наносят на семена или другой репродуктивный материал растения таким образом, что при посеве или посадке можно получать улучшенную окружающую среду, способствующую прорастанию семени, стимулированию роста растения или биологической защите семени и получающегося в результате растения.

Например, симбиотические бактерии, такие как бактерии родов Rhizobium и Bradyrhizobium, обеспечивающие фиксацию азота в бобовых растениях, можно использовать для инокуляции бобовых растений для способствования образованию клубеньков. Инокуляцию можно выполнять нанесением покрытия на семена, опылением в хозяйстве семян или сельскохозяйственных культур или помещением инокулята в борозды во время посадки.

Предыдущие способы получения инокулята предусматривали смешивание активной живой культуры микроорганизмов, такой как культура клубеньковых бактерий, с носителем, таким как гумус или торф. Влажный носитель поддерживает микроорганизм в активном состоянии. Однако срок хранения такой активной бактериальной культуры является коротким вследствие истощения в окружающей среде пищи и влаги.

Другой способ получения инокулятов представляет собой перевод бактерий в состояние покоя, например лиофилизацией бактерий. Этот процесс необходимо проводить быстро для предотвращения разрушения клетки.

Другой способ получения сухого инокулята в состоянии покоя описан в патенте США 5695541, где способ предусматривает культивирование различных видов микроорганизмов в среде для роста и смешивание культуры с носителем из глины с последующей медленной сушкой смеси воздухом в течение по крайней мере одних суток таким образом, что уровень влажности в микроорганизмах постепенно снижается, образуя высушенную композицию. Как указано, высушенные композиции обладают лучшей жизнеспособностью по сравнению с другими способами получения сухого инокулята в состоянии покоя.

Было описано, что импульсные электромагнитные поля (PEMF) стимулируют биологические ткани, в том числе микроорганизмы (см. патент США 6561968). В патенте США 6561968 было сделано предположение, что выживаемость микроорганизмов, таких как бактерии, в ходе сушки можно улучшать посредством обработки PEMF. Однако в патенте США 6561968 было сделано предположение, что обработка PEMF эффективна только в отношении частично высушенных микроорганизмов, т.е. микроорганизмов, которые частично высушены, но еще содержат в своем составе приблизительно 20% воды. Иначе говоря, в патенте США 6561968 описано использование обработки PEMF только для микроорганизмов, которые следует поддерживать в активном состоянии (например, при содержании воды, составляющем 20%, активность воды (A_w) еще находится на уровне (приблизительно от 1 до 0,95), при котором бактериальная популяция существует в активном состоянии в противоположность состоянию покоя). Кроме того, в патенте США 6561968 описана обработка PEMF, позволяющая бактериям лишь лучше выдерживать процедуру сушки (т.е. исходная выживаемость бактерий). Об эффекте на длительность срока хранения частично высушенных микроорганизмов не сообщено.

Сниженная выживаемость и, в особенности, сниженный срок хранения высушенных микроорганизмов, особенно при содержании воды в высушенном микроорганизме приблизительно от 1% до приблизительно 6% мас./мас., является важной проблемой.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что сочетание смешивания культуры микроорганизма с носителем и обработки импульсными электромагнитными полями (PEMF) значительно повышает срок хранения высушенных микроорганизмов. Иначе говоря, обрабатываемый по настоящему изобретению микроорганизм остается живым в высушенном состоянии в течение значительно более долгого периода времени по сравнению с микроорганизмами, просто высушенными на носителе, или по сравнению с микроорганизмами, обрабатываемыми только PEMF. Наблюдаемые различия являются синергичными.

