Композиция для защиты свиней от инфекции ррсс-вируса (варианты) и вакцина, содержащая указанную композицию (варианты)

Композиция для защиты свиней от инфекции ррсс-вируса (варианты) и вакцина, содержащая указанную композицию (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены генетически модифицированный вирус РРСС и кодирующие его полинуклеотиды. Также предложены вакцины, содержащие генетически модифицированный вирус и полинуклеотиды.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Респираторно-репродуктивный синдром свиней (РРСС) характеризуется абортами, мертворождениями и другими репродуктивными проблемами у свиноматок и подсвинков, также как и респираторным заболеванием у молодых свиней. Возбудителем является РРСС-вирус, член семейства Arteriviridae и порядка Nidovirales. Два отдельных генотипа вируса появились почти одновременно в Северной Америке и Европе в конце 1980-х гг. Вирус РРСС в настоящее время эндемичен почти во всех странах, производящих свинину, и признан одним из наиболее экономически важных заболеваний, влияющих на глобальную индустрию свинины.

В настоящее время коммерческие вакцины против РРСС включают модифицированные живые и убитые (инактивированные) вакцины. Убитые вакцины были подвержены критике из-за неспособности вызвать надежный иммунитет против гетерологичных штаммов РРСС-вируса. Модифицированные живые вакцины аттенуируют до потери вирулентности серией пассажей в клеточной культуре. Модифицированные живые вакцины вызывают более широкую защиту, чем убитые вакцины, но могут страдать от нескольких факторов опасности, включая остаточную вирулентность, распространение на невакцинированных свиней и генетическую реверсию вирулентности. Из-за антигенных изменений, происходящих в процессе аттенуирования, такие вакцины также могут терять часть способности защищать от вирулентных полевых штаммов РРСС-вируса. Следовательно, имеется насущная необходимость в новых и улучшенных модифицированных живых вакцинах для защиты от РРСС.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1. (А) На графическом материале показано расположение и последовательность NLS мутации в белке нуклеокапсида Р129. (Б) Микрофотографии псевдоинфицированных, Р129-инфицированных и P129-GG-инфицированных клеток MARK-145. В верхнем ряду показаны типичные бляшки с применением фазовоконтрастной микроскопии, в то время как в нижнем ряду показано окрашивание флуоресцентными антителами инфицированных очагов с применением моноклонального антитела SDOW17, меченного флуоресцина изотиоцианатом (FITC). Следует отметить отсутствие окрашивания нуклеокапсида в ядрах и ядрышках Р129-СС-инфицированных клеток.

Фиг.2. (А) Количество свиней с вирусемией (7 свиней в группе) на 0-28 день после заражения по группам лечения. (Б) Средний титр вирусных частиц в сыворотке свиней на 0-28 день после заражения по группе лечения. (В) Средние уровни антител твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (S/P отношения) в сыворотке свиней на 0-28 день после заражения по группе лечения. (Г) Повторное титрование сыворотки, показанной на Фиг.2В, все образцы перед анализом были разбавлены 1:5 с целью лучшего выделения различий в образцах с высокими титрами. (Д) Средние сывороточные титры нейтрализующих антител у зараженных свиней в течение четырехнедельного исследования.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1 41-47 остатки N-белка североамериканского изолята VR 2332 РРСС-вируса (РРССВ)

SEQ ID NO:2 Последовательность NoLS-области VR2332

SEQ ID NO:3 Последовательность NoLS-области Lelystad

SEQ ID NO:4 NES-область изолята VR2332

SEQ ID NO:5 NES-область изолята Lelystad

SEQ ID NO:6 Аминокислотная последовательность N-белка изолята Р129

SEQ ID NO:7 Нукпеотидная последовательность ORF 7 (кодирует N-белок) изолята Р129

SEQ ID NO:8 Праймер Р SHUTTLE FWD

SEQ ID NO:9 Праймер P-SHUTTLE-REV

SEQ ID NO:10 Мутагенный Праймер KK43/44GG-Fwd

SEQ ID NO:11 Мутагенный праймер KK43/44GG-REW

SEQ ID NO:12 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области дикого типа (wt) P129

SEQ ID NO:13 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области wt P129

