Применение самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов в галеновых препаратах

Применение самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов в галеновых препаратах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новым галеновым препаратам, позволяющим улучшить кишечную абсорбцию активных начал, вводимых оральным путем, способам их получения, а также к применению липидных эксципиентов, ассоциированных с одним или более поверхностно-активными веществами и с одним или более котензидами, для ингибирования эффлюксных (выкачивающих) насосов.

Многие активные начала плохо абсорбируются после орального приема лекарства.

Некоторое число факторов могут нести ответственность за эту плохую абсорбцию:

- низкая растворимость в среде кишечно-желудочного тракта в областях, где рН среды может меняться от 5 до 8;

- химическое или ферментативное разложение активного начала в пищеварительном тракте;

- выкачивание активного начала на уровне кишечного эпителия насосом, таким как Р-гликопротеин.

Для решения проблем абсорбции были предложены многочисленные варианты рецептур, основанные либо на модификации физиологических характеристик желудочно-кишечного тракта, либо на модификации поведения самого лекарственного средства внутри пищеварительного тракта.

Обычно, увеличение абсорбции путем временной модификации характеристик желудочно-кишечного тракта требует:

- либо использования промоторов абсорбции, которые действуют через параклеточный путь с образованием узкого соединительного канала (Liu, D.Z. et al., J.Pharm. Sci. 1999, 88 (II): 1161-1168; 1169-1174; Thanou, M. et al., J.Pharm. Sci. 2000, 90 (I): 38-46),

- либо добавок, которые ингибируют эстеразы в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, увеличивают стабильность пролекарства (Van Gelder, J. et al., Pharm. Res. 1999, 16 (7): 1035-1040; Van Gelder, et al., Drug Metab Dispo. 2000, 28 (12): 1394-1396),

- либо добавок, которые модулируют транспорт активных соединений посредством Р-гликопротеина (Chang, Т. Er al., Clin Pharmacol Ther. 1996, 59 (3): 297-303; Zhang, Y.et al. Drag Me tab Dispo. 1998, 26 (4): 360-366; Soldner, A. et al., Pharm. Res. 1999, 16 (4): 478-485).

Альтернативной стратегией является модификация места расположения активного начала внутри желудочно-кишечного тракта. Для этого достаточно:

- увеличить стабильность соединений, слабо растворимых в воде, разнообразными методами, среди которых:

- использование солюбилизирующих эксципиентов (Sana, P. et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50: 403-411),

- получение препаратов в виде:

- дисперсии твердого вещества (Perng, C-Y et al., Int. J. Pharm. 1998, 176:31-38; Chowdary, K.P.R et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 2000, 26 (II): 1207-1211),

- микроэмульсии (Kommuru, T.R et al., Int. J.Pharm. 2001, 212(2): 233-246; Pouton, C.V et al., Eur. J. Pharm. Sci. 2000, 11: S93-S98; Gershanik, Т. et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50(1): 179-188),

- образования комплекса с циклодекстрином (Lin, HS et al., J. Clin. Pharm. Ther. 2000, 25(4): 265-269; Uekama, K et al., J. Pharm. Sci. 1983, 72(11): 1338-1341)

- уменьшить размер частиц (Farinha, A. et al.. Drug Dev. Ind. Pharm. 2000, 26(5): 567-570),

- нацеливать лекарства на специфические участки желудочно-кишечного тракта, чтобы исключить протеолиз этих лекарств интестинальными эстеразами (Bai, JP et al., Crit. Rev. Ther. Drag Carrier Syst. 1995, 12(4): 339-371).

Однако сохраняется необходимость в новых методах, способных улучшить кишечную абсорбцию лекарств, как тех, которые уже выпускаются в продажу, так и тех, которые разрабатываются. В частности, многие лекарства имеют низкую биодоступность при оральном приеме, поскольку они являются субстратами насосов, таких как Р-гликопротеин. Для этого класса соединений явление эффлюкса, производимое этими насосами, является фактором, ограничивающим процесс абсорбции.

Согласно настоящему изобретению абсорбция таких активных начал значительно улучшается при использовании определенных самоэмульгирующихся смесей эксципиентов, способных ингибировать эффлюксные насосы. В настоящем изобретении предлагается использование таких смесей в новых фармацевтических композициях.