Таким образом, в широком смысле настоящее изобретение относится к применению сочетания смешивания культуры микроорганизма с носителем и обработки импульсными электромагнитными полями (PEMF) в получении композиции, содержащей высушенные микроорганизмы. Получаемые в результате микроорганизмы имеют значительно увеличенный срок хранения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения содержащей высушенные микроорганизмы композиции, предусматривающему культивирование одного или нескольких видов микроорганизмов; смешивание культивируемого микроорганизма с одним или несколькими носителями; обработку микроорганизма импульсными электромагнитными полями; инкубацию смеси культура:носитель в течение по крайней мере приблизительно 6 часов; и сушку микроорганизма таким образом, чтобы снизить уровень влажности до величины приблизительно от 1% мас. до приблизительно 6% мас.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к содержащей высушенные микроорганизмы композиции, которую получают процессом по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению высушенного микроорганизма для получения семени растения или другого репродуктивного материала растения с нанесенным покрытием, где применение предусматривает нанесение на семя растения или другой репродуктивный материал растения композиции, содержащей высушенные микроорганизмы, которые получают процессом по настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению высушенного микроорганизма для получения среды для роста, предусматривающему смешивание с почвой композиции, которая содержит высушенные микроорганизмы, получаемые процессом по настоящему изобретению.

В еще одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению высушенного микроорганизма для очистки сточных вод, предусматривающему контакт со сточными водами композиции, которая содержит высушенные микроорганизмы, получаемые способом по настоящему изобретению, и отделение очищенной воды от композиции.

Получаемый способом по настоящему изобретению высушенный микроорганизм обладает одним или несколькими следующими свойствами: улучшенной исходной выживаемостью и повышенным сроком хранения по сравнению с микроорганизмом, получаемым только с носителем, и/или микроорганизмом, получаемым только обработкой PEMF.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к высушенному микроорганизму с улучшенной исходной выживаемостью и/или повышенным сроком хранения в сравнении с микроорганизмом, получаемым только с носителем, и/или микроорганизмом, получаемым только обработкой PEMF; к композициям, содержащим указанный высушенный микроорганизм; и к вариантам их применения, в том числе, например, в получении семян растения и/или другого репродуктивного материала с нанесенным покрытием, в получении среды для роста и в очистке сточных вод.

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ

Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для сушки любого микроорганизма, способного выживать в высушенном состоянии.

Предпочтительно, микроорганизм находится в фазе покоя. Соответственно, микроорганизм может находиться в высушенном или обезвоженном состоянии.

Предпочтительно, настоящее изобретение используют для сушки полезных микроорганизмов, для применения в сельскохозяйственной промышленности. Особый интерес представляют собой микроорганизмы, обладающие биоцидными свойствами, такими как противогрибковые или пестицидные и другие свойства, а также поддерживающие рост микроорганизмы, способные, например, жить в почве в присутствии растения, которое надлежит защищать.

Соответственно, микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой один или несколько грибов, в том числе дрожжей, бактерий, водорослей или простейших.

Соответственно, микроорганизм может представлять собой известный биоцидный микроорганизм, в том числе грибы Trichoderma и Gliocladium.

Предпочтительно, микроорганизм представляет собой бактерию, гриб или дрожжи.

Предпочтительно, в одном из аспектов микроорганизм представляет собой бактерию.

Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления микроорганизм представляет собой дрожжи одного или нескольких следующих родов Candida, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Hansenula, Kluyveromyces, Leucosporidium, Metschnikowia, Pichia, Rhodosporidium, Rodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Richosporon.

Предпочтительно, в другом варианте осуществления микроорганизм представляет собой гриб одного или нескольких следующих родов Acrophialospora, Ampelomyces, Aureobasidium, Bipolaris, Chaetomium, Cladorrhinum, Clonostachys, Coniothyrium, Epicoccum, Gliocladium, Glomus, Fusarium, Laetisaria, Microsphaeropsis, Mycothecium, Muscador, Mycoleptodiscus, Neocosmospora, Paecilomyces, Penicillium, Peniophora, Phlebiopsis, Phialophora, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Rhynchosporium, Sporidesmium, Stephanonectria, Talaromyces, Tilletiopsis, Trichoderma, Ulocladium, Verticillium, Hirsutella, Myrothecium, Nematophthora, Dactylella, Acremonium, Catenaria, Cylindrocarpon, Dactylella, Monacrosporium, Pochonia.