SEQ ID NO:14 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-GG

SEQ ID NO:15 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-GG

SEQ ID NO:16 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d43/44

SEQ ID NO:17 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d43/44

SEQ ID NO:18 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d43/44/46

SEQ ID NO:19 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d43/44/46

SEQ ID NO:20 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d44/46/47

SEQ ID NO:21 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d44/46/47

SEQ ID NO:22 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d46/47/48

SEQ ID NO:23 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d46/47/48

SEQ ID NO:24 P129-d43/44F

SEQ ID NO:25 P129-d43/44/46F

SEQ ID NO:26 P129-d44/46/47F

SEQ ID NO:27 P129-d46/47/48F

SEQ ID NO:28 P129-d43/44R

SEQ ID NO:29 P129-d43/44/46R

SEQ ID NO:30 P129-d44/46/47R

SEQ ID NO:31 P129-d46/47/48R

Цитированные ссылки

Doan D.N.P. and Dokland T. (2003). Structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Structure 11(11), 1445-1451.

Lee С., Calvert J. G., Welch S.-K. W. and Yoo D. (2005). A DNA-launched reverse genetics system for porcine reproductive and respiratory syndrome virus reveals that homodimerization of the nucleocapsid protein is essential for virus infectivity. Virology 331, 47-62.

Rowland R.R., Kervin R., Kuckleburg C., Sperlich A. and Benfield D.A. (1999). The localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus of infected cells and identification of a potential nucleolar localization signal sequence. Virus Research 64 (1), 1-12.

Rowland R.R.R., Schneider P., Fang Y., Wootton S., Yoo D. and Benfield D.A. (2003). Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus. Virology 316 (1), 135-145.

Rowland R.R.R. and Yoo D. (2003). Nucleolar-cytoplasmic shuttling of PRRSV nucleocapsid protein: a simple case of molecular mimicry or the complex regulation by nuclear import, nucleolar localization and nuclear export signal sequences. Virus Research 95 (1-2), 23-33.

Wootton S.K., Rowland R.R.R. and Yoo D. (2002). Phosphorylation of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein. Journal of Virology 76 (20), 10569-10576.

Wootton S.K. and Yoo D. (2003). Homo-oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages. Journal of Virology 77 (8), 4546-4557.

Yoo D., Wootton S.K., Li G., Song C. and Rowland R.R. (2003). Colocalization and interaction of the porcine arterivirus nucleocapsid protein with the small nucleolar RNA-associated protein fibrillarin. Journal of Virology 77 (22), 12173-12183.

Yoo D., Welch S.-K.W., Lee C. and Calvert J.G. (2004). Infectious clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors. Veterinary Immunology and Immunopathology 102, 143-154.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно изобретению предложен генетически модифицированный РРСС-вирус, который был модифицирован в пределах NLS-2-области, NoLS-области и/или NES-области белка нуклеокапсида (N-белка) так, что получившийся РРСС-вирус является аттенуированным. Согласно данному изобретению также предложена инфекционная молекула РНК, кодирующая генетически модифицированный вирус, и выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая последовательность ДНК, кодирующую описанную выше инфекционную молекулу РНК.

Согласно изобретению также предложена биологически чистая культура описанных вирусов (то есть по существу свободная от других вирусов) и описан вирусный вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую генетически модифицированный РРСС-вирус, описанный выше.

Согласно данному изобретению также предложена трасфицированная клетка-хозяин, содержащая любой из вирусов, инфекционных молекул РНК, выделенных полинуклеотидов или вирусных векторов, описанных выше.

Согласно данному изобретению также предложена вакцина для защиты свиньи от инфекции вируса РРСС, содержащая генетически модифицированный РРСС-вирус, описанный выше, инфекционную молекулу РНК, описанную выше, кодирующую генетически модифицированный РРСС-вирус, выделенную полинуклеотидную молекулу (возможно, в форме плазмиды), описанную выше, кодирующую генетически модифицированный РРСС-вирус, или описанный выше вирусный вектор, кодирующий генетически модифицированный РРСС-вирус, в количестве, эффективном для выработки иммунитета против инфекции вируса РРСС, и носитель, приемлемый для ветеринарного применения.

Согласно изобретению также предложены резистентные к реверсии мутации NLS-2. Предпочтительные воплощения изобретения, особенно в целях вакцины, будут содержать дополнительные нуклеотидные замены и/или делеции, сконструированные с целью минимизации вероятности реверсии и минимизации вероятности мутации других фланкирующих остатков к исходным остаткам, таким как лизин и аргинин, и, таким образом, восстановления функционального NLS-фрагмента данной области.

