Пшеница с модифицированной активностью ветвящего фермента, а также полученные из нее крахмал и крахмалсодержащие продукты

Пшеница с модифицированной активностью ветвящего фермента, а также полученные из нее крахмал и крахмалсодержащие продукты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-135359RU/092

ПШЕНИЦА С МОДИФИЦИРОВАННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ВЕТВЯЩЕГО ФЕРМЕНТА,

А ТАКЖЕ ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ НЕЕ КРАХМАЛ И КРАХМАЛСОДЕРЖАЩИЕ ПРОДУКТЫ

ОПИСАНИЕ

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к растению пшеницы, зерно которой содержит крахмал с высоким содержанием амилозы. Настоящее изобретение также относится к пшенице со сниженной активностью крахмал-ветвящего фермента IIа (SBEIIa) в эндосперме и к способам получения таких растений. Кроме того, настоящее изобретение относится к зерну, а также к крахмалу и к пищевым и непищевым продуктам, полученным из этого зерна.

Предшествующий уровень техники

Содержание крахмала в зерне составляет приблизительно 45-65% от всей массы зрелого зерна. Крахмал состоит из молекул двух типов, амилозы и амилопектина. Амилоза представляет собой, в основном, линейную молекулу, состоящую из глюкозидных цепей, соединенных α-1,4-связью, а амилопектин представляет собой в высокой степени разветвленную молекулу, имеющую линейные цепи, соединенные α-1,6-глюкозидными связями.

Синтез крахмала в эндосперме высших растений осуществляется рядом ферментов, которые катализируют четыре ключевые стадии. В первой стадии АDP-глюкозопирофосфорилаза активирует мономерный предшественник крахмала путем синтеза ADP-глюкозы из G-1-Р и АТР. Во второй стадии активированный глюкозильный донор, ADP-глюкоза, переносится крахмал-синтазами на невосстанавливающий конец уже существующей α1-4-связи. На третьей стадии, крахмал-ветвящие ферменты вводят точки ветвления путем расщепления области α-1,4-связанного глюкана с последующим переносом отщепленной цепи на акцепторную цепь с образованием новой α-1,6-связи. Крахмал-ветвящими ферментами являются лишь те ферменты, которые могут вводить α-1,6-связи в α-полиглюканы, а поэтому они играют важную роль в образовании амилопектина. И, наконец, крахмал-деветвящие ферменты удаляют некоторые из указанных связей в точке ветвления, хотя механизм такого удаления пока еще неясен (Myers et al., 2000).

Хотя очевидно, что для нормального синтеза крахмальных гранул в высших растениях необходимы, по крайней мере, эти четыре активности, однако, в эндосперме высших растений было обнаружено множество изоформ каждой из указанных четырех активностей, и исходя из анализа мутаций (Wang et al., 1998, Buleon et al., 1998) или из анализа, проводимого путем модификации уровней экспрессии гена с использованием трансгенной технологии (Abel et al., 1996, Jobling et al., 1999, Scwall et al., 2000), было высказано предположение, что каждая отдельная изоформа играет определенную роль в этом синтезе. Однако конкретная роль каждой изоформы в активности каждого фермента, участвующего в биосинтезе крахмала, пока неизвестна, а также неизвестно, имеют ли эти роли заметные отличия для разных видов. В эндосперме зерновых присутствуют две изоформы ADP-глюкозопирофосфорилазы, одна из которых находится в амилопласте, а другая в цитоплазме (Denyer et al., 1996, Thorbjornsen et al., 1996). Каждая форма состоит из субъединиц двух типов. Мутанты, приводящие к морщинистости, (sh2), и хрупкости, (bt2), зерна кукурузы, имеют повреждения в большой и малой субъединицах соответственно (Giroux & Hannah, 1994). В эндосперме зерна были обнаружены крахмал-синтазы четырех классов: изоформа, которая локализуются исключительно в крахмальной грануле, а именно гранулоассоциированная крахмал-синтаза (GBSS); две формы, которые распределяются между крахмальной гранулой и растворимой фракцией (SSI, Li et al., 1999a, SSII, Li et al., 1999b), и четвертая форма, которая целиком локализуется в растворимой фракции SSIII (Cao et al., 2000, Li et al., 1999b, Li et al., 2000). Было показано, что GBSS играет главную роль в синтезе амилозы (Shure et al., 1983), и было показано, что мутации в SSII и SSIII приводят к изменению структуры амилопектина (Gao et al., 1998, Craig et al., 1998). При этом не были описаны какие-либо мутации, которые играли бы определяющую роль в SSIII-активности.

