Способ получения сложного эфира углерода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы или сложного эфира гидроксикислоты с использованием липидацилтрансферазы

Способ получения сложного эфира углерода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы или сложного эфира гидроксикислоты с использованием липидацилтрансферазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственные заявки

В данном описании изобретения сделана ссылка на нижеследующие заявки: заявка на патент США № 09/750990, поданная 20 июля 1999 г., и заявка на патент США № 10/409391. Вышеуказанные заявки, все документы, приведенные в данных заявках (“документы, приведенные в заявках”), и все документы, которые приведены или на которые дана ссылка в документах, приведенных в заявках, как в тексте, так и во время ведения дела по заявкам, а также все доводы в поддержку патентоспособности, представленные во время рассмотрения заявок, включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. В данном описании изобретения приведены также разные документы (именуемые “документами, на которые имеется ссылка в материалах заявки”). Все документы, на которые имеется ссылка в материалах заявки, и все документы, приведенные в таких документах, включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу биоконверсии липидов при помощи липидацилтрансферазы с целью получения сложного эфира углевода, и/или сложного эфира белка, и/или сложного эфира белковой субъединицы, и/или сложного эфира гидроксикислоты.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению липидацилтрансферазы для биоконверсии липида в один или несколько нижеследующих продуктов: сложный эфир углевода, и/или сложный эфир белка, и/или сложный эфир белковой субъединицы, и/или сложный эфир гидроксикислоты.

Настоящее изобретение, более того, относится к применению вышеуказанной иммобилизованной липидацилтрансферазы для биоконверсии липида в среде с высоким содержанием воды с целью получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, и/или сложных эфиров белков, и/или сложных эфиров белковых субъединиц, и/или сложных эфиров гидроксикислот.

Настоящее изобретение также относится к иммобилизованной липидацилтрансферазе.

Уровень техники

Липазы широко используются для биоконверсии липидов с целью получения ценных продуктов, например сложных эфиров сахаров, предназначенных для применения в разных отраслях промышленности, включая пищевую промышленность и/или промышленность по производству кормов, косметическую и/или парфюмерную промышленность, олеохимическую промышленность и фармацевтическую промышленность.

Если процессы биоконверсии требуют гидролиза липидных субстратов, то можно использовать липолитические ферменты в средах с высоким содержанием воды. Однако когда процессы биоконверсии требуют выполнения реакций переэтерификации, таких как алкоголиз, применение липаз в средах с высоким содержанием воды может быть неприемлемым из-за нежелательных реакций гидролиза, вызывающих образование нежелательных биопродуктов и/или из-за более низкого выхода продукта биоконверсии.

При выполнении процессов биоконверсии, требующих переэтерификации, обычно используют липазы в безводных средах, таких как масляные системы, и/или системы органических растворителей, таких как бутанол, метанол или гексан. Такие системы образуют среду, в которой по крайней мере частично могут быть солюбилизованы как полярная акцепторная молекула, так и донорная молекула липида и липаза обладает достаточной ферментативной активностью. Хотя для обеспечения любой ферментативной активности необходимо небольшое количество воды, ее количество строго контролируется на низком уровне во избежание гидролитической активности фермента.

Сложные эфиры сахаров, сложные эфиры белков или сложные эфиры гидроксикислот получают химическим синтезом с использованием неорганических катализаторов. При выполнении процессов биоконверсии, направленных на получение сложных эфиров сахаров или сложных эфиров гидроксикислот, используют липазы в органических растворителях или сверхкритических жидкостях, в которых присутствует лишь незначительное количество воды (если вообще присутствует).

В публикации Lecointe et al., Biotechnology Letters, Vol. 28, No. 8 (August), стр. 869-874, описано исследование ряда ферментов липазы и их активности в водных средах при получении сложного метилового эфира или сложного бутилового эфира соответственно из метанола и бутанола. В публикации Lecointe et al. указано, что липаза/ацилтрансфераза из Candida parapsilosis при увеличении концентраций метанола или бутанола демонстрирует пониженную гидролизную активность и повышенную способность фермента продуцировать сложный метиловый эфир и сложный бутиловый эфир. Использование липазы/ацилтрансферезы из C. parapsilosis при получении жирной гидроксамовой кислоты рассмотрено в публикации Vaysse et al., J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46.