Согласно данному изобретению также предложен способ защиты свиньи от инфекции РРСС-вируса, включающий вакцинирование животного указанной выше вакциной в количестве, эффективном для выработки иммунитета против инфекции РРСС-вируса.

Согласно изобретению предложен способ получения генетически модифицированного РРСС-вируса, включающий мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, которая кодирует описанный выше РРСС-вирус, и экспрессию генетически модифицированного РРСС-вируса с применением подходящей системы экспрессии.

РРСС-вирус, или дикого типа, или генетически модифицированный может быть экспрессирован с выделенной полинуклеотидной молекулы с применением подходящих систем экспрессии, в общем известных в уровне техники, примеры которых описаны в данной заявке. Например, выделенная полинуклеотидная молекула может быть в форме плазмиды, способной экспрессировать кодируемый вирус в подходящей клетке-хозяине in vitro, как более подробно описано ниже.

Другие признаки изобретения станут ясными после обзора.

Подробное описание изобретения

Здесь авторы изобретения раскрывают способ аттенуирования вирулентного РРСС-вируса посредством мутации или делеции NLS-2 области, NoLS-области или NES-области в нуклеокапсиде или N-белке (кодируемом ORF7) указанного вируса, иммуногенную композицию, содержащую указанный аттенуированнный вирус, и способ защиты свиней от РРСС посредством вакцинации указанными иммуногенными композициями. РРСС-вирусы, аттенуированные этим способом, должны сохранять антигенные характеристики вирулентного полевого штамма и, следовательно, обеспечивать более мощную защиту, чем вакцины на основе вирусов, аттенуированных в клеточной культуре.

Белок нуклеокапсида (N-белок) РРСС-вируса (РРССВ), кодируемый ORF7, представляет собой небольшой фосфорилированный основной белок (Wootton, Rowland, and Yoo, 2002) и формирует гомодимеры (Wootton and Yoo, 2003). Недавно была определена кристаллическая структура (Doan and Dokland, 2003). По-видимому, N-белок выполняет множество функций в инфицированной клетке. Кроме формирования сферической структуры капсида, в которую упакована геномная РНК, процесса, имеющего место в цитоплазме, часть N-белка транспортируется в ядро, а именно в ядрышко инфицированной клетки. Аминокислотная последовательность N-белка содержит два сигнала ядерной локализации (NLS), сигнал ядрышковой локализации (NoLS) и сигнал ядерного экспорта (NES), способствующие транспорту в ядро и ядрышко и экспорту из ядра соответственно (Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland and Yoo, 2003). Находясь в ядрышке, N-белок взаимодействует с небольшим ядрышковым РНК-ассоциированным белком фибрилларином и может регулировать процессинг рРНК и биогенез рибосом в инфицированной клетке с целью поддержания репликации вируса (Yoo et al., 2003). В настоящем изобретении авторы изобретения показывают, что мутации и делеции в NLS-, NoLS- и NES-фрагментах N-белка могут приводить к образованию жизнеспособных вирусов с аберрантным ядерным транспортом, и что вирусы, содержащие такие мутации, полезны как вакцины против РРСС.

Вирусные мутации такого типа, сами по себе или в комбинации с другими аттенуирующими мутациями, ценны для разработки новых РРСС-вакцин.

Определения

«Эффективный иммунный ответ», «иммунитет» и подобные термины для целей настоящего изобретения обозначают иммунный ответ, направленный на один или более эпитопов патогена, для защиты вакцинируемого животного от инфекции, вызванной этим патогеном. В целях данного изобретения защита от инфекции, вызванной патогеном, включает не только абсолютное предупреждение инфекции, но также любое поддающееся обнаружению снижение степени или интенсивности инфекции, вызванной патогеном, или любое поддающееся обнаружению снижение тяжести заболевания или любого симптома или состояния, возникающего в результате инфекции, вызванной этим патогеном, у вакцинируемого животного в сравнении с невакцинированным зараженным животным. Эффективный иммунный ответ может быть вызван у животных, ранее не зараженных этим патогеном и/или не зараженных этим патогеном на момент вакцинации. Эффективный иммунный ответ может быть также вызван у животного, уже зараженного этим патогеном на момент вакцинации.

