Анализ нейтрализующих антител и его применение

Анализ нейтрализующих антител и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная не предварительная заявка претендует в соответствии со статьей 35 USC § 119 на приоритет по предварительной заявке № 60/490,678, поданной 29 июля 2003, полное описание которой включено в данное описание путем ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к анализу для обнаружения нейтрализующих антител против антитела или антагониста и применению указанного анализа.

Предшествующий уровень техники

Лимфоциты представляют собой один из множества типов белых кровяных клеток, продуцируемых костным мозгом в процессе гематопоэза. Существуют две основные популяции лимфоцитов: В-лимфоциты (В-клетки) и Т-лимфоциты (Т-клетки). В данном случае особый интерес представляют В-клетки.

В-клетки созревают в костном мозге и покидают его, экспрессируя на своей клеточной поверхности антиген-связывающее антитело. Когда простая В-клетка впервые встречается с антигеном, в отношении которого ее мембрано-связанное антитело является специфическим, клетка начинает быстро делиться, и продукты ее деления дифференцируются в В-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые «плазматическими клетками» (плазмоциты). В-клетки памяти имеют более продолжительный период жизни и продолжают экспрессировать мембрано-связанное антитело той же специфичности, что и первоначальная исходная клетка. Плазматические клетки не продуцируют мембрано-связанное антитело, но вместо этого продуцируют антитело в такой форме, которая может быть секретирована. Секретируемые антитела являются основными эффекторными молекулами гуморального иммунитета.

Антиген CD20 (также называемый В-лимфоцит-ограниченным дифференцировочным антигеном человека, Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой приблизительно в 35 кДа, расположенный на предшественниках В-клеток и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al., J.Biol.Chem., 264(19): 11282-11287 (1989); и Einfeld et al., EMBO J. 7(3): 711-717 (1988)). Этот антиген экспрессируется также более чем на 90% В-клеточных неходжкинских лимфом (NHL) (Anderson et al., Blood 63(6): 1424-1433 (1984)), но он не обнаружен на гематопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, обычных плазматических клетках или других обычных тканях (Tedder et al., J.Immunol., 135(2): 973-979 (1985)). CD20 регулирует раннюю(ие) стадию(ии) процесса активации для инициирования и дифференцировки клеточного цикла (Tedder et al., см.выше) и, возможно, функционирует в качестве канала иона кальция (Tedder et al., J.Cell Biochem., 14D: 195 (1990)).

Предрасположенный к экспрессии CD20 в В-клеточных лимфомах данный антиген может служить в качестве кандидата для «нацеливания» на такие лимфомы. В сущности, такое нацеливание может быть обобщено следующим образом: антитела, специфичные в отношении поверхностного антигена CD20 В-клеток, вводят пациенту. Данные анти-CD20-антитела специфически связываются с антигеном CD20 (якобы) как нормальных, так и злокачественных В-клеток; антитело, связанное с поверхностным антигеном CD20, может приводить к деструкции и уменьшению неопластических В-клеток. Кроме того, химические агенты или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, могут быть конъюгированы с антителом против CD20, таким образом, чтобы агент специфически «доставлялся» в неопластические В-клетки. Безотносительно к подходу, главная цель заключается в разрушении опухоли; специфический подход может быть определен посредством конкретного используемого антитела против CD20, и, следовательно, доступные подходы к нацеливанию на антиген CD20 могут значительно варьироваться.