На протяжении некоторого времени известна липаза:холестерол-ацилтрансфераза (см., например, публикацию Buckley, Biochemistry 1983, 22, 5490-5493). В частности, было обнаружено, что глицерофосфолипид: холестерол-ацилтрансферазы (часто именуемые GCAT), которые, как и лецитин:холестерол-ацилтрансферазы (LCAT) растений и/или млекопитающих, катализируют перенос жирных кислот между фосфатидилхолином и холестерином.

В публикациях Upron and Buckley (TIBS 20, May 1995 стр. 178-179) и Brumlik and Buckley (J. of Bacteriology Apr. 1996 стр. 2060-2064) описана липаза/ацилтрансфераза из Aeromonas hydrophila, которая способна осуществлять перенос ацильной группы в спиртовые акцепторы в водных средах.

Сущность изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является способ получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот, который включает смешивание донора ацильной группы, акцептора ацильной группы и воды с образованием среды с высоким содержанием воды, содержащей 5-98% воды, при этом вышеуказанный донор ацильной группы является липидным субстратом, выбранным из одного или нескольких членов группы, включающей фосфолипид, лизофосфолипид, триацилглицерид, диглицерид, гликолипид или лизогликолипид, и вышеуказанный акцептор ацильной группы выбирают из одного или нескольких членов группы, включающей углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту; и контактирование указанной смеси с липидацилтрансферазой, осуществляемого таким образом, что липидацилтрансфераза катализирует одну или обе нижеследующие реакции: алкоголиз или переэтерификацию.

Другим объектом настоящего изобретения является применение липидацилтрансферазы для получения одного или нескольких сложных эфиров углеводов, сложных эфиров белков, сложных эфиров белковых субъединиц или сложных эфиров гидроксикислот путем катализа алкоголиза или переэтерификации либо обеих указанных реакций в смеси донора ацильной группы, акцептора ацильной группы и воды, содержащей 5-98% воды в смеси, при этом вышеуказанным донором ацильной группы является липидный субстрат, выбираемый из одного или нескольких членов группы, включающей фосфолипид, лизофосфолипид, триацилглицерид, диглицерид, гликолипид или лизогликолипид, и вышеуказанный акцептор ацильной группы выбирают из одного или нескольких членов группы, включающей углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту.

Другим объектом настоящего изобретения является сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы или сложный эфир гидроксикислоты, полученный способом по настоящему изобретению.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются фармацевтический препарат, косметический препарат, пищевой продукт, кормовой продукт и краска, содержащие сложный эфир углевода, сложный эфир белка, сложный эфир белковой субъединицы или сложный эфир гидроксикислоты, полученный способом по настоящему изобретению.

Еще одним объектом настоящего изобретения является иммобилизованный фермент липидацилтрансфераза, описанный в данной заявке.

Подробное описание настоящего изобретения

Термин “липидацилтрансфераза” в используемом здесь значении означает фермент, который кроме того, что обладает липазной активностью (обычно классифицируемой как Е.С. 3.1.1.х в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов (1992) Комитета по номенклатуре Международного союза по биохимии и молекулярной биологии), также обладает ацилтрансферазной активностью (обычно классифицируемой как Е.С. 2.3.1.х), благодаря чему фермент способен переносить ацильную группу из липида в один или несколько нижеследующих акцепторных субстратов: углевод, белок, белковая субъединица или гидроксикислота.

“Акцептор ацильной группы” по настоящему изобретению предпочтительно не является водой.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу из липидного субстрата в углевод.

Углеводным акцетором ацильной группы может быть одно или несколько нижеследующих веществ: моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид. Углеводом предпочтительно является одно или несколько нижеследующих веществ: глюкоза, фруктоза, ангидро-фруктоза, мальтоза, лактоза, сахароза, галактоза, ксилоза, ксилоолигосахариды, арабиноза, мальтоолигосахариды, тагатоза, микротецин, аскопирон Р, аскопирон Т или кортальцерон.