Самоэмульгирующиеся системы или SEEDS (Self Emulsifying Drug Delivery System) представляют собой растворы масел и поверхностно-активных веществ, которые образуют эмульсии или микроэмульсии типа масло-в-воде, когда они находятся в водной среде. Если включить смеси липидных эксципиентов и поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов в фармацевтические композиции, содержащие в качестве активных начал субстраты эффлюксного насоса, то образуются эмульсии или микроэмульсии в момент, когда эти смеси контактируют с водной средой, такой как жидкость желудочно-кишечного тракта, и происходит ингибирование эффлюксных насосов, что позволяет увеличить кишечную абсорбцию активного начала. Таким образом, изобретение применимо именно к таким активным началам, которые известны своей низкой абсорбируемостью после орального приема и тем, что являются субстратами эффлюксных насосов.

Это ингибирование, кроме того, сопровождается, в определенных случаях, увеличением растворимости и/или защиты активного начала от химического разложения в пищеварительном тракте.

Результат от использования смесей согласно изобретению заключается в значительном увеличении кишечной абсорбции.

Тип препарата согласно изобретению позволяет также уменьшить дозы активного начала по сравнению с классической композицией при одной и той же терапевтической эффективности даже при одном и том же воздействии плазмы, что приводит к снижению стоимости лекарства. Композиции согласно изобретению применимы к известным и выпускаемым в продажу активным началам, что позволяет выпускать их в новых фармацевтических формах, которые будут обладать повышенной кишечной абсорбцией, и продукт, традиционно вводимый парентеральным путем (например, внутривенным или подкожным), может включать то же самое активное начало и предназначаться для орального введения.

Механизм, улучшающий прохождение лекарства через кишечник, скорее всего заключается во взаимодействии эксципиента согласно изобретению с биологической средой, а не в увеличении растворимости. Действительно, как будет ниже показано в экспериментальной части, абсорбция составляет менее 1%, когда активное начало приготавливали, например, с использованием ДМСО, хотя он считается растворителем, в котором достигается наибольшая растворимость.

Этот механизм никогда не был раскрыт в известном уровне техники. Однако он позволяет рассмотреть множество возможностей улучшения биодоступности при оральном приеме активных начал, абсорбция которых ограничена действием эффлюксного насоса, такого как Р-гликопротеин.

Механизм улучшения кишечной абсорбции систем согласно изобретению приводит, следовательно, к ингибированию эффлюксного насоса, такого как Р-гликопротеин. В некоторых случаях этот механизм приводит также к увеличению растворимости при физиологическом значении рН и/или к защите от разложения под действием пищеварительных ферментов.

Изобретение относится, таким образом, к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов, таких, которые описаны ниже, для ингибирования эффлюксных насосов.

Как будет показано в тестах экспериментальной части, представленной ниже, липидные эксципиенты, ассоциированные с одним или более поверхностно-активным веществом и, при необходимости, с одним или более котензидом, находясь в самоэмульгирующейся смеси, воздействуют на один или несколько факторов, ответственных на плохую абсорбцию.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению позволяют, таким образом, улучшить кишечную абсорбцию активных начал, имеющих один или несколько следующих параметров, противодействующих оптимальной абсорбции:

- низкое транс-эпителиальное прохождение в направлении абсорбции под действием эффлюксного насоса,

- низкая растворимость при физиологических рН на уровне кишечника,

- химическое или ферментативное разложение в пищеварительном тракте.

Изобретение относится к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов для получения фармацевтических композиций, вводимых оральным путем, содержащих один или более активных начал, и позволяющих увеличить абсорбцию кишечником указанных активных начал благодаря действию механизма ингибирования эффлюксных насосов.

Изобретение относится также к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов для получения фармацевтических композиций, содержащих одно или более активных начал и позволяющих увеличить абсорбцию кишечником указанных активных начал благодаря действию механизма, ингибирующего эффлюксные насосы и увеличивающего растворимость активного начала.

Изобретение относится также к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов для получения фармацевтических композиций, содержащих один или более активных начал и позволяющих увеличить абсорбцию кишечником указанных активных начал благодаря действию механизма, ингибирующего эффлюксные насосы и увеличивающего стабильность активного начала в желудочно-кишечном тракте.

Изобретение относится также к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов для получения фармацевтических композиций, содержащих один или более активных начал и позволяющих увеличить абсорбцию кишечником указанных активных начал благодаря действию механизма, ингибирующего эффлюксные насосы, увеличивающего растворимость активного начала и увеличивающего стабильность активного начала в желудочно-кишечном тракте.