В эндосперме зерновых экспрессируются три формы ветвящего фермента, а именно ветвящий фермент I (SBEI), ветвящий фермент IIа (SBEIIa) и ветвящий фермент IIb (SBEIIb) (Hedman & Boyer, 1982, Boyer & Preiss, 1978, Mizuno et al., 1992, Sun et al., 1997). Геномные последовательности и кДНК-последовательности были охарактеризованы для риса (Nakamura & Yamanouchi, 1992), кукурузы (Baba et al., 1991, Fisher et al., 1993; Gao et al., 1997) и пшеницы (Repellin et al., 1997; Nair et al., 1997; Rahman et al., 1997). Сравнение этих последовательностей путем выравнивания показало высокую степень их сходства как на нуклеотидном, так и на аминокислотном уровне, и позволило сгруппировать эти ферменты в классы SBEI, SBEIIa и SBEIIb. Последовательности SBEIIa и SBEIIb обнаруживают примерно 80%-ную идентичность друг с другом, а в частности, в центральных областях генов. SBEIIa и SBEIIb могут также отличаться по типу их экспрессии. В общих чертах, SBEIIb специфически экспрессируется в эндосперме, тогда как SBEIIa присутствует во всех тканях растения.

В эндосперме пшеницы SBEI (Morell et al., 1997) обнаруживается исключительно в растворимой фракции, тогда как SBEIIa и SBEIIb обнаруживаются как в растворимой фракции, так и во фракции, ассоциированной с крахмальными гранулами (Rahman et al., 1995). Было показано, что в кукурузе и в рисе продуцирование фенотипов с высоким содержанием амилозы обусловлено повреждением гена SBEIIb, известного так же как ген-удлинитель амилозы (ае), (Boyer & Preiss, 1981, Mizuno et al., 1993; Nishi et al., 2001). В этих мутантах по гену SBEIIb крахмальные гранулы в эндосперме обнаруживают аномальную морфологию со значительно повышенными содержанием амилозы, при этом уровень ветвления остаточного амилопектина был ниже, а также было снижено количество коротких цепей (<DP17, а особенно DР8-12). Кроме того, температура желатинизации крахмала увеличивалась. Более того, имеется значительный пул материала, который был определен как “интермедиат”, то есть промежуточный продукт между амилозой и амилопектином (Boyer et al., 1980, Takeda et al., 1993b). В отличие от этого, растения кукурузы, имеющие мутацию в гене SBEIIa, вызванную инсерционным элементом гена-мутатора (Мu), а поэтому не экспрессирующие белок SBEIIa, не отличались от растений дикого типа с точки зрения ветвления крахмала в эндосперме (Blauth et al., 2001), хотя они отличались по крахмалу в листьях. Аналогичным образом, в растениях риса, дефицитных по активности SBEIIa, не наблюдалось значимого изменения профиля амилопектиновой цепи в эндосперме (Nakamura 2002). В этих растениях кукурузы и риса гены SBEIIa и SBEIIb не были сцеплены в геноме.

В кукурузе мутация dull1 приводит к снижению содержания крахмала и к увеличению уровней амилозы в эндосперме, где степень изменения зависит от генетического фона, а также к повышению уровня ветвления в остаточном амилопектине (Shannon & Garwood, 1984). Ген, соответствующий мутации, был идентифицирован и выделен с применением стратегии транспозонного мечения транспозоном-мутатором (Мu), и было показано, что он кодирует фермент, называемый крахмал-синтазой II (SSII) (Gao et al., 1998). У зерновых этот фермент в настоящее время известен как член семейства SSIII (Li et al., 2003). Мутантный эндосперм имел пониженные уровни SBEIIa-активности, ассоциированной с dull1-мутацией. В других зерновых культурах о какой-либо аналогичной мутации не сообщалось. Неизвестно, относятся ли эти данные к другим зерновым культурам, например к пшенице.

В WO 94/09114 было высказано предположение об возможности использования смысловых и антисмысловых генов для изменения природных соотношений крахмал-синтазы (SS) и SBE в кукурузе. Однако там не было представлено каких-либо данных, подтверждающих предложенные молекулярные стратегии, и не было высказано предположения о специфическом снижении активности SBEIIa.

В картофеле регуляция по типу обратной связи лишь одного гена SBEI оказывает минимальное влияние на структуру крахмала (Flipse et al., 1996), хотя в другой работе были идентифицированы некоторые качественные изменения (Safford et al., 1998). Однако в картофеле ингибирование комбинации генов SBEII и SBEI приводило к гораздо большему увеличению относительного содержания амилозы, чем ингибирование лишь одного SBEII (Schwall et al., 2000).

В высших растениях присутствуют деветвящие ферменты двух типов, определенных по их специфичности к субстрату, а именно деветвящие ферменты типа изоамилазы и деветвящие ферменты типа пуллуланазы (Myers et al., 2000). Мутации Sugary-1 в кукурузе и рисе ассоциированы с дефицитом обоих деветвящих ферментов (James et al., 1995, Kubo et al., 1999), однако являющаяся причинной мутация была картирована в том же положении, что и ген деветвящего фермента изоамилазного типа. Репрезентативные гены биосинтеза крахмала, которые были клонированы из зерновых культур, перечислены в таблице 1.