Генетически модифицированный РРСС-вирус является «аттенуированным», если он менее вирулентен, чем немодифицированный родительский штамм. Штамм «менее вирулентен», если он показывает статистически значимое снижение одного или более параметров, определяющих тяжесть заболевания. Такие параметры могут включать уровень вирусемии, лихорадку, тяжесть респираторного дистресс-синдрома, тяжесть репродуктивных симптомов или количество, или тяжесть поражений легких и так далее.

«Европейский РРСС-вирус» относится к любому штамму РРСС-вируса, имеющему генетические характеристики, ассоциированные с РРСС-вирусом, который был впервые выделен в Европе около 1991 г. (см., например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13: 121-130). «Европейский РРСС-вирус» в данной области техники иногда также называют «Lelystad-вирус».

«Генетически модифицированный», при использовании здесь, если не указано иначе, обозначает здесь генетически мутировавший в результате вмешательства человека, «мутировавший» обозначает замену одной аминокислоты на другую или замену одного кодирующего нуклеотида другим (например, С на Т), то есть так называемую «замену», предпочтительно меняющую кодируемую аминокислоту, или любую другую мутацию, такую как «делеция» или «инсерция». Мутацию всегда осуществляют в кодирующей нуклеотидной последовательности.

«Клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС-вируса», обозначает клеточную линию, способную генерировать инфекционный РРСС, будучи зараженной вирусом по изобретению. Такие клетки включают альвеолярные макрофаги свиней и производные альвеолярных макрофагов свиней, клетки МА-104 и производные клеток МА-104, клетки MARC-145 и производные клеток MARC-145, и клетки, трансфицированные рецептором РРСС-вируса. Особо предпочтительными для демонстрации фенотипа небольших бляшек по изобретению являются клетки MARC-145. Термин «клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС-вируса», может также включать клетки живой свиньи.

«Иммунный ответ» для целей этого изобретения обозначает продукцию антител и/или клеток (таких как Т-лимфоциты), направленных против определенного эпитопа или определенных эпитопов, или способствующих их деструкции или ингибированию.

«Североамериканский РРСС-вирус» обозначает любой РРСС-вирус, имеющий генетические характеристики, ассоциированные с изолятом североамериканского РРСС-вируса, такого как РРСС-вирус, который был впервые выделен в Соединенных Штатах около начала 1990-х гг. (см., например, Collins, J.E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126); изолят MN-1b североамериканского РРСС-вируса (Kwang J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6: 293-296); штамм Quebec IAF-exp91 PPCC (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405-1418); изолят VR 2385 североамериканского РРСС-вируса (Meng, X.-J. et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795-1801), но не ограничивается ими. Генетические характеристики относятся к сходству геномных нуклеотидных последовательностей и сходству аминокислотных последовательностей, общих для штаммов североамериканского РРСС-вируса.

«Открытая рамка считывания», или "ORF", при использовании здесь обозначает здесь минимальную нуклеотидную последовательность, требующуюся для кодирования определенного белка РРСС-вируса без промежуточного стоп-кодона.

«Свиной» и «свинья» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к любому животному, являющемуся членом семейства Suidae, такому как, например, свинья. Термин «РРСС-вирус», при использовании здесь, если не указано иначе, обозначает любой штамм североамериканского или европейского РРСС-вируса.

«РРСС» включает симптомы заболевания, вызванного РРСС-вирусной инфекцией, у свиней. Примеры таких симптомов включают, но не ограничены лихорадкой, абортом у беременных самок, респираторным дистресс-синдромом, поражениями легких, потерей аппетита и падежом молодых свиней. При использовании здесь РРСС-вирус, который «неспособен вызвать РРСС», относится к вирусу, который может заразить свинью, но не вызывает каких-либо симптомов заболевания, обычно ассоциированных с РРСС-инфекцией у свиней.

«N-белок» РРСС-вируса (РРССВ) или «ORF7», при использовании здесь, обозначает полипептид, кодируемый ORF7 как европейского, так и североамериканского генотипов РРСС-вируса. На данный момент известны следующие примеры специфических изотипов N-белка: полипептид из 123 аминокислот изолята VR2322 североамериканского РРСС прототипа, представленный в Genbank под инвентарными номерами PRU87392, и N-белок из 128 остатков изолята Lelystad европейского прототипа РРСС, представленный в Genbank под инвентарным номером А26843.