Более конкретно, изобретение относится к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов для ингибирования активности Р-гликопротеина.

Согласно изобретению активное начало подвергается воздействию, в частности, Р-гликопротеина и может быть растворимым или нерастворимым в желудочно-кишечном тракте, или стабильным, или нестабильным в желудочно-кишечном тракте.

Выбор эксципиентов или выбор соотношений между различными эксципиентами осуществляется следующим образом: один из этих эксципиентов должен быть эксципиентом липидной природы, а другой эксципиент представляет собой поверхностно-активное вещество, и/или другой эксципиент представляет собой котензид, эти эксципиенты выбирают в таком соотношении, чтобы при данном активном начале смесь образовывала самоэмульгирующуюся систему.

Смеси согласно изобретению могут содержать дополнительно растворитель, такой как гликофурол или ДМСО.

Под самоэмульгирующейся системой понимают жидкий или твердый раствор, образованный липидным эксципиентом и, необязательно, поверхностно-активным веществом, которое может быть липофильным (т.е. у которого гидрофильно-липофильный баланс [ГЛБ] выше 10) или гидрофильным (ГЛБ<10), и/или гидрофильным или липофильным котензидом, который образует эмульсии масло-в-воде с размером частиц 0,1-10 мкм, или микроэмульсии масло-в-воде с размером частиц ниже 100 нм, когда раствор вводится в водную среду, непосредственно самой физиологической жидкости или вне ее.

Предпочтительно, изобретение относится к самоэмульгирующимся смесям липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов, которые образуют микроэмульсии масло-в-воде, когда они вводятся в водную среду непосредственно самой физиологической жидкости или вне физиологической жидкости. Согласно изобретению частицы, образующиеся после взаимодействия с водной средой, в частности с дуоденальной жидкостью, имеют размер ниже 100 нм.

Под липидным эксципиентом понимают, в частности, глицериды (моно-, ди- и триглицериды), жирные кислоты и их производные, фосфолипиды, гликолипиды и стеролы.

Согласно изобретению липидные эксципиенты выбирают из глицеридов, жирных кислот и их производных, фосфолипидов, гликолипидов и стеролов.

Предпочтительно, под липидным эксципиентом понимают согласно изобретению:

- линолеат глицерина, такой как Maisine 35-1® (Gattefossé),

- моноолеат глицерина, такой как Peceol® (Gattefossé),

- глицеринлаурат, такой как Gelucire 44/14® (macrogol-32) (Gattefossé),

- олеат/линолеат глицерина, такой как Olicine®

- полиглицерил-3-олеат, такой как Plurol oléique® (Gattefossé),

- масло сои,

- триглицериды капроновой/каприловой/лауриновой кислоты, такой как Captex 350® (Abitec corporation) и

- олеиновая кислота.

Под поверхностно-активным веществом понимают амфифильное вещество, состоящее из двух частей, одна из которых имеет гидрофобный характер, другая имеет гидрофильный характер, и которое действует на поверхности раздела вода/липид или вода/воздух, снижая поверхностное натяжение, даже при незначительных концентрациях. Поверхностно-активное вещество является липофильным, если ГЛБ выше 10, и является гидрофильным, если ГЛБ ниже 10.

Согласно изобретению поверхностно-активное вещество может быть, в частности, гидрофильным.

Согласно изобретению поверхностно-активное вещество может быть, при желании, липофильным.

Предпочтительно, согласно изобретению под поверхностно-активным веществом понимают:

- каприлат/капрат глицерина, такой как Labrasol® (macrogol-8) (Gattefossé),

- тририцинолеат полиоксиэтиленгликоля, такой как Cremophor EL® (BASF) и

- олеат полиоксиэтиленсорбитана, такой как Tween 80.

Под котензидом понимают вещество, которое обладает свойствами поверхностно-активного вещества и которое в присутствии первого поверхностно-активного вещества действует как стабилизатор смеси, образованной этим поверхностно-активным веществом и липидным эксципиентом.

Предпочтительно, согласно изобретению под котензидом понимают:

- моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, такой как Transcutol® (Gattefossé),

- монокаприлат пропиленгликоля, такой как Capryol 90® (Gattefossé),

- абсолютный этанол и

- макрогол 800-300.