Соответственно, гриб может представлять собой один или несколько из следующих: Acremonium strictum, Caternaria auxiliaris, Cylindrocarpon destructans, Dactylella oviparasitica, Hirsutella rhossiliensis, Monacrosporium ellipsosporum, Monacrosporium cionopagum, Nematophthora gynophila, Paecilomyces marquandii, Pochonia chlamydosporium, Clonostachys rosea, Coniothyrium minitans, Epicoccum nigrum, Eppicoccum purpurascens, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium tabacinum, Fusarium solani, Gliocladium atrum, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium virens, Glomus claroideum, Glomus fasciculatum, Glomus intraradices, Glomus mossae, Laetisaria arvalis, Microsphaeropsis ochracea, Muscador albus, Mycoleptodiscus terrestris, Mycothecium verrucaria, Necosmospora vasinfecta, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus, Penicillium frequentans, Penicillium godlewskii, Penicillium nigricans, Penicillium oxalicum, Peniophora gigantea, Phialophora sp. I-52, Phlebiopsis gigantea, Pythium acanthicum, Pythium acanthophoron, Pythium mycoparasiticum, Pythium nunn, Pythium oligandrum, Pythium periplocum, Rhizoctonia solani, Rhynchosporium alismatis, Rhizopus stolonifer, Sporidesmium sclerotivorum, Stephanonectria keitii, Talaromyces flavus, Tilletiopsis sp., Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride, Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum, Trichoderma inhatum, Trichoderma koningii, Trichoderma lignorum, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma stromaticum, Trichoderma viride, Ulocladium atrum, Verticilium chlamydosporium, Verticillium dahliae, Verticillium suchlasporium.

Предпочтительно, в еще одном варианте осуществления микроорганизм представляет собой бактерию одного или нескольких следующих родов: Actinoplanes, Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacillus, Burkholderia, Chryseomonas, Comamonas, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pantoea, Pasteuria, Paenibacillus, Pseudomonas, Rahnella, Raoultella, Serratia, Sporotrix, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Rhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium Seratia, Erwinia, Streptomycetes и Nocardia.

Предпочтительно, бактерия представляет собой неспорообразующую бактерию, выбранную из группы, которая состоит из Actinoplanes, Agrobacterium, Arthrobacter, Bifidobacterium, Brevibacillus, Burkholderia, Chryseomonas, Comamonas, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pantoea, Pediococcus, Pseudomonas, Rahnella, Raoultella, Serratia, Sporotrix, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Rhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium Seratia, Erwinia, Streptomycetes и Nocardia.

Соответственно, бактерия может представлять собой одну или несколько из следующих: Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, Arthrobacter simplex, Bacillus chitinosporus, Bacillus licheniformis, Bacillus amylofaciens, Bacillus cereus, Bacillus lentimorbus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus popilliae, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Brevibacillus brevis, Burkholderia cepacia, Chryseomonas luteola, Comamonas acidovorans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecium, Erwinia herbicola, Flavobacterium balustinum, Flavobacterium heparinum, Flavobacterium psycrophilium, Flavobacterium columnae, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus grayii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus sake, Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas aptata, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolaasii, Rahnella aqualis, Raoultella terrigena, Serratia marcescens, Serratia plymuthica, Sporotrix flocculosa, Stenotrophomonas malthophilia, Streptoccus lactis, Streptococcus salivarius, Streptococcus thermophilus, Streptomyces griseoviridis.

Соответственно, микроорганизм может представлять собой бактерию рода Pseudomonas. Соответственно, микроорганизм может представлять собой бактерию Pseudomonas fluorenscens. Соответственно, микроорганизм может представлять собой бактерию Pseudomonas fluorenscens, продуцирующую циклический липопептид.

Предпочтительно, микроорганизм культивируют в соответствующей культуральной среде. Соответственно, микроорганизм можно культивировать в среде для роста в общепринятом ферментере или флаконе. Соответственно, ферментер может представлять собой стационарный, полунепрерывный или непрерывный ферментер. Предпочтительно, микроорганизм культивируют, пока культура не достигнет стационарной фазы.

Соответственно, культуру и культуральную среду можно смешивать с носителем. Перед смешиванием с носителем культуру микроорганизма и/или культуральную среду можно разводить свежей или фильтрованной культуральной средой и/или дистиллированной водой. Предпочтительно, культуру микроорганизма разводят свежей или фильтрованной культуральной средой непосредственно перед смешиванием этой культуры с носителем.