«NLS-1-область N-белка РРССВ» или «NLS-1-область ORF РРССВ» относится к сигналу ядерной локализации "pat4" или "nuc1" (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003), содержащему четыре постоянные основные аминокислоты (лизин или аргинин), или три основных остатка и гистидин или пролин, расположенных в пределах приблизительно первых 15 нетерминальных остатков зрелого М-белка. В качестве примера последовательность NLS-1-области VR2332 представляет собой KRKK и занимает 9-12 остатки, в то время как у изолята Lelystad последовательность представляет собой КККК и занимает 10-13 остатки М-белка.

«NLS-2-область N-белка РРССВ» или «NLS-2-область ORF РРССВ» относится ко второму сигналу ядерной локализации в пределах N-белка, который может принимать одну из двух форм. У североамериканских РРСС-вирусов NLS-2 имеет структуру, которую авторы изобретения обозначили как фрагмент "pat8", который начинается с пролина и в пределах трех остатков сопровождается последовательностью из пяти остатков, содержащей по меньшей мере три основных остатка (К или R) из пяти (незначительная модификация фрагмента "pat7" или "nuc2", описанных Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). В качестве примера такая последовательность занимает 41-47 остатки N-белка изолята VR2332 североамериканского РРССВ и представлена последовательностью PGKKNKKK (SEQ ID NO:1). NLS-2 европейских РРСС-вирусов имеет фрагмент "pat4" или "nuc1", который представляет собой непрерывный участок из четырех основных аминокислот или трех основных остатков, ассоциированных с гистидином или пролином (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). NLS-2 изолята Leiystad европейских РРССВ занимает 47-50 остатки и представлен последовательностью KKKK.

«NoLS-область N-белка РРССВ» или «NoLS-область ORF РРССВ» относится к сигналу ядрышковой локализации, имеющему общую длину приблизительно 32 аминокислоты и включающему NLS-2-область вблизи его N-конца. В качестве примера NoLS-область VR2332 занимает остатки 41-72 и представлена последовательностью PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSER (SEQ ID NO:2) (Rowland & Yoo, 2003), и соответствующая последовательность изолята Lelystad занимает 42-73 остатки и представлена последовательностью PRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTER (SEQ ID NO:3).

«NES-область N-белка РРССВ» или «NES-область ORF РРССВ» относится к сигналу ядерного экспорта, содержащему фрагмент LXL вблизи карбоксиконца N-белка. NES-фрагмент представляет собой X-R(2-5)-X-R2-X-R-Y, где Х представляет собой лейцин, изолейцин или валин, Y представляет собой лейцин, изолейцин, валин или аланин и R представляет собой любую аминокислоту. Как показано ниже, прототипные североамериканский и европейский изоляты соответствуют этой схеме, причем оба имеют спейсер из пяти остатков.

«Трансфицированная клетка-хозяин» обозначает практически любую клетку-хозяина, описанную в патенте США 5600662, которая, будучи трансфицированной РНК РРСС-вируса, способна продуцировать РРСС-вирионы первого цикла. При необходимости дальнейшего продуктивного заражения будет использована «клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС-вируса», как определено ниже.

Полинуклеотидные молекулы могут быть генетически мутированы с применением рекомбинантных технологий, известных специалистам в данной области, включая сайт-направленный мутагенез или неспецифический мутагенез, например воздействием химических мутагенов или радиацией, как известно в уровне техники. Указанные мутации могут быть осуществлены стандартными способами, известными в этой области техники, например сайт-направленным мутагенезом (см., например, Sambrook et at. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 (nd) ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) инфекционной копии, как описано (например, Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol, 1998, 440: 199-206).

В соответствии с этим, согласно данному изобретению, предложен способ получения генетически модифицированного североамериканского РРСС-вируса, включающий мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, кодирующую описанный выше РРСС-вирус, и экспрессию генетически модифицированного РРСС-вируса с применением подходящей системы экспрессии. Генетически модифицированный РРСС-вирус может быть экспрессирован с выделенной полинуклеотидной молекулой с применением подходящих систем экспрессии, в общем известных в уровне техники, примеры которых описаны в данной заявке. Например, выделенная полинуклеотидная молекула может быть представлена в форме плазмиды, способной экспрессировать кодируемый вирус в подходящей клетке-хозяине in vitro, как более подробно описано ниже.