Согласно изобретению самоэмульгирующиеся смеси липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов, представляют собой следующие смеси:

- Система 1: Gélucire 44/14®/Plurol

oléique® /Тranscutol®/ДМСО в соотношениях, которые соответственно могут меняться в интервале 50-60, 15-20, 15-20 и 5-15, или

- Система 2: Gélucire 44/14®/Plurol

oléique® /Тranscutol®/Гликофурол в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 50-65, 15-25, 15-25 и 5-15,

- Система 3: Gélucire 44/14®/Labrasol®/ДМСО в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 65-85, 15-25 и 5-15,

- Система 4: Gélucire 44/14®/ Labrasol®/Гликофурол в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 65-85, 15-25 и 5-15,

- Система 5: Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/ДМСО в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 40-50, 40-50 и 5-15,

- Система 6: Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/Гликофурол в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 40-50, 40-50 и 5-15,

- Система 7: масло сои/ Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/этанол/ДМСО в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 25-35, 25-35, 25-35, 5-15 и 5-15,

- Система 8: масло сои/ Maisine 35-1®/Cremophor EL®/этанол/.

Гликофурол в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 25-35, 25-35, 25-35, 5-15 и 5-15,

- Система 9: масло сои/ Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/Transcutol®/ДМСО в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 25-35, 25-35, 25-35, 5-15 и 5-15,

- Система 10: масло сои/ Maisine 35-1®/Creniophor ЕL®/Transcutol®/Гликофурол в соотношениях, которые могут соответственно меняться в интервале 25-35, 25-35, 25-35, 5-15 и 5-15.

Согласно изобретению самоэмульгирующимиеся смеси липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов представляют собой, в частности, следующие смеси:

- Система 1: Gélucire 44/14®/ Labrasol®/ДМСО в соотношениях 72/18/10;

- Система 2: Gélucire 44/14®/Labrasol®/Гликофурол в соотношениях 72/18/10;

- Система 3: Gélucire 44/14®/Labrasol®/ДМСО в соотношениях 80/20/10;

- Система 4: Gélucire 44/14®/Labrasol®/Гликофурол в соотношениях 80/20/10;

- Система 5: Gélucire 44/14®/Plurol oléique®/Transcutol®/ ДМСО в соотношениях 54/18/18/10;

- Система 6: Gélucire 44/14®/Plurol oléique®/Transcutol®/ Гликофурол в соотношениях 54/18/18/10;

- Система 7: Maisine 35-1®/Creomophor ЕL®/ДМСО в соотношениях 45/45/10;

- Система 8: Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/Гликофурол в соотношениях 45/45/10;

- Система 9: масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/этанол/ ДМСО в соотношениях 27/27/28,8/7,2/10;

- Система 10: масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/этанол/Гликофурол в соотношениях 27/27/28,8/7,2/10;

- Система 11: масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/ Transcutol®/AMCO в соотношениях 27/27/28,8/7,2/10;

- Система 12: масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/ Transcutol®/Гликофурол в соотношениях 27/27/28,8/7,2/10;

- Система 13: масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/ Transcutol®/ДМСО в соотношениях 27,2/27,2/29,2/7,4/9;

- Система 14: масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/Transcutol®/Гликофурол в соотношениях 27,2/27,2/29,2/7,4/9;

- Система 15: Gélucire 44/14®/Plurol oléique®/Transcutol®/ Гликофурол в соотношениях 55/18/18/9;

- Система 16: Gélucire 44/14®/Plurol oléique®/Transcutol®/ДMCO в соотношениях 55/18/18/9.

Изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим активное начало и самоэмульгирующуюся смесь липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов, таких, которые описаны выше.

В примерах экспериментальной части эти системы включали в качестве активных начал молекулу (соединение) А (сложный этиловый эфир (2S)-2-(нафталин-1-сульфониламино)-3-(4-(2-(1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-илкарбамоил)-этил)-бензоиламино)-пропионовой кислоты) или молекулу (соединение) В ((2S)-2-бензилоксикарбониламино-3-(4-(3-(1,4,5,6-тетрагидропиримидин-2-илкарбамоил)пропилокси)фенил)пропионовая кислота), которые являются соединениями семейства "Osteoclast Adhesion Receptor Antagonists" (O.A.R.A.), разработанными в рамках профилактики и лечения остеопороза, такие как они описаны в международных заявках на патент WO 99/37621.