Таблица 1 Гены крахмал-ветвящих ферментов, охарактеризованные для зерновых культур
Вид	Изоформа SBE	Тип клона	Рег. №	Литература
Кукуруза	SBEI	кДНК	U17897	Fisher et al., 1995
геномная	AF072724	Kim et al., 1998а
SBEIIb	кДНК	L08065	Fisher et al., 1993
геномная	AF072725	Kim et al., 1998
SBEIIa	кДНК	U65948	Gao et al., 1997
Пшеница	SBEII	кДНК	Y11282	Nair et al., 1997
SBEI	кДНК и геномная	AJ237897 (SBEI ген) AF002821 (SBEI псевдоген)AF076680(SBEI ген)AF076679(SBEI кДНК)	Baga et al., 1999Rahman et al., 1997Rahman et al., 1999
SBEI	кДНК	Y12320	Repellin et al., 1997
SBEIIa	кДНК и геномная	AF338432 (кДНК)	Rahman et al., 2001
SBEIIb	кДНК и геномная	AF338431 (ген)	Wo 01/62934
SBEIIb	кДНК		Wo 00/15810
Рис	SBEI	кДНК	D10752	Nakamura andYamanouchi, 1992
SBEI	геномная	D10838	Kawasaki et al., 1993
RBE3	кДНК	D16201	Mizuno et al., 1993
Ячмень	SBEIIa и SBEIIb	кДНК и геномная	AF064563 (SBEIIb ген)AF064561 (SBEIIb кДНК)AF064562(SBEIIa ген)AF064560 (SBEIIa кДНК)	Sun et al., 1998

Крахмал широко используется в пищевой, бумажной и химической промышленности. Физическая структура крахмала может оказывать значительное влияние на питательные и технологические свойства крахмала, используемого для производства пищевых или непищевых продуктов или промышленных изделий. Некоторые характеристики могут быть использованы как показатели структуры крахмала, включая распределение длин амилопектиновой цепи, степень и тип кристалличности и такие свойства, как температура желатинизации, вязкость и объем набухания. Изменения длины амилопектиновой цепи может служить показателем изменения кристалличности, желатинизации или деградации амилопектина.

Состав крахмала, а в частности формы, называемой резистентным крахмалом, которая может быть ассоциирована с высоким содержанием амилозы, имеет важное значение для нормальной работы кишечника, а в частности толстого кишечника. В соответствии с этим, высокоамилозные крахмалы были продуцированы в некоторых зерновых, таких как кукуруза, в целях их применения в пищевых продуктах, которые могут употребляться как средства стимуляции нормальной работы кишечника. Благоприятные эффекты резистентного крахмала обусловлены его поступлением в качестве питательного вещества в толстый кишечник, где кишечная микрофлора обеспечивается энергетическим источником, который позволяет ферментацию с образованием inter alia короткоцепочечных жирных кислот. Эти короткоцепочечные жирные кислоты обеспечивают питательными веществами колоноциты, усиливают усвоение некоторых питательных веществ толстым кишечником и стимулируют физиологическую активность толстой кишки. В общих чертах, если резистентные крахмалы или другие пищевые волокна не поступают в толстую кишку, то она становится относительно метаболически неактивной.

Хотя химически или как-либо иначе модифицированные крахмалы могут быть использованы для приготовления пищевых продуктов, обеспечивающих функциональные свойства, которые не могут нормально обеспечиваться немодифицированными источниками, однако такая обработка имеет тенденцию либо к изменению ценных качеств других компонентов, либо к сообщению нежелательного вкуса из-за процессов, участвующих в модификации. Поэтому в пищевых продуктах предпочтительно использовать источники компонентов, которые могут быть использованы в немодифицированных формах.