Последовательности N-белка североамериканского РРССВ высококонсервативны и описанные последовательности имеют приблизительно 93-100% идентичность друг с другом. N-белки североамериканского и европейского РРССВ идентичны на приблизительно 57-59% и имеют общие структурные фрагменты.

В качестве примера последовательность NES-области VR2332 занимает 106-117 остатки и представлена последовательностью LPTHHTVRLIRV (SEQ ID NO:4) (Rowland & Yoo, 2003) и последовательность изолята Lelystad занимает 107-118 остатки и представлена последовательностью LPVAHTVRLIRV (SEQ ID NO:5).

Ниже, в консенсусе, включающем все последовательности в последовательностях североамериканского РРССВ в Genbank, положения, обозначенные (*), абсолютно консервативны. Альтернативные аминокислоты показаны под каждым положением.

LPTHHTVRLIRV (SEQ ID NO:4)

**VAQ******A

Q

V

G

Нумерация аминокислот, приведенная выше, соответствует упомянутым входным данным базы данных. Во всех других изолятах РРСС, которые могут быть пронумерованы по-другому, идентификацию нужных областей без труда осуществляли путем идентификации аминокислот с фиксированными характеристиками в интересующем штамме РРСС и их сопоставлении с эталонным штаммом. Задача данного изобретения состояла в том, чтобы модифицировать РРСС-вирус или кодирующие его нуклеиновые кислоты так, что одна или более чем одна консервативная область была элиминирована заменой, делецией или инсерцией, что привело бы к аттенуированному фенотипу.

Делеции, инсерции или замены, элиминирующие консервативный NLS-2-фрагмент, NoLS-фрагмент или NES-фрагмент, вводят модификацией полинуклеотидов в кодирующих вирусах по изобретению. В предпочтительном воплощении делеция или инсерция, включающая 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, приводит к элиминации консервативного фрагмента и приводит к аттенуированному вирусу.

Аминокислоты могут быть классифицированы по физическим свойствам и вкладу во вторичную и третичную структуру белка. В уровне техники консервативной заменой признают замену одной аминокислоты на другую аминокислоту со схожими свойствами. Типичные консервативные замены представлены в таблице 1 непосредственно ниже (из WO 97/09433, стр.10, опубликованной 13 марта, 1997 (PCT/GB96/02197, поданной 9/6/96)).

Таблица 1.
Консервативные замены I
ХАРАКТЕРИСТИКА БОКОВОЙ ЦЕПИ	АМИНОКИСЛОТА
Алифатические
	Неполярные	GAP
		ILV
	Полярные незаряженные	CSTM
		NQ
	Полярные заряженные	DE
	KR
Ароматические	HFWY
Прочие	NQDE

Альтернативно, консервативные аминокислоты могут быть сгруппированы, как это описано в Lehninger [Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77], как представлено непосредственно ниже в таблице 2.

Таблица 2.
Консервативные замены II
БОКОВАЯ ЦЕПЬ
ХАРАКТЕРИСТИКА	АМИНОКИСЛОТА
Неполярные (гидрофобные)
А. Алифатические:	ALIVP
Б. Ароматические:	FW
В. Серосодержащие:	М
Г. Пограничные:	G
Незаряженные полярные
А. Гидроксильные:	STY
Б. Амидные:	NQ
В. Сульфгидрильные:	С
Г. Пограничные:	G
Положительно заряженные	KRH
(основные):
Отрицательно заряженные (кислые)	DE

В качестве еще одной альтернативы типичные консервативные замены представлены непосредственно ниже в таблице 3.

Таблица 3.
Консервативные замены III
Исходный остаток	Типичная замена
Ala (A)	Val, Leu, Ile
Arg (R)	Lys, Gln, Asn
Asn (N)	Gln, His, Lys, Arg
Asp (D)	Glu
Cys (С)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
His (H)	Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe,
Leu (L)	Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K)	Arg, Gln, Asn
Met (M)		Leu, Phe, Ile
Phe (F)		Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P)		Gly
Ser (S)		Thr
Thr (T)		Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala

Получение генетически модифицированного РРСС-вируса

Генная инженерия включает очень разнообразные и эффективные молекулярно-биологические способы, направленные на модификацию нуклеиновых кислот на уровне ДНК, и делает возможным анализ и модификацию геномов на молекулярном уровне. В связи с этим вирусы, такие как РРСС-вирус, ввиду малого размера их генома особенно легко поддаются такого рода манипуляциям. Тем не менее, генная инженерия не является непосредственно применимой к РНК-вирусам, не относящимся к ретровирусам, поскольку репликация этих вирусов не включает промежуточную ДНК-стадию. Для таких вирусов, перед тем как генную инженерию можно будет применить к их геному для создания модифицированного вируса, должны быть произведены инфекционные кДНК-клоны. Инфекционные клоны могут быть получены конструированием полноразмерной (длина генома) кДНК изучаемого вируса (здесь используют в широком смысле ДНК-копии РНК, а не только в узком смысле ДНК-копии мРНК), после чего инфекционный транскрипт синтезируется in vivo в клетках, трансфицированных полноразмерной кДНК, однако инфекционные транскрипты могут также быть получены транскрипцией in vitro из лигированных in vitro фрагментов кДНК неполной длины, содержащих полный вирусный геном. В любом случае, транскрибированная РНК несет все модификации, введенные в кДНК, и может быть использована для дальнейшего пассажа модифицированного таким образом вируса.

Получение инфекционного клона изолята европейского РРСС-вируса или вируса Lelystad описано в патенте США №6268199, который полностью включен посредством ссылки. Получение инфекционного кДНК-клона изолята североамериканского РРСС-вируса, обозначенного Р129 (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004), описано в патенте США 6500662, который полностью включен посредством ссылки. Последовательность кДНК Р129 раскрыта в Genbank под инвентарным номером AF 494042 и в патенте США 6500662. Ниже в работе авторов изобретения применяется инфекционный клон, который в виде плазмиды экспрессируется немедленно-ранним промотором CMV-вируса (цитомегаловируса) и был обозначен pCMV-S-P129, и также раскрыт в патенте США 6500662. Как описано в патенте США 6500662, существуют другие плазмиды и промоторы, подходящие для применения в данном изобретении.

Зная полноразмерную последовательность любой интересующей открытой рамки считывания и расположение интересующего аминокислотного остатка, любому специалисту в данной области требуется лишь обратиться к таблице кодонов, чтобы сконструировать изменения в конкретном желаемом положении.

Таблица аминокислот и их типичных аббревиатур, символов и кодонов представлена в следующей таблице 4.

Таблица 4
Аминокислота	Аббревиатура	Символ	Кодон(ы)
Аланин	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Цистеин	Cys	С	UGC	UGU
Аспарагиновая кислота	Asp	D	GAC	GAU
Глутаминовая кислота	Glu	E	GAA	GAG
Фенилаланин	Phe	F	UUC	UUU
Глицин	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Гистидин	His	H	CAC	CAU
Изолейцин	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Лизин	Lys	K	AAA	AAG
Лейцин	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Метионин	Met	M	AUG
Аспарагин	Asn	N	AAC	AAU
Пролин	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Глутамин	Gln	Q	CAA	CAG
Аргинин	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Серин	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Треонин	Thr	Т	АСА	ACC	ACG	ACU
Валин	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Триптофан	Trp	W	UGG
Тирозин	Tyr	Y	UAC	UAU

Кодоны представляют собой триплетные последовательности нуклеотидов в мРНК и соответствующие им кДНК молекулы. Для кодонов характерно основание урацил (U), когда они присутствуют в молекуле мРНК, но когда они присутствуют в ДНК, для них характерно основание тимин (Т). Простое изменение в кодоне для одного и того же аминокислотного остатка в полинуклеотиде не изменит последовательность или структуру кодируемого полипептида. Очевидно, при утверждении, что последовательность из 3 конкретных нуклеотидов «кодирует» любую конкретную аминокислоту, специалист в данной области определит, что таблица, приведенная выше, предоставляет способ идентификации рассматриваемых конкретных нуклеотидов. В качестве примера, если последовательность из трех конкретных нуклеотидов кодирует лизин, то в приведенной выше таблице показано, что две возможные триплетные последовательности представляют собой ААА и AAG. Глицин кодируют GGA, GGC, GGT (GGU если в РНК) and GGG. Для замены в кодируемом белке остатка лизин на глицин можно заменить триплет ААА или AAG на любой из GGA и GGC, GGT или GGG в кодирующей нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность N- или ORF7-белка изолята Р129 представлена ниже.

Конструирование полинуклеотидной последовательности мутантного N-белка с модифицированными NLS-2-областями продемонстрировано путем иллюстративного примера в Примере 1.