CD19 представляет собой другой антиген, который экспрессируется на поверхности клеток В-линии. Аналогично CD20, CD19 обнаружен на клетках в процессе дифференцировки линии от стадии стволовых клеток до момента, непосредственно предшествующего конечной дифференцировке в плазматические клетки (Nadler, L. Lymphocyte Typing II 2: 3-37 и Appendix, Renling et al., Eds. (1986), Springer Verlag). Однако, в отличие от CD20, антитело, связывающееся с CD19, вызывает интернализацию антигена CD19. Антиген CD10 идентифицируют, помимо прочего, с помощью антитела HD237-CD19 (так называемого антитела «В4») (Kissel et al., Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)). Антиген CD19 присутствует на 4-8% мононуклеарных клеток периферической крови, селезенки, лимфатических узлов или миндалевидных желез. CD19 не обнаруживается на Т-клетках периферической крови, моноцитах или гранулоцитах. Виртуально все не-Т-клеточные острые лимфобластные лейкемии (ALL), В-клеточные хронические лимфоцитные лейкемии (CLL) и В-клеточные лимфомы экспрессируют CD19, обнаруживаемый с помощью антитела В4 (Nadler et al., J.Immunol., 131:244 (1983); и Nadler et al., в Progress in Hematology, Vol.XII, pp.187-206. Brown E., ed. (1981) Grune&Stratton, Inc.).

Были идентифицированы дополнительные антитела, которые узнают специфические для стадии дифференцировки антигены, экспрессируемые клетками В-клеточной линии. К ним относится антитело В2, направленное против антигена CD21; антитело В3, направленное против антигена CD22; и антитело J5, направленное против антигена CD10 (так называемое CALLA). См., патент США № 5595721, выданный 21 января 1997 (Kaminski et al.).

Антитело ритуксимаб (RITUXAN®) представляет собой генетически сконструированное химерное моноклональное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20. Ритуксимаб представляет собой антитело, называемое «С2В8» в патенте США № 5736137, выданном 7 апреля 1998 г. (Anderson и др.). RITUXAN® предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или рефрактерной, низкоуровневой или фолликулярной, CD20 положительной, В-клеточной неходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro продемонстрировали, что RITUXAN® связывает комплемент человека и растворяет лимфоидные В-клеточные линии за счет комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Reff et al., Blood 83(2): 435-445 (1994)). Кроме того, он обладает значительной активностью в анализах антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Позднее было показано, что RITUXAN® обладает антипролиферативным действием в анализах, в которых используется меченный по тритию тимидин, и непосредственно индуцирует апоптоз, тогда как другие анти-CD19- и анти-CD20- антитела таким свойством не обладают (Maloney et al., Blood, 88(10): 637a (1996)). Синергизм между RITUXAN® и химиотерапией и токсинами также наблюдался экспериментально. В частности, RITUXAN® повышает чувствительность устойчивых к действию лекарственных средств клеточных линий В-клеточной лимфомы человека к цитотоксическому действию доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)). Доклинические исследования in vivo показали, что RITUXAN® резко уменьшает количество В-клеток в периферической крови, лимфатических узлах и костном мозге обезьян cynomolgus (макака-крабоед, Macaca fascicularis), предположительно посредством комплемент- и клеточно-опосредованных процессов (Reff et al. Blood 83(2): 435-445 (1994)).

Патенты и патентные публикации, касающиеся антител против CD20, включают в себя патенты США №№ 5776456, 5736137, 6399061 и 5843439, а также заявки на патент США № US 2002/0197255A1 и US 2003/0021781A1 (Anderson и др.); патент США № 6455043В1 и WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez и White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez и Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky и др.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter и White); WO 01/10460 (White и Grillo-Lopez); заявки на патент США № US 2002/0006404 и WO 02/04021 (Hanna и Hariharan); заявки на патент США № US 2002/0012665A1 и WO 01/74388 (Hanna, N); заявки на патент США № US 2002/0009444A1 и WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C.); заявки на патент США № US 2002/0128488A1 и WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky и др.); WO 02/096948 (Braslawsky и др.); WO 02/079255 (Reff и Davies); патент США № 6171586B1 и WO 98/56418 (Lam et al.); WO 98/58964 (Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.); WO 99/51642, патент США № 6194551B1, патент США № 6242195B1, патент США № 6528624B1 и патент США № 6538124 (Idusogie и др.); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd и др.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez и др.); заявки на патент США № US 2002/0004587A1 и WO 01/77342 (Miller и Presta); заявки на патент США № US 2002/0197256 (Grewal, I.); патенты США №№ 6090365B1, 6287537B1, 6015542, 5843398 и 5595721 (Kaminski и др.); патенты США №№ 5500362, 5677180, 5721108 и 6120767 (Robinson и др.); патент США № 6410391B1 (Raubitschek и др.); патент США № 6224866B1 и WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg и Hansen); WO 00/76542 (Golay и др.); WO 01/72322 (Wolin и Rosenblatt); патент США № 6368596B1 (Ghetie и др.); заявку на патент США № US 2003/0026801A1 (Weiner и Hartmann); WO 02/102312 (Engleman, E), каждый из которых специально включен в данное описание путем ссылки. См. также патент США 5849898 и заявку ЕР № 330191 (Seed и др.); патент США № 4861579 и ЕР 332865А2 (Meyer и Weiss) и WO 95/03770 (Bhat и др.).