Каждый год, во всем мире, пшеницы выращивается больше, чем какой-либо другой зерновой культуры. Известные изменения структуры крахмала пшеницы, по сравнению с изменениями, наблюдаемыми в кукурузе или рисе, имеют ограничения, отчасти из-за эффективности трансформации пшеницы, которая происходит с запаздыванием по сравнению с другими зерновыми, а также из-за гексаплоидной природы хлебопекарной пшеницы. Присутствие трех геномов в Triticum aestivum дает тормозящий эффект благодаря маскировке мутаций в отдельных геномах в отличие от более легко идентифицируемых мутаций у диплоидных видов. Мутации в SBEIIb, соответствующие фенотипам удлинения амилозной цепи у кукурузы и риса, не были охарактеризованы у пшеницы. У пшеницы фенотип, сообщаемый мутациями SBEIIa и SBEIIb, пока неизвестен. Известными мутантами являются мутанты по гену waxy (GBSS, Zhao & Sharp, 1998) и мутант, у которого полностью отсутствует белок SGP-1 (Yamamori et al., 2000), продуцируемый при скрещивании линий, у которых отсутствуют специфические геномные формы А, В и D белка SGР-1 (SSII), как было определено путем электрофореза белков. Оценка семян, не содержащих SSII, показала, что данная мутация приводит к изменению амилопектиновой структуры, к деформации крахмальных гранул и к повышению относительного содержания амилозы в крахмале приблизительно на 30-37%, что примерно на 8% превышает уровни дикого типа (Yamamori et al., 2000). Уровень амилозы измеряют с помощью калориметрического анализа, амперометрического титрования (оба эти анализа основаны на связывании с йодом) и методом с использованием конканавалина А. Крахмал, полученный от мутанта, не содержащего SSII, обнаруживал пониженную температуру желатинизации по сравнению с крахмалом, полученным от эквивалентного немутантного растения. Содержание крахмала было снижено на 60% по сравнению с растением дикого типа и ниже на менее 50% по сравнению с растениями, зерно которых не содержало SSII.

В WO 99/14314 описано выделение гена SBEIIa из Aegilops tauschii, диплоидного растения, родственного пшенице, но не сообщалось о продуцировании пшеницы с модифицированнм крахмалом.

В WO 00/15810 описано клонирование кДНК гена SBEIIb пшеницы. В результате такого клонирования на было получено растений пшеницы с измененными уровнями амилозы и не сообщалось, что полученная пшеница имела крахмал, содержащий, по крайней мере, 50% амилозы.

В WO 01/62934 также описан ген SBEIIb пшеницы и было предложено вводить ингибиторы активности ветвящего фермента в растение пшеницы, но не сообщалось, что полученная пшеница имела крахмал, содержащий, по крайней мере, 50% амилозы.

В WO 01/32886 охарактеризована кДНК, кодирующая форму SBEI в эндосперме пшеницы. Было обнаружено, что кодируемый полипептид преимущественно ассоциирован с крахмальными гранулами А-типа. При этом активность SBEI не подавлялась и не было обнаружено изменения морфологии крахмальных гранул или повышения уровня амилозы в пшенице.

Отсюда следует, что в настоящее время отсутствуют какие-либо данные о получении пшеницы, содержащей крахмал с уровнем амилозы примерно более чем 50%. Хотя известны высокоамилозные сорта кукурузы и ячменя, однако продукты, полученные из этих зерновых культур, имеют определенные недостатки по сравнению с высокоамилозными продуктами из пшеницы, которая является предпочтительной зерновой культурой, например, для выпекания хлеба и изготовления макаронных изделий (пасты) или лапши.

Хотя высокоамилозные крахмалы таких типов являются ценными продуктами, однако, пшеничный крахмал с повышенным содержанием амилозы является предпочтительным, а особенно, если он ассоциируется с более легким синтезом и другими характеристиками, такими как, например, меньшая потребность в модификации после сбора урожая. Такие продукты крахмала также являются относительно устойчивыми к разложению и более полезны для здоровья.

Общее описание

Для каждого специалиста очевидно, что в описанное здесь изобретение могут быть внесены изменения и модификации, конкретно не описанные в настоящей заявке. Следует отметить, что описанное здесь изобретение включает все указанные варианты и модификации. Настоящее изобретение также включает все стадии, признаки, композиции и соединения, взятые отдельно или вместе и относящиеся к настоящему описанию или указанные в настоящем описании, а также любые и все комбинации любой из двух или более из указанных стадий или признаков.

Используемый в настоящем описании термин “включают” и его варианты “содержит” или “содержащий”, если в контексте не указано иначе, означает включение установленного целого элемента или стадии, либо группы элементов или стадий, но не исключает присутствие любого другого элемента или стадии, либо группы элементов или стадий. Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными описанными вариантами, которые приводятся лишь в иллюстративных целях. Очевидно, что в объем описанного здесь настоящего изобретения входят функционально эквивалентные продукты, композиции и способы.

Подробная библиография публикаций, представленная заявителями в настоящем описании, приводится в конце описания. Упомянутые здесь работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание в качестве ссылки. Предшествующие работы, включая любой один или несколько предшествующих документов, не должны восприниматься как подтверждение или предположение, то есть указанный известный уровень техники представляет собой лишь общедоступные сведения, известные в Австралии, или составляют часть таких общедоступных сведений, известных в Австралии.

Используемый здесь термин “происходит от” указывает на то, что данный конкретный элемент или группа таких элементов происходит от конкретных видов, однако, это не означает, что они должны быть обязательно получены непосредственно от данного конкретного источника.

Обозначение упомянутых здесь нуклеотидных остатков соответствует обозначениям, рекомендованным Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB, где А означает аденин, С означает цитозин, G означает гуанин, Т означает тимидин.