Соответственно, смешивание можно выполнять непрерывным способом или отдельными порциями.

Предпочтительно, носитель находится в виде порошка или гранулята. Нахождение носителя в порошкообразном или гранулированном виде может зависеть от предполагаемого использования.

Соответственно, порошкообразный носитель может иметь средний диаметр частиц, например, приблизительно от 1 мкм до приблизительно 0,5 мм. Соответственно, гранулированный носитель может иметь средний диаметр частиц, например, приблизительно от 0,5 мм до приблизительно 3 мм.

В одном из вариантов осуществления предпочтительные носители представляют собой носители с большой площадью поверхности, предпочтительно, носители с площадью поверхности более чем 200 м²/грамм, предпочтительно, более чем 300 м²/грамм.

В другом варианте осуществления предпочтительные носители представляют собой носители с низким естественным содержанием воды (WC). Низкое естественное содержание воды является тем, что поддерживает бактерии в состоянии покоя. Предпочтительно, низкое естественное содержание воды представляет собой содержание воды 8,0% WC или ниже, предпочтительно, 7,5% WC или ниже, предпочтительно - приблизительно ниже 7% WC.

Соответственно, предпочтительные носители могут представлять собой носители с естественным содержанием воды в диапазоне от 3 до 7,5%. Это может быть особенно эффективно в вариантах применения, в которых смесь надлежит использовать, например, для нанесения покрытия на семена или другие репродуктивные материалы.

В одном из вариантов осуществления предпочтительный носитель представляет собой носитель, обладающий очень высоким естественным содержанием воды. Очень высокое естественное содержание воды является тем, что поддерживает бактерии в метаболическом состоянии. Как правило, очень высокое естественное содержание воды может составлять, например, >20%.

Естественное содержание воды в носителе представляет собой количество воды, которое связано с катионами или содержится в порах в природном цеолите или глине. Не желая ограничиваться теорией, цеолиты представляют собой гидратированные силикаты алюминия, что означает, что они содержат воду в своей основной структуре, т.е. структурная формула одного из клиноптилолитов представляет собой (Na,K,Ca)_2-3A₁₃(Al,Si)₂Si₁₃O₃₆-12H₂O, что является гидратированным силикатом натрия-калия-кальция-алюминия.

В рамках настоящей заявки “естественное содержание воды” означает количество воды, которое можно удалить из образца носителя в сушильном шкафу при 105°C в течение 4 часов. Во избежание недоразумений, в этом способе необязательно удаляют из носителя все молекулы воды.

Предпочтительно, носитель по настоящему изобретению имеет относительно постоянное содержание воды в течение времени. Постоянство содержания воды в носителе в течение времени определяет варианты применения, для которых носитель наиболее эффективен. Например, содержание влаги в клиноптилолите и бентоните относительно постоянно в течение времени. Таким образом, эти носители могут быть особенно эффективны для вариантов применения, где смесь культура:носитель можно повторно использовать после длительных периодов хранения, например такое содержание влаги может делать эти носители особенно эффективными для использования, например, в нанесении покрытия на семена или другие репродуктивные материалы. С другой стороны, некоторые носители могут иметь относительно менее постоянное содержание воды. Такое содержание воды может делать эти носители особенно эффективными для вариантов применения, в которых смесь культура:носитель используют только после короткого периода хранения в отсутствие продолжительного хранения.

Один из способов выявления относительного постоянства содержания влаги в носителе состоит в высушивании носителя до заданного % MC, а затем в измерении % MC в носителе через 30 суток после помещения носителя в контролируемую окружающую среду (т.е. при контролируемой температуре и/или относительной влажности). Потеря или прирост влажности указывает на неустойчивость носителя. Носитель, поддерживающий один и тот же % MC в течение периода 30 суток, считают очень устойчивым. Приобретаемое или теряемое носителем количество влаги, сравниваемое с количеством влаги, которое приобретает или теряет носитель в качестве положительного контроля (такой как бентонит или клиноптилолит), выявляет “относительную” устойчивость носителя. По настоящему изобретению бентонит и клиноптилолит рассматривают как устойчивые носители. Носитель, приобретающий больше влаги или теряющий больше влаги, чем бентонит или клиноптилолит, рассматривают как относительно менее устойчивый носитель.