Публикации, касающиеся терапии с использованием ритуксимаба, включают в себя Perotta and Abuel “Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab” Abstract # 3360, Blood 10(1) (part 1-2): p.88B (1998); Stashi et al., “Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura”, Blood 98(4): 952-957 (2001); Matthews, R. “Medical Heretics”, New Scientist 97 April, 2001); Leandro et al., “Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion” Ann Pheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro et al. “Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001); Leandro et al. “An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”, Arthritis and Rheumatism 46(1): 2673-3677 (2002); Edwards and Cambridge “Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes” Rheumatology 40:205-211 (2001); Edwards et al. “B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders” Biochem Soc. Trans. 3094): 824-828 (2002); Edwards et al. “Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: Arandomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Levine and Penstronk “IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab”, Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. “Efficacy of selective B cell blockage in the treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheum. 46:2029-2033 (2002); Hidashida et al."Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab." Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; Ne Orleans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002.

В заявке на патент США № 2003/0068664 (Albitar et al.) описан анализ ELISA для определения антихимерного тела человека (НАСА), направленного против ритуксимаба.

Краткое изложение сущности изобретения

В примере 1 данного изобретения описана разработка анализа комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) для обнаружения нейтрализующих антител против антитела, которое связывается с В-клеточным поверхностным маркером, а именно антигеном CD20. Активность CDC измеряли путем инкубирования CD20-положительных клеток с комплементом человека в отсутствие или в присутствии различных концентраций антитела против CD20. Затем измеряли цитотоксичность путем подсчета живых клеток. Был протестирован матриксный эффект сыворотки крови на эффективность анализа. Сыворотка крови могла допускаться в концентрации вплоть до 40% без заметного изменения величин ЕС₅₀. Затем были исследованы образцы сыворотки крови пациента с системной красной волчанкой (SLE), получившего лечение антителом против CD20 и отвечающего на антитело. CDC-активность антитела против CD20 могла быть или полностью, или частично блокирована сывороткой НАСА, указывая не нейтрализующую активность обработанных образцов. Для сравнения, образцы сыворотки крови, полученной перед введением антитела против CD20, не продемонстрировали нейтрализующей активности. Данный анализ характеризует природу любого ответа антител против лекарственного средства; следовательно, он будет представлять ценность для оценки безопасности и эффективности лекарственного средства.

Соответственно, в настоящем изобретении разработан способ оценки эффективности антитела, которое связывается с CD20, включающий в себя измерение способности биологического образца, полученного от пациента, обработанного антителом против CD20, блокировать биологическую активность антитела против CD20.

Изобретение дополнительно относится к способу иммунотерапии, включающему в себя введение пациенту антитела, которое связывается с CD20; и измерение способности биологического образца, полученного от пациента, блокировать биологическую активность антитела против CD20.

В другом аспекте, изобретение относится к способу обнаружения нейтрализующих антител в отношении терапевтического антитела, включающему в себя воздействие на клетки, которые экспрессируют антиген, с которым связывается терапевтическое антитело, комплемента в присутствии терапевтического антитела и биологического образца, полученного от пациента, обработанного данным антителом, и определение активности комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) терапевтического антитела, где снижение CDC-активности указывает на присутствие нейтрализующих антител в биологическом образце.