Сложные эфиры углеводов могут быть ценными эмульгаторами, например, в пищевых продуктах.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу из липидного субстрата в белок и/или белковую субъединицу.

Белковой субъединицей предпочтительно является одно или несколько нижеследующих веществ: аминокислота, гидролизат белка, пептид, дипептид, олигопептид, полипептид.

Приемлемые белки могут представлять собой одно или несколько нижеследующих веществ: белки, присутствующие в пищевых продуктах, например в молочных и/или мясных продуктах. В качестве примера можно привести белки, обнаруживаемые в свернувшемся молоке или сыворотке, такие как лактоглобулин. Другие приемлемые белки включают овальбумин (из яйца), глиадин, глютенин, пуроиндолин, пшеничный белок, липидпереносящие белки из зерна, миозин из мяса или нижеследующие молочные белки: казеины, лактоальбумины и лактоферрины.

Акцептором ацильной группы в белке или белковой субъединице может быть один или несколько нижеследующих компонентов белка или белковой субъединицы: серин, треонин, тирозин или циcтеин.

Когда белковой субъединицей является аминокислота, то такой аминокислотой может быть любая аминокислота. Аминокислотой предпочтительно является, например, серин, треонин, тирозин или цистеин.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент способен переносить ацильную группу из липидного субстрата в гидроксикислоту.

Приемлемой гидроксикислотой может быть одна или несколько нижеследующих кислот: лимонная кислота, винная кислота, молочная кислота, аскорбиновая кислота, гликолевая кислота, яблочная кислота, альфа-гидроксиэтановая кислота, альфа-гидроксиоктановая кислота, альфа-гидроксикаприловая кислота, гидроксикаприловая кислота, глюконовая кислота, лактобионовая кислота или мальтобионовая кислота.

Приемлемой гидроксикислотой может быть фруктовая кислота, например одна или несколько кислот, таких как яблочная кислота, молочная кислота, винная кислота, лимонная кислота или гликолевая кислота.

В одном варианте осуществления изобретения предпочтительной гидроксикислотой является одна или несколько нижеследующих кислот: лимонная кислота, молочная кислота, винная кислота или яблочная кислота.

Термин “оксикислота” в используемом здесь значении означает карбоновую кислоту, в которой один или несколько атомов водорода алкильной группы заменены гидроксильной группой.

В соответствии с одним объектом изобретения липидацилтрансфераза помимо способности переносить ацильную группу из липидного субстрата в один или неколько углеводов, белков, белковых субъединиц или гидроксикислот может также переносить ацильную группу из липида в одно или несколько нижеследующих веществ, представляющих собой стерол и/или станол, в частности фитостерол и/или фитостанол.

Когда липидным субстратом является фосфолипид, он может быть лецитином, например фосфатидилхолином. Термин “лецитин” в используемом здесь значении означает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.

Когда липидным субстратом является лизофосфолипид, он может быть лизолецитином, например лизофосфатидилхолином. Термин “лизофосфатидилхолин” в ипользуемом здесь значении синонимичен термину “лизолецитин”, поэтому указанные термины можно использовать взаимозаменяемо.

Когда липидным субстратом является гликолипид, он может быть, например, дигалактозилдиглицеридом (DGDG).

Липидный субстрат может именоваться в данном описании изобретения как “липидный донор ацильной группы” или “донор ацильной группы”. Указанные термины использованы взаимозаменяемо в данной заявке.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидным субстратом, в котором действует липидацилтрансфераза, предпочтительно является фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидным субстратом предпочтительно является гликолипид, такой как, например, DGDG.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидным субстратом может быть пищевой липид, то есть липидный компонент пищевого продукта.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может быть неспособна или по существу неспособна воздействовать на триглицерид, 1-моноглицерид и/или 2-моноглицерид.