Иначе говоря, носитель, имеющий содержание влаги, которое относительно постоянно в течение времени, можно рассматривать как носитель, способный к хорошей “буферизации” изменений влажности. Тогда как носитель, имеющий содержание влаги, которое относительно не постоянно в течение времени, можно рассматривать как носитель, не способный к буферизации изменений влажности. Соответственно, носитель по настоящему изобретению представляет собой носитель, способный к буферизации изменений влажности.

Соответственно, носитель может представлять собой один или несколько из следующих носителей: носитель из цеолита; носитель из глины; другие природные соединения кремния.

Цеолиты представляют собой микропористые кристаллические твердые вещества с четкими структурами. Как правило, они содержат в своем каркасе кремний, алюминий и кислород, а в своих порах содержат катионы, воду и/или другие молекулы (такие как, например, аммиак, ионы карбоната и ионы нитрата). Многие встречаются в природе в виде минералов. Другие являются синтетическими и их получают коммерческими. По настоящему изобретению можно использовать природные цеолиты и/или синтетические цеолиты.

Характерный признак цеолитов состоит в том, что они имеют структуры с трехмерным каркасом из связанных тетраэдров (Si,Al)O₄, где (Si,Al) и O присутствуют в соотношении 1:2. Этой трехмерной структурой, в которой атом кислорода химически уравновешен катионом, обусловлено отличие цеолитов от глинистых минералов.

Соответственно, носитель из цеолита может представлять собой один или несколько из следующих цеолитов: анальцит, канкринит, шабазит, клиноптилолит, кордиерит, эдингтонит, эрионит, фожазит, феррьерит, гмелинит, гейландит, ломонтит, левинит, мезолит, морденит, натролит, оффретит, паулингит, филлипсит, птилолит, сколецит, томсонит, ZSM и ZK.

Предпочтительно, в некоторых аспектах носитель из цеолита представляет собой клиноптилолит. Соответственно, используемый здесь клиноптилолит может представлять собой клиноптилолит-K, клиноптилолит-Ca или клиноптилолит-Na. Предпочтительно, используемый здесь клиноптилолит представляет собой клиноптилолит-Na. Соответственно, используемый здесь клиноптилолит может иметь естественное содержание воды 4,7-5,4%, предпочтительно - приблизительно 5%. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления клиноптилолит представляет собой продукт клиноптилолит-Na под названием Klinomin^TM, доступный в NorNatur, Denmark. Соответственно, используемый по настоящему изобретению клиноптилолит состоит из более чем 80% клиноптилолита. Соответственно, носитель может обладать величиной pH 6,9-7,1 и/или площадью поверхности 260-290 м²/г.

Глина представляет собой природный, исходно получаемый из почвы гидратированный силикат алюминия, который обладает физическими свойствами, обусловленными, по крайней мере частично, размером и распределением коллоидных частиц, а также свойствами, включающими в себя пластичность. Как правило, 30% или более частиц в глине имеют диаметр меньше 0,002 мм.

Соответственно, носитель из глины может представлять собой одну или несколько из следующих глин: аттапульгит, бентонит, фуллерова земля, галлуазит, иллит, каолин, пирофиллит, вермикулит, сепиолит, монтмориллонит и мулит.

Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления носитель может представлять собой бентонит. Бентонитом обозначают глины с хорошей способностью к увеличению в объеме и с различным содержанием монтмориллонита. Предпочтительно, главным компонентом бентонита является монтмориллонит, предпочтительно - монтмориллонит-Na. Один из приемлемых для использования по настоящему изобретению бентонитов содержит приблизительно 50% монтмориллонита, 10% каолинита, 10% иллита и 20% вермикулита. Такой бентонит доступен в виде OB-lergranulate из Tierra Products ApS, Denmark. Во избежание недоразумений, это бентонит, который указан в приведенном ниже экспериментальном разделе.

Предпочтительно, в другом варианте осуществления носитель представляет собой вермикулит.