Кроме того, разработан способ оценки эффективности антагониста, который связывается с В-клеточным поверхностным маркером, включающий в себя измерение способности биологического образца, полученного от пациента, обработанного антагонистом, блокировать биологическую активность антагониста.

В еще одном следующем варианте осуществления изобретение относится к способу иммунотерапии, включающему в себя введение пациенту антитела, которое связывается с В-клеточным поверхностным маркером, и измерение способности биологического образца, полученного от пациента, блокировать биологическую активность антитела.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

1. Определения

Если не указано иначе, выражение «биологический образец» в данном описании означает образец, полученный от пациента. Образец может включать в себя антитела, которые связываются с антителом или лекарственным средством, которым лечат пациента, таким как антитело человека против мыши (НАМА), антихимерное антитело человека (НАСА) или антитело человека против человека (НАНА). Биологический образец может, например, представлять собой сыворотку крови, антитела, выделенные у пациента, плазму крови, клеточный лизат, молоко, слюну и другие выделения, но предпочтительно сыворотку крови.

Выражение «биологическая активность» относится к измеряемой функции антитела или его антагониста. Подразумеваются различные виды активности, которые включают в себя, но не ограничиваются указанным, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), апоптоз, ингибирование роста клеток (например, опухолевых клеток) и т.д.

Способность биологического образца (или антител, возникающих у пациента против рассматриваемого лекарственного средства) «блокировать» биологическую активность антагониста или антитела относится как к частичному, так и к полному блокированию такой активности.

Термин «В-клеточный поверхностный маркер» в данном описании относится к антигену, экспрессируемому на поверхности В-клетки, на который может быть нацелен антагонист или антиген, который с ним связывается. Иллюстративные В-клеточные поверхностные маркеры включают в себя CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 лейкоцитарные поверхностные маркеры. Конкретный представляющий интерес В-клеточный поверхностный маркер предпочтительно экспрессируется на В-клетках по сравнению с другими не-В-клеточными тканями млекопитающего и может экспрессироваться как на предшественнике В-клетки, так и на зрелой В-клетке. В одном варианте осуществления маркер является таким как CD20 или CD19, который находится на В-клетках в процессе дифференцировки линии от стадии стволовых клеток до момента непосредственно перед окончательной дифференцировкой в плазматические клетки крови. Предпочтительным В-клеточным поверхностным маркером в данном описании является CD20.

Антиген «CD20» представляет собой не гликозилированный фосфопротеин в 35 кДа, обнаруживаемый на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови и лимфатических органов. CD20 экспрессируется во время раннего пред-В-клеточного развития и остается до дифференцировки в плазматические клетки. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на злокачественных В-клетках. Другие названия для CD20, имеющиеся в литературе, включают в себя «В-лимфоцит-ограниченный антиген» и «Вр35». Антиген CD20 описан, например, в публикации Clark et al. PNAS (USA) 82:1766 (1985).

Как использовано в данном описании, термин «уменьшение (количества) В-клеток» относится к снижению уровней В клеток у животного или человека, обычно после лечения лекарственным средством или антителом, по сравнению с уровнем перед лечением. Уменьшение количества В-клеток может быть частичным или полным. Уровни В-клеток измеряют хорошо известными способами, такими как описанные у Reff et al., Blood 83:435-445 (1994) или в патенте США № 5736137 (Anderson и др.). В качестве примера, млекопитающему (например, обычному примату) можно вводить различные дозировки антитела или антагониста, и концентрации В-клеток в периферической крови могут быть определены, например, с использованием способа FACS, с помощью которого подсчитывают В-клетки.