Описание сущности изобретения

В своем первом аспекте, настоящее изобретение относится к зерну, полученному из растения пшеницы, где содержание амилозы в крахмале данного зерна составляет, по крайней мере, 50%. Это растение пшеницы может иметь пониженный уровень экспрессии гена SBEIIa и активности фермента SBEIIa или того и другого, а предпочтительно, пониженный уровень экспрессии и гена SBEIIa, и гена SBEIIb, и пониженный уровень активности этих ферментов или то и другое. Указанное зерно может включать генетическую модификацию, которая представляет собой либо мутацию гена SBEIIa, которая ингибирует экспрессию гена SBEIIa, активность фермента или то и другое, либо встроенную нуклеиновую кислоту, которая ингибирует экспрессию гена SBEIIa, активность фермента или то и другое. Кроме того, указанное зерно может содержать аналогичную генетическую модификацию в SBEI. Такое зерно, кроме того, может иметь измененный уровень белка и/или активности фермента, выбранного из группы, состоящей из ADP-глюкозопирофосфорилазы, GBSS, SSI, SSII, SSIII, деветвящего фермента типа изоамилазы и деветвящего фермента типа пуллуланазы. Такое зерно может содержать трансген, и этот трансген может кодировать антисмысловую, ко-суппрессорную, рибозимную или дуплексную молекулу РНК. Наличие такого трансгена, предпочтительно, приводит к снижению уровня экспрессии мРНК, кодирующей SBEIIa. Указанное зерно может содержать мутацию в гене SBEIIa, а в одном из вариантов оно может содержать молчащую мутацию (нуль-мутацию) гена SBEIIa, по крайней мере, в одном геноме, и может содержать молчащую мутацию гена в двух или трех геномах. Содержание амилозы в крахмале указанного зерна может составлять, по крайней мере, 40%, 50%, 55%, 60%, 70% или 80%. В другом варианте, по крайней мере, 50% крахмальных гранул в зерне являются недвоякопреломляющими при их наблюдении в поляризованном свете. Указанное зерно может быть неморщинистым, и его средняя масса может составлять, по крайней мере, 36 мг или 40 мг. В альтернативном варианте, содержание крахмала в чистом виде составляет, по крайней мере, 25% (мас./мас.) или, по крайней мере, 35% (мас./мас.), тогда как в зерне дикого типа содержание крахмала может составлять, по крайней мере, 90%. Это зерно может представлять собой целое, шелушенное, помолотое, битое, плющенное, обрушенное, дробленое или опаленное зерно.

В другом варианте своего первого аспекта, настоящее изобретение относится к зерну, полученному из пшеницы, где указанное зерно содержит крахмал и его генетическую модификацию, которая приводит к снижению уровня экспрессии гена SBEIIa, активности фермента SBEIIa в эндосперме или того и другого, по сравнению с зерном дикого типа, и которая содержит мутацию гена SBEIIa или встроенную нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибитор экспрессии гена SBEIIa, где содержание амилозы в крахмале указанного зерна составляет, по крайней мере, 30%.

Во втором своем аспекте, настоящее изобретение относится к продукту помола, полученному из зерна первого аспекта изобретения, включая, но не ограничиваясь ими, муку, муку из цельного зерна, крупку или крахмал, полученные из зерна настоящего изобретения, или пищевые продукты, включающие указанную муку, муку из цельного зерна, крупку или крахмал, либо раскатанные, плющенные или прессованные зерновые продукты. Таким продуктом может быть мука, мука из цельного зерна, крупка или крахмал, полученные из зерна первого аспекта настоящего изобретения, смешанного с мукой, мукой из цельного зерна, крупкой или крахмалом, полученными из другого источника.

В своем третьем аспекте, настоящее изобретение относится к крахмальным гранулам или к крахмалу, полученному из зерна пшеницы первого аспекта изобретения. В конкретном варианте третьего аспекта изобретения, растения пшеницы, кроме того, имеют пониженный уровень активности фермента SBEIIa в эндосперме.

В четвертом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей крахмал третьего аспекта настоящего изобретения и пищевые ингредиенты или воду. Этот аспект включает пищевые продукты и непищевые композиции и смесь крахмала с другими видами крахмала или крахмалсодержащими продуктами.

В своем пятом аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей крахмальные гранулы четвертого аспекта изобретения, описанного выше, и другой пищевой ингредиент или воду.

В своем шестом аспекте, настоящее изобретение относится к растению пшеницы, которое может быть использовано для получения зерна или крахмальных гранул или крахмала в соответствии с предыдущими аспектами. Такое растение пшеницы может быть трансгенным или нетрансгенным, либо оно может продуцировать трансгенное или нетрансгенное зерно.