Как понимает специалист в данной области, природная глина или вещества из цеолита необязательно являются чистыми. Поэтому в некоторых вариантах осуществления, когда авторы обозначают глину или цеолит таким названием, как например, клиноптилолит, это означает носитель, преимущественно состоящий из этой глины или цеолита (т.е. преимущественно состоящий, например, из клиноптилолита). Предпочтительно, глина или цеолит содержат более 50% указанной глины или цеолита (такого как, например, клиноптилолит), предпочтительно, более чем 60%, более предпочтительно, более чем 70%, более предпочтительно, более чем 80% указанной глины или цеолита. Соответственно, глина или цеолит могут содержать более чем 90% указанной глины или цеолита, или даже 100% указанной глины или цеолита.

Некоторые природные соединения кремния не относят к глинам или цеолитам. Такие природные соединения кремния включают в себя, например, одно или несколько из следующих: асбест, диаспор, диатомовая земля, диатомит, полевой шпат, трепел, кизельгур, слюда, кварц, песок и кремний.

Соответственно, в одном из аспектов носитель может представлять собой сочетание одного или нескольких носителей из глины с одним или несколькими носителями из цеолита.

Не желая ограничиваться теорией, предусматривают, что определенные виды микроорганизмов могут иметь предпочтительный носитель, т.е. могут лучше выживать в определенных носителях. После ознакомления специалиста в данной области с настоящим изобретением его обычные практические навыки легко позволят выявить предпочтительный носитель для любого предоставленного микроорганизма. Один из способов достижения этого состоит в проведении следующего анализа:

1. Определяют природное содержание воды в носителях посредством инкубирования носителей при 105°C в течение 4 часов.

2. Смешивают жидкую культуру микроорганизмов с различными носителями в соотношении 1:5.

3. Инкубируют в течение 1-2 суток для предоставления возможности роста бактерий.

4. Сушат смесь носителей до 1,5x, 1x, 0,75x (или большего количества величин) естественного содержания воды, определенного в (1), с последующим измельчением в тонкодисперсный порошок.

5. Инкубируют в течение >7 суток при комнатной температуре.

6. Подсчитывают CFU посредством посева на планшеты. Предпочтительные носители представляют собой носители, которые несут большие количества микроорганизмов в пределах заданного диапазона.

7. Необязательно, после определения набора предпочтительных носителей можно выявлять взаимосвязь WC и A_w. Предпочтительные носители представляют собой носители, у которых A_w не изменяется в течение времени в заданных условиях хранения (или изменяется лишь незначительно, т.е. изменения могут быть перенесены содержащимися микроорганизмами).

Следует отметить, что предпочтительные носители из глины/цеолита представляют собой носители с естественным содержанием воды, сходным с конечным содержанием влаги в смеси культура:носитель после сушки, как правило, в диапазоне от 3 до 7,5% (мас./мас.) в целях применения для семян, и/или представляют собой носители с относительно постоянным содержанием влаги в течение времени.

Предпочтительно, в другом варианте осуществления распределение микроорганизмов в носителе является равномерным. Равномерность распределения микроорганизмов в носителе можно определять посредством нанесения распылением носителя на поверхность и определения количества микроорганизмов на единицу площади.

Предпочтительно, культивируемый микроорганизм и носитель смешивают таким образом, что отношение культуры к носителю составляет приблизительно от 1:2 до приблизительно 1:6 (мас./мас.), предпочтительно - приблизительно от 1:3 до приблизительно 1:5 (мас./мас.), более предпочтительно, менее чем 1:4 (мас./мас.), такое как, например, 1:4,1, 1:4,2, 1:4,5, 1:4,75 или приблизительно 1:5.

Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления культивируемый микроорганизм и носитель смешивают таким образом, что отношение культуры к носителю составляет менее чем 1:5 (мас./мас.).

Не желая ограничиваться теорией, было неожиданно открыто, что чем ниже соотношение культуры микроорганизма и носителя, тем выше количество жизнеспособных, пригодных к культивированию клеток (колониеобразующих единиц (CFU) в высушенном носителе). Было открыто, что культивируемый микроорганизм и носитель, предпочтительно, смешивают таким образом, что соотношение культуры и носителя составляет менее чем 1:4 (мас./мас.), соответственно, например, менее чем 1:4,1, 1:4,2, 1:4,5, 1:4,75 или 1:5.