«В-клеточное злокачественное заболевание» представляет собой злокачественное заболевание, затрагивающее В-клетки. Примеры включают в себя болезнь Ходжкина, включая лимфоцит-доминирующую болезнь Ходжкина (LPHD); неходжкинскую лимфому (NHL); фолликулярную центрально-клеточную лимфому (FCC); острую лимфоцитарную лейкемию (ALL); хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL); волосатоклеточный лейкоз; плазмацитоидную лимфоцитарную лимфому; лимфому клеток коры головного мозга, СПИД - или ВИЧ-связанную лимфому; множественную миелому; лимфому центральной нервной системы (ЦНС); посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD); макроглобулинемию Вальденстрома (лимфоплазмацитарная лимфома); лимфому, ассоциированную со слизистой лимфатической ткани (MALT) и лимфому/лейкемию маргинальной зоны.

Неходжкинская лимфома (NHL) включает в себя, но не ограничивается указанным, низкоуровневую фолликулярную NHL, рецидивирующую или рефрактерную NHL, NHL фронтальной линии низкой степени, NHL стадии III/IV, химиотерапевтически устойчивую NHL, NHL небольших лимфоцитов (SL), промежуточной степени/фолликулярную NHL, промежуточной степени диффузную NHL, диффузную NHL больших клеток, агрессивную NHL (включая агрессивную NHL фронтальной линии и агрессивную рецидивирующую NHL), рецидивирующую или рефрактерную после аутологичной трансплантации стволовых клеток NHL, иммунобластную NHL высокой степени, лимфобластную NHL высокой степени, NHL небольших нерасщепляемых клеток высокой степени, большое заболевание NHL.

В данном описании термин «аутоиммунное заболевание» относится к заболеванию или нарушению, возникающему в собственных тканях индивидуума или направленному против них. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений включают в себя, но не ограничиваются указанным, артрит (ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориазный артрит), псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермический некролиз, системная склеродерма или склероз, ответные реакции, связанные с воспалительным заболеванием кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, включая инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответные реакции, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, недостаток адгезии лейкоцитов, системную красную волчанку (SLE), ювенильный начальный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, иммунные ответные реакции, связанные с острой и отставленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, грануломатоз, включая грануломатоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (включая ANCA), апластическую анемию, анемию Diamond Blackfan, иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению А, панцитопению, лейкопению, заболевания, включающие в себя диапедез лейкоцитов, воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС), синдром множественного повреждения органа, миастению гравис (особая форма мышечной слабости), заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, антигломерулярное заболевание базальной мембраны, синдром антифосфолипидного антитела, аллергический нефрит, болезнь Бехета, синдром Кастлемана, синдром Гудпастчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, отторжение трансплантата плотного органа, заболевание трансплантат-против-хозяина (GVHD), буллезную пузырчатку, пузырчатку обыкновенную, аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь Рейтера, синдром окостеневшего человека, артерит гигантской клетки, иммунный комплексный нефрит, нефропатию IgA, полинейропатию IgM или IgM-опосредованную нейропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), включая флударабин-связанную ITP, тромбоцитопенический акроангиотромбоз (ТТР), аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание яичек и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотироидизм; аутоиммунные эндокринные заболевания, включая аутоиммунный тироидит, хронический тироидит (тироидит Хашимото), подострый тироидит, идиопатический гипотироидизм, болезнь Аддисона, болезнь Граве, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), диабет типа I, также относящийся к инсулинозависимому сахарному диабету (IDDM), и синдром Шихана; аутоиммунный гепатит, лимфоидную внутритканевую пневмонию (HIV), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантат) против NSIP, синдром Гуиллайна-Барре, васкулит больших сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (Такаясу), васкулит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит), анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Бергера (IgA-нефропатия), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный желчный цирроз, глютенчувствительная целиакия (глютеновая энтеропатия), криоглобулинемия, амиотрофический латеральный склероз (ALS), заболевание коронарной артерии, болезнь холодовой агглютинации, ингибиторы приобретенного фактора VIII, люпус-нефрит и т.д.