Липидный субстрат или липидный донор ацильной группы может представлять собой один или несколько липидов, присутствующих в одном или нескольких нижеследующих субстратах, таких как жиры, включая лярд, сало и молочный жир; масла, включая масла, экстрагированные или выделенные из пальмового масла, подсолнечного масла, соевого масла, сафлорового масла, хлопкового масла, арахисового масла, кукурузного масла, оливкового масла, кокосового масла и рапсового масла. Лецитин из сои, рапсовых семян или яичного желтка также является приемлемым липидным субстратом. Липидный субстрат может быть липидом овса или другого растения, содержащего галактолипиды.

В соответствии с некоторыми объектами настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной от 8 до 22 атомов углерода.

В соответствии с некоторыми объектами нестоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной от 16 до 22 атомов углерода, более предпочтительно от 16 до 20 атомов углерода.

В соответствии с некоторыми объектами настоящего изобретения липид может быть выбран из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной не более 14 атомов углерода, в частности из липидов, имеющих цепь жирных кислот длиной от 4 до 14 атомов углерода, в частности от 4 до 10 атомов углерода, в частности от 4 до 8 атомов углерода.

Донор ацильной группы предпочтительно не является свободной жирной кислотой.

Донор ацильной группы предпочтительно не является сложным эфиром углевода (сахара).

Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать одной или несколькими нижеследующими липазными активностями: активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26), триацилглицерол-липазы (Е.С. 3.1.1.3), фосфолипазы А2 (Е.С. 3.1.1.4) или фосфолипазы А1 (Е.С. 3.1.1.32). Термин “активность гликолипазы” в используемом здесь значении означает также “активность галактолипазы”.

Липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать по крайней мере одной или несколькими нижеследующими активностями: активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26), и/или фосфолипазы А1 (Е.С. 3.1.1.32), и/или фосфолипазы А2 (Е.С. 3.1.1.4).

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может обладать по крайней мере активностью гликолипазы (Е.С. 3.1.1.26).

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может быть способна переносить ацильную группу из гликолипида и/или фосфолипида в один или несколько нижеследующих акцепторных субстратов: углевод, белок, белковую субъединицу, гидроксикислоту.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно способна переносить ацильную группу из гликолипида и/или фосфолипида в углевод с образованием по крайней мере сложного эфира углевода.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно способна переносить ацильную группу из гликолипида и/или фосфолипида в белок или белковую субъединицу с образованием по крайней мере сложного эфира белка (или конденсата жирной кислоты белка) или сложного эфира белковой субъединицы.

Термин “сложный эфир белковой субъединицы” в используемом здесь значении означает сложный эфир, образованный из любой белковой субъединицы, такой как, например, сложный эфир дипептида, сложный эфир олигопептида, сложный эфир полипептида или сложный эфир гидролизата белка.

В соответствии с некоторыми объектами изобретения липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно не обладает активностью триацилглицерол-липазы (Е.С. 3.1.1.3).

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению предпочтительно можно охарактеризовать на основании нижеследующих критериев:

(i) данный фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которую можно определить как активность переноса сложного эфира, в результате которого ацильная часть исходной сложноэфирной связи липидного донора ацильной группы переносится в один или несколько акцепторов ацильной группы, представляющих собой углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту, с образованием нового сложного эфира, то есть сложного эфира углевода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы и/или сложного эфира гидроксикислоты; и

(ii) данный фермент содержит фрагмент GDSX в аминокислотной последовательности, где Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, М или S.

Х в фрагменте GDSX означает L. Таким образом, фермент по настоящему изобретению предпочтительно содержит фрагмент GSDL в аминокислотной последовательности.

Фрагмент GDSX состоит из четырех консервативных аминокислот. Серин в данном фрагменте предпочтительно является каталитическим серином фермента липидацилтрансферазы. Серин фрагмента GDSX может находиться в положении, соответствующем положению Ser-16 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, как указано в публикации Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vоl. 178, No. 7, стр. 2060-2064).

Чтобы определить наличие в белке фрагмента GDSX по настоящему изобретению, последовательность предпочтительно сравнивают со скрытыми профилями модели Маркова (профили НММ) в базе данных Рfam.