Фармацевтические композиции согласно изобретению получают следующим образом:

1. Вводят липидный эксципиент, поверхностно-активное вещество и, при необходимости, котензид. Если эксципиенты являются полутвердыми веществами, то их предварительно нагревают;

2. Смесь перемешивают до получения гомогенного раствора;

3. Растворяют активное начало в растворителе, таком как ДМСО, гликофурол, или в одном из эксципиентов, входящих в состав эмульсий и микроэмульсий;

4. Вводят растворенное активное начало в смесь липидного эксципиента, поверхностно-активного вещества и, при необходимости, котензида;

5. При необходимости, нагревают или обрабатывают ультразвуком до получения гомогенного раствора.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут выпускаться в различных формах в зависимости от необходимости:

- в виде твердых желатиновых капсул, заполненных смесью полувязких, вязких или жидких эксципиентов,

- в виде мягких капсул, заполненных смесью полувязких, вязких или жидких эксципиентов,

- в герметичных ампулах, заполненных смесью жидких эксципиентов,

- в емкости типа бутылки для сиропа, заполненной смесью жидких эксципиентов.

Помимо их активности, выраженной в увеличении интестинальной абсорбции, композиции имеют ряд других преимуществ.

Композиции согласно изобретению могут увеличивать кажущееся проникновение активного начала в направлении АВ (от апикальной стороны к базолатеральной стороне) и уменьшать это проникновение в направлении ВА (от базолатеральной стороны к апикальной стороне) по сравнению с контрольной композицией (Фигура 1, приложение 1).

Композиции согласно изобретению могут также увеличивать внутриклеточное накопление активного начала по сравнению с контрольной композицией (Фигура 4, приложение 2).

Наконец, они могут стабилизировать активное начало в интестинальной жидкости (например, в дуоденальной), защищая его от ферментативного гидролиза (Фигура 5, приложение 2).

Кроме того, некоторые эксципиенты согласно изобретению могут быть использованы в формах для инъекций с целью ингибирования Р-гликопротеина раковых клеток и увеличения клеточного проникновения активного начала в опухолевые клетки.

Таким образом, изобретение относится к применению самоэмульгирующихся смесей липидных эксципиентов, поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов для получения раствора для инъекций, позволяющего ингибировать Р-гликопротеин раковых клеток и увеличивать клеточное проникновение активного начала в опухолевые клетки.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

Примеры применения

1) Принцип работы

1.1) Соединения и исследуемые композиции

а) Соединение А: Композиции для изучения в тесте in vitro

Композиции на основе соединения А, исследуемые в тесте in vitro на крысе, указаны в таблице 1.

Таблица 1Композиции на основе соединения А, используемые в тесте in vitro
Ингредиенты, используемые в 1% в донорских растворах (буфер HBSS/HEPES)	Композиция	Состав
ДМСО	ДМСО
Гликофурол	Гликофурол
макрогол 300	макрогол 300
Gélucire 44/14®/Labrosol®/ДМСО	А	77/18/10
Gélucire44/14®/Plurol oléique®/Transcutol®/ДMCO	В	54/18/18/10
Gélucire 44/14®/ Plurol oléique®/Transcutol®/ гликофурол	С	54/18/18/10
Maisine 35-l®/Cremophor ЕL®/ДМСО	D	45/45/10
Масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor ЕL®/этанол/ДМСО	E	27/27/28,8/7,2/10
Масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/Transcutol®/ДМСО	F	27/27/28,8/7,2/10
Масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/Transcutol®/Гликофурол	G	27/27/28,8/7,2/10

b) Соединение А: Композция для изучения в тесте in vivo

Композиции на основе соединения А, исследуемые в тесте in vivo на крысе, указаны в таблице 2.

Таблица 2Композиции на основе соединения А, исследуемые в тесте in vivo на крысе.
Композиции	Ингредиенты	Состав
Глик/В	Гликофурол/Вода	50/50
PEG	макрогол 300/вода	30/70
Соя/Глик	масло сои/Maisine 35-1®/Cremophor EL®/Transcutol®/Гликофурол	27,2/27,2/29,2/7,4/9
Gélu/Глик	Gélucire 44/14®/Plurol oléique/Transcutol®/Гликофурол	55/18/18/9
Gélu/ДМСО	Gélucire 44/14®/Plurol oléique®/Transcutol®/ДМСО	55/18/18/9

с) штаммы Сасо-2

Штаммы Сасо-2, использованные в тестах, представляли собой клетки Сасо-2 клона ТС7. Эту линию клеток использовали для оптимизации композиций и для изучения механизма или механизмов абсорбции с целью идентификации параметра, ограничивающего интестинальное прохождение активных начал.