В своем седьмом аспекте, настоящее изобретение относится к способу выращивания растения пшеницы, продуцирующего зерно, где указанный способ включает стадии: i) введения генетической модификации в родительское растение пшеницы или в его зерно, и ii) идентификации потомства растения или семян родительского растения пшеницы или его семян, которые имеют пониженный уровень экспрессии гена SBEIIa, активности фермента SBEIIa в эндосперме или того и другого по сравнению с растениями или семенами дикого типа, где указанное зерно содержит крахмал, и где содержание амилозы в указанном крахмале зерна составляет, по крайней мере, 50%.

Во втором варианте своего седьмого аспекта, настоящее изобретение относится к способу выращивания растения пшеницы, продуцирующего зерно, где указанный способ включает стадии: i) введения генетической модификации в родительское растение пшеницы или в его зерно, где указанная генетическая модификация содержит мутацию гена SBEIIa или встроенную нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибитор экспрессии гена SBEIIa, и ii) идентификации потомства растения или семян родительского растения пшеницы или его семян, которые имеют пониженный уровень экспрессии гена SBEIIa, активности фермента SBEIIa в эндосперме или того и другого по сравнению с растениями или семенами дикого типа, где указанное зерно содержит крахмал, содержание амилозы в котором составляет, по крайней мере, 30%. Указанная стадия введения генетической модификации может включать введение экзогенной нуклеиновой кислоты, экспрессирующей ингибитор экспрессии гена SBEIIa, или мутагенез родительского растения пшеницы.

В третьем варианте своего седьмого аспекта, настоящее изобретение относится к способу выращивания растения пшеницы, продуцирующей зерно, где указанный способ включает стадии: i) введения генетического варианта в родительское растение пшеницы или в его зерно, где указанная генетическая модификация содержит мутацию гена SBEIIa, и ii) идентификации потомства растения или семян родительского растения пшеницы или семян, которые имеют пониженный уровень экспрессии гена SBEIIa, активности фермента SBEIIa в эндосперме или того и другого по сравнению с зерном дикого типа, iii) введения генетической модификации в родительское растение пшеницы или зерно, где указанная генетическая модификация содержит мутацию гена SBEIIb, и iv) идентификации потомства растения или зерна родительского растения или зерна пшеницы, имеющих пониженный уровень экспрессии гена SBEIIb, активности фермента SBEIIa в эндосперме или того и другого по сравнению с зерном дикого типа; v) скрещивания растения, имеющего пониженный уровень экспрессии гена SBEIIa, активности фермента SBEIIa в эндосперме или того и другого с растением, имеющим пониженный уровень экспрессии гена SBEIIb, активности фермента SBEIIb в эндосперме, или того и другого; и идентификацию растения пшеницы, имеющего пониженный уровень экспрессии генов, активности ферментов SBEIIa и SBEIIb, а также и того и другого.

В четвертом варианте своего седьмого аспекта, настоящее изобретение относится к способу культивирования растения пшеницы, имеющего относительное содержание амилозы в крахмале зерна, по крайней мере, 50%, а предпочтительно, имеющего пониженную активность фермента SBEIIa в эндосперме, где указанный способ предусматривает: а) идентификацию растения или зерна пшеницы, имеющего пониженную активность фермента SBEIIa, экспрессируемого из генома пшеницы А, В или D; и b) скрещивание указанного растения пшеницы или растения пшеницы, выращенного из зерна стадии (а), со вторым растением пшеницы, имеющим пониженную активность фермента SBEIIa; или с) скрещивание растения, имеющего пониженную активность фермента SBEIIa, с растением пшеницы, имеющим пониженную активность фермента SBEIIb; и идентификацию растения пшеницы, имеющего пониженную активность ферментов SBEIIa и SBEIIb. Предпочтительным растением седьмого аспекта является Triticum aestivum ssp. aestivum.

В своем восьмом аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного крахмала, предусматривающего модификацию растения способом, определенным выше, и экстракцию крахмала, имеющего измененные свойства.

В своем девятом аспекте, настоящее изобретение относится к способу идентификации растения пшеницы или его зерна по мутации в гене SBEIIa или в гене SBEIIb, где указанный способ включает стадии скрининга популяции растений пшеницы или его зерна с использованием молекулярного маркера, присоединенного к гену SBEIIb, или к гену SBEIIa пшеницы, соответственно, и к способу идентификации растения или зерна на присутствие или отсутствие указанного присоединенного молекулярного маркера.

Во втором варианте своего девятого аспекта, настоящее изобретение относится к способу идентификации растения пшеницы или его зерна на мутацию в гене SBEIIa или в гене SBEIIb, где указанный способ включает стадии скрининга популяции растений пшеницы или его зерна с использованием антитела, которое является специфическим к белку SBEIIb, или к белку SBEIIa пшеницы, соответственно, и к способу идентификации растения или зерна на наличие или отсутствие связывания с антителом.