Pfam является базой данных семейства доменов белка. База данных Рfam содержит несколько выверенных последовательностей для каждого семейства, а также модели скрытых профилей Маркова (профили НММ) для идентификации указанных доменов в новых последовательностях. С базой данных Рfam можно ознакомиться в публикации Bateman A. et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Модели скрытых профилей Маркова использованы в ряде баз данных, предназначенных для классификации белков, и с ними можно ознакомиться в публикации Bateman A. and Haft D.H. (2002) Brief Bioinform 3; 236-245.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list _{_} uids=12230032&dopt=Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list _{_} uids=11752314&dopt=Abstract

Для детального ознакомления с моделями скрытых профилей Маркова и с их использованием в базе данных Pfam следует обратиться к публикации Durbin R., Eddy S., and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. Пакет программ Хаммера можно приобрести в Вашингтонском университете, Сент-Луис, США.

Альтернативно фрагмент GDSX можно идентифицировать при помощи пакета программ Хаммера, инструкции по использованию которых приведены в публикации Durbin R., Eddy S., and Krogh A. (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4, ссылках, приведенных в указанной публикации, и в профиле HMMER2, рассмотренном в данном описании изобретения.

Доступ к базе данных PFAM можно получить, например, через несколько серверов, которые в настоящее время расположены на следующих Web-сайтах.

http://www.sanger.ac.uc/Software/Pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/

Данная база данных предоставляет возможность поиска с получением доступа к белковой последовательности. Используя параметры по умолчанию базы данных, можно произвести анализ белковой последовательности на наличие доменов Pfam. Домен GDSX является устойчивым доменом, поэтому его присутствие будет обнаружено в любой запрашиваемой последовательности. Указанная база данных производит сравнение согласованной последовательности Pfam00657 с запрашиваемой последовательностью.

Сравнительный анализ нескольких последовательностей, включая Aeromonas salmonicida или Aeromonas hydrophila, можно выполнить:

а) вручную

для чего необходимо произвести сравнение представляющего интерес белка с согласованной последовательностью Pfam00657 и сравнение Р10480 с согласованной последовательностью Pfam00657 вышеописанным способом;

или

b) при помощи базы данных

после идентификации согласованной последовательности Pfam00657 база данных предлагает вариант сравнения запрашиваемой последовательности с отобранной согласованной последовательностью Pfam00657. Р10480 является частью сравнения отобранных последовательностей и имеет имя GCAT_AERHY. Запрашиваемая последовательность и Р10480 будут отображены в одном окне.

Эталонная последовательность Aeromonas hydrophila:

остатки липазы GDSX Aeromonas hydrophila пронумерованы в файле Р10480 NCBI, и номера в описании изобретения относятся к номерам, указанным в данном файле, который в настоящем изобретении использован для определения конкретных аминокислотных остатков, присутствующих в предпочтительном варианте осуществления изобретения в ферментах липидацилтрансферазы по данному изобретению.

Сравнение последовательностей было выполнено с использованием базы данных Pfam (фигуры 33 и 34).

Распознаны нижеследующие консервативные остатки, которые могут присутствовать в ферментах, предназначенных для использования в композициях и способах по данному изобретению в соответствии с предпочтительным вариантом его осуществления.

где “hid” означает гидрофобный остаток, выбираемый из Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe.

Сравнение фермента липидацилтрансферазы, предназначенного для использования в композициях и способах по данному изобретению, предпочтительно можно произвести с помощью согласованной последовательности Pfam00657.

Положительное соответствие скрытому профилю модели Маркова (профиль НММ) семейства доменов pfam00657 предпочтительно указывает на присутствие домена GDSL или GDSX по настоящему изобретению.

При соответствии согласованной последовательности Pfam00657 липидацилтрансфераза, предназначенная для использования в композициях и способах по данному изобретению, предпочтительно содержит по крайней мере один, предпочтительно более одного, предпочтительно более двух нижеследующих блоков: блок GDSX, блок GANDY, блок НРТ. Липидтрансфераза соответственно может содержать блок GDSX и блок GANDY. Альтернативно фермент может содержать блок GDSX и блок НРТ. Фермент предпочтительно содержит по крайней мере блок GDSX.