Эти клетки выращивали и хранили в соответствии с методами, известными специалисту.

1.2) Определение растворимости соединения А в различных растворителях.

Растворимость соединения А определяли в очищенной воде и в различных буферах, имеющих значения рН в интервале 1,2-8 (1,5; 2,5; 3,5; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 и 8,0).

К 1 мл водного раствора прибавляли 10 мг соединения А.

Суспензии перемешивали в течение 24 часов при 25°С, затем центрифугировали. Содержание соединения А в супернатанте определяли методом ВЭЖХ и проверяли значение рН супернатанта.

Определяли также кажущуюся растворимость соединения А в различных маслах, поверхностно-активных веществах, котензидах, ДМСО и гликофуроле. К 1 г каждого носителя добавляли небольшие порции соединения А. Растворение осуществляли с помощью ультразвука при 25°С. Растворение оценивали визуально и под оптическим микроскопом. Растворимость определялась с точностью до мг.

1.3) Получение композиций, исследованных на моделях клеток Сасо-2 и на крысе;

а) Композиции, используемые для изучения механизма проникновения соединения А на моделях клеток Сасо-2/ТС7.

Для того чтобы оценить масштаб проникновения соединения А, растворенного в ДМСО в зависимости от концентрации, готовили два раствора. Первый раствор, к которому будет добавлено соединение А, меченное ¹⁴С, имел концентрацию 4,3×10^-2 М; второй раствор, к которому будет добавлен ¹⁴С-маннитол, имел концентрацию 5×10^-2 М.

Эти растворы в ДМСО затем разводили в буфере, содержащем 25 мМ HBSS/HEPES (рН 7,4), к которому было добавлено 0,4 мкCi/мл ¹⁴С-маннита или 0,4 мкСi/мл соединения А, меченного ¹⁴С (что соответствует 7 мкМ), таким образом, чтобы конечные концентрации соединения А составили 7, 10, 50 или 100 мкМ.

Конечная концентрация ДМСО в каждом донорском растворе составляла 0,5%.

Донорские растворы, содержащие 0,5% ДМСО, но не содержащие соединения, были использованы в качестве контрольных.

Для изучения роли Р-гликопротеина в механизме транспорта соединения А готовили донорские растворы, содержащие 10 мкМ соединения А и 100 мкМ верапамила, никардипина или прогестерона, оценивали проникновение соединения А и сравнивали его с проникновением, имевшим место в отсутствие модулятора Р-гликопротеина.

b) Влияние используемых растворителей на проникновение в модели клеток Сасо-2/ТС7

Для изучения влияния гликофурола и макрогола 300 на проникновение соединения А:

Соединение А растворяли в гликофуроле с получением растворов с концентрацией 4,3×10^-3M или 5×10^-3 М. Эти растворы разводили в буфере HBSS/HEPES, к которому было добавлено 0,4 мкCi/мл ¹⁴С-маннита или 0,4 мкCi/мл соединения А, меченного ¹⁴С (см. выше) для получения донорских растворов, в которых конечная концентрация молекулы А составляла 50 мкМ, а конечное содержание гликофурола составляло 1%.

Соединение А растворяли в макроголе 300 с получением растворов с концентрацией 0,3×10^-3 М или 10^-3 М. Затем эти растворы разводили в буфере HBSS/HEPES, к которому было добавлено 0,4 мкСi/мл ¹⁴С-маннита или 0,4 мкСi/мл соединения А, меченного ¹⁴С (см. выше) с получением донорских растворов, в которых конечная концентрация соединения А составляла 50 мкМ и конечное содержание макрогола 300 в донорском растворе составляло 5%.

Эталонный донорский раствор, содержащий 0,5% ДМСО и 5×10^-5 М соединения А, готовили как указано выше.

c) Влияние композиций на проникновение соединения А в модели клеток Сасо-2/ТС7.

Готовили различные композиции путем смешивания в соответствующих условиях липидных эсципиентов, поверхностно-активных веществ и котензидов с последующим интенсивным перемешиванием в течение 30 секунд (Таблица 1). Когда использовались полутвердые эксципиенты, то их предварительно растворяли на водяной бане при 50°С.