В своем десятом аспекте, настоящее изобретение относится к зерну, полученному от растения пшеницы и содержащему мутацию, где ген SBEIIa отсутствует в длинном плече хромосомы 2А, или где ген SBEIIa, присутствующий на длинном плече хромосомы 2А, содержит мутацию, приводящую к снижению уровня белка SBEIIa, активности фермента SBEIIa или того и другого, в эндосперме указанного зерна по сравнению с зерном дикого типа. Такая мутация может быть нуль-мутацией гена SBEIIa, либо она может представлять собой делецию, по крайней мере, части гена SBEIIa. Указанное зерно может, кроме того, содержать мутацию, где ген SBEIIb отсутствует в длинном плече хромосомы 2А, или где ген SBEIIb, присутствующий на длинном плече хромосомы 2А, содержит мутацию, приводящую к снижению уровня белка SBEIIb, активности фермента SBEIIb или того и другого в эндосперме указанного зерна по сравнению с зерном дикого типа. Делеция может прекращать экспрессию генов SBEIIa и SBEIIb на длинном плече хромосомы 2А.

Указанным растением может быть растение твердой пшеницы сорта дурум (durum), которое может дополнительно содержать генетическую модификацию, приводящую к снижению активности крахмал-ветвящего фермента, кодируемого геном SBEIIa на длинном плече хромосомы 2В по сравнению с зерном дикого типа. Другой генетической модификацией может быть делеция гена SBEIIa на длинном плече хромосомы 2В или мутация гена SBEIIa на длинном плече хромосомы 2В, приводящее к снижению активности фермента SBEIIa в эндосперме указанного зерна по сравнению с зерном дикого типа.

Растением может быть Triticum aestivum ssp. aestivum,, которое, вероятно, дополнительно содержит генетическую модификацию, приводящую к снижению активности крахмал-ветвящего фермента, кодируемого геном SBEIIa на длинном плече(ах) хромосомы 2В, хромосомы 2D или обеих хромосомах, по сравнению с зерном дикого типа. Другой генетической модификацией может быть делеция гена SBEIIa, по крайней мере, в одной из указанных хромосом, или мутация гена SBEIIa, по крайней мере, в одной из указанных хромосом, которые приводят к снижению активности фермента SBEIIa в эндосперме указанного зерна по сравнению с зерном дикого типа.

Данное растение может иметь встроенную нуклеиновую кислоту, кодирующую ингибитор экспрессии гена SBEIIa, его активности или того и другого. Уровень активности фермента SBEIIa может быть снижен, по крайней мере, на 40% по сравнению с уровнем ферментов в зерне дикого типа. Содержание амилозы в крахмале такого зерна может составлять, по крайней мере, 30% или, по крайней мере, 50%. Указанное зерно может быть неморщинистым, и его средняя масса может составлять, по крайней мере, примерно 36 мг. По крайней мере, 50% крахмальных гранул в указанном зерне могут быть недвоякопреломляющими при их наблюдении в поляризованном свете. В одном из вариантов изобретения, содержание крахмала в очищенных зернах составляет, по крайней мере, 25% (мас./мас.) или, по крайней мере, 90% от содержания крахмала в зерне дикого типа.

Амилопектин, присутствующий в зерне по любому варианту настоящего изобретения, может содержать пониженный уровень фракции dp (D-пиранозы) с длинной цепи 4-12 звеньев, по сравнению с амилопектином зерна дикого типа, как было измерено после деветвления амилопектина изоамилазой.

Кроме того, указанное зерно может содержать пониженный уровень белка SBEI, активности фермента SBEI или того и другого, а также может содержать измененные уровни фермента по сравнению с зерном дикого типа, где указанный фермент выбран из группы, состоящей из ADP-глюкозопирофосфорилазы, GBSS, SSI, SSII, SSIII, деветвящего фермента типа изоамилазы и деветвящего фермента типа пуллуланазы и любой их комбинации.

Варианты десятого аспекта настоящего изобретения охватывают зерно; крахмальные гранулы, экстрагированные из зерна; а также продукты, продуцированные из этого зерна или его крахмала, такие как, например, мука, мука из цельного зерна или крупка.

Краткое описание графического материала

Фиг.1. Последовательность гена крахмал-ветвящего фермента IIа (wSBE II-D1)[SEQ ID NO:1] от A.tauschii, соответствующего гену SBEIIa генома D гексаплоидной пшеницы (T.aestivum).

Фиг.2. Неполная последовательность гена SBEIIb (геномная последовательность wbe2b)[SEQ ID NO:2] от T.aestivum.