При соответствии согласованной последовательности Pfam00657 фермент, предназначенный для использования в композициях и способах по данному изобретению, предпочтительно содержит по крайней мере один, предпочтительно более одного, предпочтительно более двух, предпочтительно более трех, предпочтительно более четырех, предпочтительно более пяти, предпочтительно более шести, предпочтительно более семи, предпочтительно более восьми, предпочтительно более девяти, предпочтительно более десяти, предпочтительно более одиннадцати, предпочтительно более двенадцати, предпочтительно более тринадцати, предпочтительно более четырнадцати нижеследующих аминокислотных остатков при сравнении с эталонной полипептидной последовательностью A. hydrophilia, в частности SEQ ID NO:32: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.

Домен GDSX pfam00657 является уникальным идентификатором, позволяющим отличить белки, содержащие указанный домен, от других ферментов.

Согласованная последовательность pfam00657 представлена на фигуре 1 как SEQ ID NO:1. Указанная последовательность получена в результате идентификации семейства pfam 00657, база данных, версия 6, которая может быть также определена в данном описании изобретения как pfam00657.6.

Согласованная последовательность может быть обновлена в последующих выпусках базы данных pfam.

Например, на фигурах 33 и 34 показано сравнение последовательности pfam семейства 00657 из базы данных, версия 11, которая может быть также определена в данном описании изобретения как pfam00657.11.

Блоки GDSX, GANDY и НРТ обнаружены в семействе pfam 00657 в обеих выпусках базы данных. Для идентификации семейства pfam 00657 могут быть использованы последующие выпуски базы данных pfam.

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно охарактеризовать на основании нижеследующих критериев:

(i) данный фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, в результате которого ацильная часть исходной сложноэфирной связи липидного донора ацильной группы переносится в один или несколько акцепторов ацильной группы, представляющих собой углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту, с образованием нового сложного эфира, то есть сложного эфира углевода и/или сложного эфира белка и/или сложного эфира белковой субъединицы и/или сложного эфира гидроксикислоты;

(ii) данный фермент содержит фрагмент GDSX аминокислотной последовательности, в котором Х означает один или несколько нижеследующих аминокислотных остатков L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M или S;

(iii) данный фермент содержит His-309 или остаток гистидина в положении, соответствующем положению His-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фигуре 2 (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32).

Предпочтительным аминокислотным остатком фрагмента GDSX является L.

В SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32 первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. His-309 непроцессированной последовательности, то есть белка, содержащего сигнальную последовательность, соответствует His-291 зрелой части белка, то есть последовательности без сигнальной последовательности.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению предпочтительно содержит нижеследующую каталитическую триаду: Ser-34, Asp-134 и His-309 или соответственно остаток серина, остаток аспарагиновой кислоты и остаток гистидина в положениях, соответствующих Ser-34, Asp-134 и His-309 в липолитическом фрагменте Aeromonas hydrophila, показанном на фигуре 2 (SEQ ID NO:2) или фигуре 28 (SEQ ID NO:32). Как было указано выше, в последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32, первые 18 аминокислотных остатков образуют сигнальную последовательность. Ser-34, Asp-134 и His-309 непроцессированной последовательности, то есть белка, содержащего сигнальную последовательность, соответствуют Ser-16, Asp-116 и His-291 зрелой части белка, то есть последовательности без сигнальной последовательности. В согласованной последовательности pfam00657, показанной на фигуре 1 (SEQ ID NO:1), остатки активного сайта соответствуют Ser-7, Asp-157 и His-348.

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению предпочтительно можно охарактеризовать на основании нижеследующих критериев:

(i) данный фермент обладает ацилтрансферазной активностью, которая может быть определена как активность переноса сложного эфира, в результате которого ацильная часть исходной сложноэфирной связи первого липидного донора ацильной группы переносится в один или несколько акцепторов ацильной группы, представляющих собой углевод, белок, белковую субъединицу или гидроксикислоту, с образованием нового сложного эфира, то есть сложного эфира углевода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы и/или сложного эфира гидроксикислоты; и

(ii) данный фермент содержит по крайней мере Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и His-309 или остатки глицина, аспарагиновой кислоты, серина, аспарагиновой кислоты и гистидина в положениях, соответствующих Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 и Gis-309 в липолитическом ферменте Aeromonas hydrophila, показанном на фигуре 2 (SEQ ID NO:2) или фигуре 28 (SEQ ID NO:32).