Соответственно, для получения обычного препарата носителя можно проводить следующие стадии способа: клетки микроорганизмов можно смешивать с носителем в соотношении клетки микроорганизмов:носитель, составляющем менее чем 1:4 (мас./мас.), соответственно, например, менее чем 1:4,1, 1:4,2, 1:4,5, 1:4,75 или 1:5; смесь можно помещать на 7 суток на 10°C, а затем смесь можно сушить до содержания воды, составляющего 5% или менее, в течение периода от 3 до 4 суток в контролируемой атмосфере при влажности 32,5-35%.

Соответственно, концентрация микроорганизма (например, бактерий) в культуре микроорганизма непосредственно перед смешиванием с носителем составляет приблизительно 10⁷-10⁹ микроорганизмов/мл культуральной среды, предпочтительно, приблизительно 10⁸ микроорганизмов/мл культуральной среды.

Соответственно, если носитель сухой (т.е. с содержанием воды 0%), например, после стерилизации в сушильном шкафу, то перед смешиванием культивируемого микроорганизма с носителем можно добавлять небольшую порцию воды и/или культуральной среды. Соответственно, воду и/или культуральную среду добавляют до тех пор, пока содержание влаги в носителе не станет таким, какое считают естественным для этого носителя. Добавление воды и/или культуральной среды предотвращает повреждение клетки вследствие выделения тепла в ходе смешивания. Если считают необходимым, то захваченный носителем воздух можно удалять под вакуумом.

Предпочтительно, после смешивания смеси культура:носитель смесь инкубируют в течение приблизительно более чем 6 часов, предпочтительно, приблизительно более чем 8 часов, предпочтительно, более чем 12 часов, предпочтительно, приблизительно более чем 18 часов, предпочтительно, от 0,5 до 14 суток. Наиболее предпочтительно, смесь культура:носитель инкубируют в течение приблизительно более чем 12 часов. Соответственно, смесь культура:носитель инкубируют в течение приблизительно от 12 часов до приблизительно 14 суток.

Соответственно, после смешивания смесь культура:носитель можно инкубировать при 5-30°C, предпочтительно, при 10-15°C, в течение приблизительно от 0 до приблизительно 14 суток, предпочтительно, при от 0,5 до приблизительно 14 суток. В ходе инкубации микроорганизмам позволяют расти и размножаться. Предпочтительно, если смесь культура:носитель инкубируют в течение более чем одних суток, то снижения влажности в ходе этого периода инкубации не происходит.

Соответственно, обработку импульсным электромагнитным полем (PEMF) можно проводить в ходе процесса в любое время. Например, обработку PEMF можно проводить на одной или нескольких следующих стадиях: в ходе культивирования микроорганизма; в ходе смешивания культивируемого микроорганизма с носителем; после смешивания культивируемого микроорганизма с носителем; в течение (необязательной) инкубации смеси культура:носитель; в течение высушивания смеси культура:носитель; в течение хранения высушенной смеси культура:носитель; после нанесения на семена или компоненты семян; в любое время после высушивания смеси культура:носитель; в любое время после повторной гидратации высушенной смеси культура:носитель.

Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления обработку PEMF проводят в ходе культивирования микроорганизмов.

Соответственно, в другом варианте осуществления обработку PEMF проводят в ходе культивирования микроорганизмов и, необязательно, повторяют в ходе инкубации смеси культура:носитель.

Соответственно, можно проводить более чем одну обработку PEMF. В одном из вариантов осуществления можно проводить более чем две обработки PEMF.

В одном из вариантов осуществления микроорганизмы можно культивировать в непрерывном ферментере и можно подвергать обработке PEMF в одном участке ферментера перед дальнейшей обработкой всей или некоторой части культуры, необязательно, при повторном обороте части культуры в ферментере. Как правило, микроорганизмы можно подвергать воздействию PEMF во время прохождения через трубопровод (такой как труба, приемлемо, извитая труба) из ферментера.

Соответственно, каждую обработку PEMF можно проводить приблизительно от 0,5 часов до приблизительно 48 часов, предпочтительно, приблизительно от 4 часов до приблизительно 24 часов, предпочтительно, приблизительно от 8 часов до приблизительно 16 часов.