«Антагонист», который связывает В-клеточный поверхностный маркер, в данном изобретении представляет собой молекулу, которая при связывании с В-клеточным поверхностным маркером разрушает или уменьшает количество В-клеток у млекопитающего и/или препятствует одной или нескольким функциям В-клеток, например, путем снижения или предотвращения гуморальной ответной реакции, вызываемой В-клеткой. Антагонист предпочтительно способен уменьшать количество В-клеток у млекопитающего, которому он введен. Такое истощение может достигаться посредством различных механизмов, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индукция смерти В-клеток (например, путем апоптоза). Антагонисты, включенные в объем настоящего изобретения, включают в себя антитела, пептиды с синтетическими или природными последовательностями, антагонисты, имеющие небольшие молекулы, которые связываются с В-клеточным маркером, необязательно конъюгированные или слитые с цитотоксическим агентом. Предпочтительный антагонист включает в себя антитело.

Термины «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и “ADCC” относятся к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксичные клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcRs) (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на поверхности клетки-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, клетки NK, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на стр.464 публикации Raverch и Kinet, Annu.Rev.Immunol. 9:457-92 (1991). Для оценки ADCC активности представляющей интерес молекулы может быть осуществлен анализ ADCC in vitro, так как описано в патентах США № 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают одноядерные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, может быть проведена оценка ADCC активности представляющей интерес молекулы in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в публикации Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcRs и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют по крайней мере FcγRIII и осуществляют ADCC эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают одноядерные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, где предпочтительными являются клетки PBMC и NK.

Термины «рецептор Fc» или «FcR» использованы для описания рецептора, который связывается с областью Fc антитела. Предпочтительный FcR представляет собой исконную последовательность FcR человека. Более того, предпочтительный FcR является таким, который связывает антитело IgG (гамма рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно соединенные формы данных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIА («активирующий рецептор») и FcγRIIВ («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные последовательности аминокислот, которые отличаются в первую очередь цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIА содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIВ содержит иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см. Dalron, Annu Rev.Immunol., 15:203-234 (1997)). Обзор данных по рецепторам FcR приведен в публикациях Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 :457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие рецепторы FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются в данном описании термином «FcR». Термин также включает в себя рецептор новорожденных, FcRn, который является ответственным за перенос вещества IgG в утробный плод (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J.Immunol. 24: 249 (1994)). FcR в данном описании включают полиморфизм, такой как генетический диморфизм гена, который кодирует FcγRIIА, приводя или к фенилаланину (F), или к валину (V) в аминокислоте в положении 158, расположенной в области рецептора, которая связывается с IgG1. Было показано, что гомозиготный валиновый FcγRIIIА (FcγRIIIa-158V) обладает более высокой аффинностью в отношении IgG1 человека и опосредует повышенную ADCC in vitro относительно гомозигонтого фенилаланинового (FcγRIIIa-158F) или гетерозиготного (FcγRIIIa-158F/V) рецепторов.

Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность» или “CDC” относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Комплемент-активированный путь инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента анализ CDC может быть осуществлен, как описано, например, Gazzano-Santoro et al., J.Immunol.Methods 202: 163 (1996).

«Ингибирующие рост» антагонисты или антитела представляют собой те, которые предотвращают или снижают пролиферацию клетки, экспрессирующей антиген, с которым связывается антагонист. Например, антагонист или антитело могут предотвращать или уменьшать пролиферацию В-клеток in vitro и/или in vivo.

Антагонисты или антитела, которые «индуцируют апоптоз», представляют собой те, которые индуцируют программируемую клеточную смерть, например, В-клетки, что может быть определено с помощью стандартных анализов апоптоза, таких как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сжатие клеток, расширение эндоплазматической сети, фрагментация клеток и/или образование мембранных везикул (так называемых апоптических тел).

Термин «антитело» в данном описании использован в наиболее широком смысле и в частности охватывает целые моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по крайней мере из двух целых антител, и фрагменты антител до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность.