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно получить из организмов, относящихся к одному или нескольким нижеследующим родам: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas и Candida.

Фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению можно получить из одного или нескольких нижеследующих организмов: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Мycobacterium, Streprococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp., Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstoniа solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis и Candida parapsilosis.

В соответствии с одним объектом изобретения фермент липидацилтрансферазу по настоящему изобретению предпочтительно получают из одного или нескольких организмов Aeromonas hydrophila или Aeromonas salmonicida.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит одну или несколько нижеследующих аминокислотных последовательностей:

(i) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:2 (см. фигуру 2);

(ii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:3 (см. фигуру 3);

(iii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:4 (см. фигуру 4);

(iv) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:5 (см. фигуру 5);

(v) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:6 (см. фигуру 6);

(vi) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:12 (см. фигуру 14);

(vii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:20 (см. фигуру 16);

(viii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:22 (см. фигуру 18);

(ix) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:24 (см. фигуру 20);

(x) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:26 (см. фигуру 22);

(xi) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:28 (см. фигуру 24);

(xii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:30 (см. фигуру 26);

(xiii) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:32 (см. фигуру 28);

(xiv) аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO:34 (см. фигуру 30) или

аминокислотная последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34, либо аминокислотную последовательность, которая на 75% или более, предпочтительно на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, предпочтительно на 90% или более, предпочтительно на 95% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2, аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:3, аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:32, или аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:34.

В соответствии с целями настоящего изобретения степень идентичности основана на количестве одинаковых элементов последовательности. Степень идентичности по настоящему изобретению можно определить при помощи компьютерных программ, известных в данной области, таких как GAP, входящая в пакет программ GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45), используя нижеследующие установки для сравнения полипептидных последовательностей: штрафные очки за создание пробела равны 3.0 и штрафные очки за удлинение пробела равны 0,1.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:34.

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит одну или несколько нижеследующих аминокислотных последовательностей:

(а) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 1-100 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(b) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 101-200 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(с) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 201-300 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(d) аминокислотная последовательность, которая на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из аминокислотных последовательностей, приведенных выше в пунктах (а)-(с).

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению содержит одну или несколько нижеследующих аминокислотных последовательностей:

(а) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 28-39 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(b) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 77-88 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(с) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 126-136 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(d) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 163-175 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(е) аминокислотная последовательность, представленная аминокислотными остатками 304-311 SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:32;

(f) аминокислотная последовательность, которая на 75% или более, предпочтительно на 85% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще предпочтительнее на 95% или более идентична одной из аминокислотных последовательностей, приведенных выше в пунктах (а)-(е).

Фермент липидацилтрансфераза по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, полученную путем экспрессии одной или нескольких нижеследующих нуклеотидных последовательностей:

(а) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:7 (см. фигуру 9);

(b) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:8 (см. фигуру 10);

(с) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:9 (см. фигуру 11);

(d) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:10 (см. фигуру 12);

(е) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:11 (см. фигуру 13);

(f) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:13 (см. фигуру 15);

(g) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:21 (см. фигуру 17);

(h) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:23 (см. фигуру 19);

(i) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:25 (см. фигуру 21);

(j) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:27 (см. фигуру 23);

(k) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:29 (см. фигуру 25);

(l) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:31 (см. фигуру 27);

(m) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:33 (см. фигуру 29);

(n) нуклеотидная последовательность, представленная SEQ ID NO:35 (см. фигуру 31);

(o) или нуклеотидная последовательность, которая на 75% или более идентична одной из последовательностей, представленных SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:35.

Нуклеотидная последовательность может быть на 80% или более, предпочтительно на 85% или более, предпочтительнее на 90% или более и еще предпочтительнее н