Фиг.3. Схематические конструкции дуплексных РНК. А. Генные элементы располагаются в следующем порядке: промотор, последовательность гена SBEIIa или SBEIIb (экзоны 1, 2 и 3) в смысловой ориентации, интрон (интрон 3), последовательность гена SBEIIa или SBEIIb (экзоны 1, 2, 3 и 4) в антисмысловой ориентации, и последовательность терминатора транскрипции/полиаденилирования. В. Транскрипт генов ds-SBEIIa и ds-SBEIIb образует “шпилечную” РНК-структуру с двухцепочечной областью, образованной путем гибридизации между смысловой и антисмысловой последовательностями. Интронная последовательность, ограниченная нуклеотидами GТ и АG, вырезана.

Фиг.4. Крахмальные гранулы, наблюдаемые под оптическим микроскопом и происходящие от (А) семян пшеницы с крахмальными гранулами дикого типа, происходящими от ds-SBEIIa-трансгенной линии 83.1b, (В) семян пшеницы с деформированными крахмальными гранулами дикого типа, происходящими от ds-SBEIIa-трансгенной линии 50.1b.

Фиг.5. Двоякопреломление крахмальных гранул, происходящих от семян пшеницы, показанных на фиг.4, и визуализированных в поляризованном свете.

Фиг.6. Сравнение неполных кДНК-последовательностей SBEIIa пшеницы. sbe 9 соответствует части AF338432.1. Показаны нижеследующие неполные последовательности: Y1182 [SEQ ID NO:3], sr997 [SEQ ID NO:4], sr995 [SEQ ID NO:5], sbe9 [SEQ ID NO:6].

Фиг.7. Сравнение неполных последовательностей SBEIIa пшеницы для первых 63 аминокислот с использованием программы PILEUP. Указана предположительная локализация генома в генах, соответствующих клонам.

Фиг.8. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей полипептида D-генома (sr854)[SEQ ID NO:7] с продуктами генома А или В (у11282)[SEQ ID NO:8]. Перенесенная последовательность (положения 1-54) показана курсивом.

Фиг.9. ПЦР-амплификация области интрона 3 гена SBEIIb для различных линий пшеницы (дорожки 1-11) с использованием праймеров ARA19F и ARA23R после гидролиза ферментом Rsa1. Полосы, соответствующие геномам А, В и D, показаны стрелками. На дорожке 3 (Aus17340) и на дорожке 5 (Aus10103) отсутствует специфический маркер генома D, а на дорожке 8 (Aus12509) и дорожке 9 (Aus12565) отсутствует маркер генома В.

Фиг.10. Саузерн-гибридизация HindIII-гидролизованной ДНК линий пшеницы с использованием зонда от области интрона 3 гена SBEIIb. Дорожки соответствуют: 1) Aus12565, 2) Aus12509, 3) Aus10103, 4) CSDT2DL-4, 5) Aus12530 (пшеница дурум), 6) CSDT2BL-9, 7) Aus6323, 8) CSDT2DS, 9) Aus17340, 10) Aus12745, 11) CSDT2DL-4, 12) Aegilops tauschii.

Фиг.11. Скрининг популяции F2 кроссов Aus17340a X Aus12509 путем ПЦР-амплификации области интрона 3 гена SBEIIb с использованием праймеров AR2b19cF AR2b23cR с последующим расщеплением RsaI. На дорожке 8 отсутствуют маркеры геномов В и D, а поэтому линия ВD54 представляет собой линию BD, в которой отсутствуют два генома В и D.

Фиг.12. Саузерн-гибридизация HindIII- (дорожки 1-4) и EcoR1- (дорожки 5-8)-гидролизованных клонов ВАС с использованием зонда от области интрона 3 гена SBEIIb. Дорожки соответствуют: 1) ВАС4, 2) ВАС5, 3) ВАС9, 4) ВАС12, 5) ВАС4, 6) ВАС5, 7) ВАС9, 8) ВАС12.

Фиг.13. А) FISH с использованием зонда wSBEII-DА1 и зонда с повторяющейся ДНК-последовательностью (рSc 119.2) для хромосом A. tauschii (главная фотография и нижняя вставка) и для хромосом пшеницы (верхняя вставка). В) FISH зонда SBEIIb для хромосом пшеницы.

Фиг.14. SDS-ПААГ-анализ связанных с зернами белков в пшенице дикого типа сорта Китайская яровая (Chinese Spring) (СS) и в линиях пшеницы, не содержащих SGP-1, проводимый при нескольких указанных стадиях развития семян (10, 15, 25 дней после цветения, М=зрелый). Измеряли интенсивность полосы белка, визуализированной в окрашенном серебром геле. Интенсивность полосы GВSS в зрелых семенах СS нормализовали путем деления на 100, и количество других ферментов, продуцируемых в указанной стадии развития, выражали как процент GВSS в зрелой пшенице СS. а) GВSS, b) SSI, с) SBEII. Черные столбцы соответствуют отсутствию SGP-1. Представлен пример электрофоретограммы геля для связанных с зернами белков CS и линии, не содержащей SGP-1.

Фиг.15. Относительные количества SBEIIa и SBEIIb в растворимой фракци