Термин «фрагменты антител» охватывает части целых антител, предпочтительно включающие в себя их антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

«Природные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины примерно в 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей изменяется для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеют регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь содержит, по крайней мере, на одном конце вариабельную область (V_H), за которой следует ряд постоянных областей. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область (V_L) на одном конце и постоянную область на другом конце; постоянная область легкой цепи выровнена по первой постоянной области тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи выровнена по вариабельной области тяжелой цепи. Предполагается, что определенные остатки аминокислот образуют границу раздела между вариабельными областями легкой и тяжелой цепей.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что некоторые части вариабельных областей в значительной степени отличаются в последовательности среди антител и используются при связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределена между вариабельными областями антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями в вариабельных областях как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных областей называются областями каркаса (FRs). Вариабельные области каждой из природных тяжелой и легкой цепей содержат четыре FRs, в большинстве принимающие β-листовые конфигурации, связанные тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть β-листовой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в близком соседстве посредством FRs и вместе с вариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антиген-связывающих сайтов антител (см. Kabat et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Постоянные области не включены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

Расщепление папаином антител приводит к двум идентичным антиген-связывающим фрагментам, называемым фрагментами “Fab”, где каждый содержит единственный антиген-связывающий сайт, и остаточный фрагмент “Fc”, чье название отражает его способность к легкой кристаллизации. Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')₂, который содержит два антиген-связывающих сайта и еще способен к кросс-сшиванию антигена.

“Fv” представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий сайт. Данная область состоит из димера одной тяжелой цепи и одной вариабельной области легкой цепи в тесном не ковалентном взаимодействии. Именно в данной конфигурации три гипервариабельные области каждой вариабельной области взаимодействуют для определения антиген-связывающего сайта на поверхности димера V_H-V_L. Совместно, шесть гипервариабельных областей придают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако, даже единственная переменная область (или половина Fv, включающая только три гипервариабельные области, специфичные по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с пониженной аффинностью по сравнению с полным сайтом связывания.

Фрагмент Fab также содержит постоянную область легкой цепи и первую постоянную область (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением новых остатков на карбоксильных концах СН1 области тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH относится в данном описании к обозначению Fab', в котором цистеиновый(ые) остаток(ки) постоянных областей содержит по крайней мере три тиольные группы. Фрагменты антитела F(ab')₂ первоначально были получены как пары фрагментов Fab', которые содержат между собой гарнирные цистеины. Также известны другие виды химического связывания фрагментов антител.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) любого из видов позвоночных животных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (к) и лямбда (λ) на основании последовательностей аминокислот их постоянных областей.

В зависимости от последовательности аминокислот постоянной области их тяжелых цепей, антитела могут быть отнесены к различным классам. Существует пять основных классов цельных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Постоянные области тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, называют α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антител включают области V_H и V_L антитела, где данные области присутствуют в единственной полипептидной цепи. Предпочтительно полипептид Fv дополнительно включает в себя полипептидный линкер между V_H и V_L областями, который дает возможность фрагменту scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор по scFv см. Plockthun, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антиген-связывающими сайтами, фрагменты которых включают вариабельную область тяжелой цепи (V_H), связанную с вариабельной областью легкой цепи (V_L) в той же самой полипептидной цепи (V_H-V_L). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы предоставить возможность спаривания между двумя доменами одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Термин «моноклональное антитело», как он использован в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, включающие в себя популяцию, являются идентичными за исключением природно существующих мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, направленными против единственного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам обычного (поликлонального) антитела, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела имеют преимущества в том, что они являются синтезированными с помощью гибридомных культур, не загрязненные другими иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, как на полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требование продуцирования антитела любым конкретным способом. Например, моноклональное антитело для использования в соответствии с настоящим изобретением может быть получено гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или может быть получено методами рекомбинантной ДНК (например, см. патент США 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из библиотек фаговых антител с использованием способов, например, описанных Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в данном описании конкретно включа