Следует понимать, что мутации в NLS-1-, NoLS- и NES-областях могут быть также выполнены похожими способами с похожими результатами.

Демонстрация того, что генетически модифицированный РРСС-вирус является аттенуированным

Для демонстрации того, что конкретный генетически модифицированный штамм является аттенуированным, может быть использован эксперимент, описанный ниже.

Группы по меньшей мере из 10 подсвинков, произведенных на ферме, не зараженной РРССВ, включены в каждое исследование. По результатам тестов сыворотка животных не содержит специфических антител против РРСС-вируса и животные РРССВ-негативны. Все животные, включенные в исследование, имеют общий источник и породу. Распределение животных по группам случайно.

Заражение проводили на 90 день беременности интраназальным нанесением 1 мл РРССВ 10⁵ TCID₅₀ (средняя цитопатогенная доза) в каждое носовое отверстие. В начале каждого теста было по меньшей мере три группы: одна группа для заражения Р129, одна тестируемая группа для заражения возможно аттенуированным вирусом и одна группа строгого контроля.

Исследование считают достоверным, если животные из группы строгого контроля оставались РРССВ-негативными в течение всего исследования, и в группе, зараженной Р129, рождается по меньшей мере на 25% меньше живых здоровых поросят, чем в группе строгого контроля.

Аттенуацию, или другими словами ослабление вирулентности, определяют как статистически значимое изменение одного или более параметров, определяющих репродуктивность или другую симптомологию.

Значимое снижение по меньшей мере одного из следующих параметров в тестируемой группе (возможно, аттенуированный вирус) в сравнении с группой, зараженной немодифицированным родительским штаммом, было свидетельством аттенуации:

а) частота мертворождений;

б) аборты в 112 день беременности или до него;

в) количество мумифицированных поросят;

г) количество менее активных и слабых поросят;

д) смертность до отъема.

Более того, предпочтительным является существенное повышение одного из следующих параметров в тестируемой группе в сравнении с группой, зараженной немодифицированным родительским штаммом:

а) количество поросят, отлученных от свиноматки;

б) количество живых здоровых поросят, рожденных свиноматкой.

В качестве альтернативы респираторные симптомы и другие симптомы РРССВ-инфекции могут быть изучены для оценки аттенуации, как описано ниже в Примере 3.

Вакцины

Аттенуированный штамм ценен для приготовления вакцин.

Настоящая вакцина эффективна, если она защищает свинью от инфекции, вызванной РРСС-вирусом. Вакцина защищает свинью от инфекции, вызванной РРСС-вирусом, если после введения вакцины одной или более незараженным свиньям последующее заражение биологически чистым изолятом вируса (например, VR 2385, VR 2386, Р129 и так далее) приводит к менее тяжелым макроскопическим или гистопатологическим изменениям (например, поражениям легких) и/или симптомам заболевания в сравнении с изменениями и симптомами, обычно вызываемыми этим изолятом у похожих свиней, не являющихся защищенными (то есть относительно соответствующего контроля). Конкретнее, эффективность данной вакцины может быть показана введением вакцины одной или более подходящим свиньям, нуждающимся в этом, и последующим заражением большой порцией (10^(3-7) TCID₍₅₀₎) биологически чистого изолята РРССВ после соответствующего промежутка времени (например 3 недели). Затем через примерно одну неделю у зараженных свиней брали анализ крови и пытались выделить вирус из образца крови (например, см., пример процедуры выделения вируса приведен ниже в Эксперименте VIII). Выделение большого количества вируса представляет собой свидетельство того, что вакцина не может быть эффективной, в то время как выделение уменьшенных количеств вируса (или его отсутствие) представляет собой свидетельство того, что вакцина может быть эффективной.

Таким образом, эффективность настоящей вакцины может быть оценена количественно (то есть снижение процентного содержания уплотненной легочной ткани по сравнению с соответствующей контрольной группой) и качественно (например, выделение РРССВ из крови, обнаружение антигена РРССВ в образце ткани легкого, миндалины или лимфатического узла иммунологическим анализом). Симптомы респираторно-репродуктивного заболевания свиней могут быть оценены количественно (например, температура/лихорадка), полуколичественно (например, тяжесть респираторного дистресс-синдрома [объяснено ниже более подробно] или качественно (на