Предпочтительно, в одном из аспектов бактериальную культуру обрабатывают PEMF в течение 1-6 часов непосредственно перед смешиванием бактериальной культуры с носителем.

Однако предусматривают, что каждая обработка PEMF может состоять из нескольких обработок PEMF, где продолжительность каждой обработки составляет несколько минут (т.е. 1-20 минут, предпочтительно, 1-10 минут, более предпочтительно, 1-5 минут). Соответственно, микроорганизмы можно подвергать более чем одной обработке, предпочтительно, более чем двум, предпочтительно, более чем трем, предпочтительно, более чем четырем, предпочтительно, более чем пяти, предпочтительно, более чем шести, предпочтительно, более чем семи, предпочтительно, более чем восьми, предпочтительно, более чем девяти или предпочтительно, более чем десяти обработкам.

Как понимает специалист в данной области, в процессе по настоящему изобретению можно использовать любое устройство, служащее источником импульсных электромагнитных полей (PEMF).

Одно из таких устройств описано в США 6561968 (приведенном здесь полностью в качестве ссылки). Устройство в США 6561968 содержит множество электропроводящих витков, каждый с центральной осью, где каждая центральная ось направлена в микроорганизмы; и генератор импульсов, функционально связанный с каждым витком для обеспечения серий импульсов тока для проведения по каждому витку, где серии импульсов предназначены для возбуждения в каждом витке периодического переменного магнитного поля для индукции электрического поля. В устройстве из США 6561968 содержится несколько пар витков, где каждая пара витков включает в себя первый виток и прилегающий второй виток. В случае заданного импульса, обеспечиваемого генератором импульсов, магнитное поле в центре первого витка направлено к микроорганизмам, а магнитное поле в центре второго витка направлено от микроорганизмов.

Центральная ось витка представляет собой ось симметрии, обычно направленную вдоль центральной оси цилиндрического витка или перпендикулярно (при центральном расположении) плоскости плоского витка.

Поскольку устройство PEMF может выделять тепло, то предусматривают, что устройство может дополнительно содержать охлаждающее устройство.

Электромагнитные поля импульсного типа (PEMF) представляют собой наиболее часто используемый вид электромагнитной терапии, особенно для срастания костей, лечения артритов и при повреждениях в спорте и от повторяющихся нагрузок. Сообщали о множестве различных коммерческих видах устройства PEMF для использования в здравоохранении. Например, лишь одними из таких устройств PEMF являются устройства Curatron 2000-series; Wavetek; Bi Osteogen. Специалист в данной области легко узнает о других устройствах PEMF. Предусматривают, что по настоящему изобретению можно использовать любое из этих устройств.

Предпочтительно, микроорганизм сушат до содержания влаги, близкого к естественному содержанию влаги в носителе, которое, как правило, составляет приблизительно от 3 до приблизительно 6% (мас./мас.).

Предпочтительно, смесь культура микроорганизма:носитель сушат. Соответственно, смесь культура микроорганизма:носитель сушат до содержания влаги, близкого к естественному содержанию влаги в носителе, которое составляет приблизительно от 1% мас. до приблизительно 7% мас., предпочтительно, приблизительно от 3% мас. до приблизительно 6% мас.

Не желая ограничиваться теорией, было неожиданно открыто, что обработка PEMF клеток в носителе с менее чем 6% мас. воды, т.е. где A_w (активность воды) составляет приблизительно менее чем 0,7, приемлемо, приблизительно менее чем 0,5, значительно повышает срок хранения микроорганизма (особенно бактерий). Было открыто, что срок хранения можно увеличивать, например, до более чем, например, 1 года.

Активность воды (A_w) указывает на относительную доступность воды для бактерий в смеси. Активность воды, составляющая 1 или близкая к ней, указывает на то, что бактерии находятся в активном состоянии, а не в покое; тогда как активность воды менее чем 0,9, предпочтительно, приблизительно менее чем 0,7, означает, что микроорганизм находится в покое. Сходным образом, активность воды приблизительно от 0,4 до 0,6 означает, что бактерии находятся в покое. Предпочтительно, по настоящему изобретению активность воды в