Перед составлением какой-либо композиции соединение А растворяли в ДМСО или в гликофуроле с получением растворов с концентрациями 4,3×10^-3M или 5×10^-3 М в каждом из растворителей. К раствору с концентрацией 4,3×10^-3M добавляли 40 мкСi/мл соединения А, меченного ¹⁴С, до тех пор, пока теоретическая концентрация соединения А не достигнет 5×10^-3 М. К растворам с концентрацией 5×10^-3 М добавляли 40 мкCi/мл ¹⁴С-маннита.

Каждый из полученных таким образом растворов разбавляли в изучаемых смесях липидных эксципиентов и поверхностно-активных веществ и, при необходимости, котензидов, с образованием композиций, содержащих растворитель (ДМСО или гликофурол) в количестве 10%, и соединения А с концентрацией 5×10^-4 М.

Эти композиции разводили в буфере, содержащем 25 мМ HBSS/HEPES, с получением донорских растворов, в которых конечная концентрация соединения А составляла 5×10^-5 М, и которые содержали 0,4 мкСi/мл соединения А, меченного ¹⁴С, или 0,4 мкCi/мл ¹⁴С-маннита, и в которых содержание липидного компонента было ниже 1%.

Для оценки влияния композиций, на апикальной стороне, на транспорт маннита и соединения А в направлении ВА были приготовлены растворы плацебо, содержащие композиции, но без соединения А.

d) Композиции, исследованные в тесте in vivo на крысе.

1) Введение внутривенным путем

Соединение А, меченное ¹⁴С, впрыскивают в смесь 50/50 (об/об) гликофурол/вода до достижения концентрации 1,5 мг/мл (145,9 мкCi/мл), что соответствует фармакологической дозе. В качестве растворителя был выбран гликофурол, поскольку он позволяет ввести желаемое количество активного начала в максимальном объеме для внутривенного введения крысе (1 мл/кг).

2) Введение оральным путем

Композиции готовили в соответствии с данными, указанными в таблице 2.

Соединение А, меченное ¹⁴С (220 мкСi), растворяли сначала в ДМСО или гликофуроле с получением растворов с конечной концентрацией 5 мг/мл (488,9 мкСi/мл). Приготовленные растворы добавляли к липидным смесям с получением композиций, описанных в таблице 2, причем конечная концентрация соединения А, меченного ¹⁴С, составляла 0,45 мг/мл.

Эталонный раствор готовили путем растворения соединения А, меченного ¹⁴С (220 мкСi), в макроголе 300 с конечной концентрацией 0,5 мг/мл (44 мкСi/мл).

Перед оральным введением препарата крысе композиции разбавляли в двух объемах воды. Эталонный раствор в макроголе 300 разбавляли водой так, чтобы получить конечную концентрацию 0,15 мг/мл (13,2 мкСi/мл). Полученные таким образом композиции и контрольный раствор позволили ввести крысе дозу 1,5 мг/кг при объеме менее 10 мл/кг.

1.4) Изучение транспорта

a) Клетки и используемая аппаратура.

В опытах по изучению транспорта клетки после 12-32 пассажей наносили с плотностью 5×10⁵ клеток/фильтр на поликарбонатный фильтр диаметром 12 мм, находящийся в многолуночных коробах (Transwell®, Costar). Клетки инкубировали при 37°С в течение 21-28 суток в полной среде, дополненной пенициллином (100 МЕ/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) (Invitrogen).

Для определения величины проникновения соединения А (в направлении АВ или ВА) для каждого данного раствора использовалось в целом 6 лунок.

b) Композиции и используемые растворы.

Когда изучался транспорт в направлении АВ, базолатеральную среду заменяли свежеприготовленным буфером HBSS/HEPES (1,5 мл), а апикальную среду (0,5 мл) заменяли донорским раствором.

Когда изучался транспорт в направлении ВА, за исключением липидных композиций, описанных в таблице 1, апикальную среду заменяли свежеприготовленным буфером HBSS/HEPES, а базолатеральную среду заменяли донорским раствором. Для изучения влияния липидных композиций на проникновение соединения А в направлении ВА эталонную композицию с соединением А с концентрацией 50 мкМ в буфере HBSS/HEPES, содержащем 0,5% ДМСО, добавляли с базолатеральной стороны, а контрольный раствор добавляли с апикальной стороны.

с) Отбор и обработка образцов

При времени Т=0 отбирали 100 мкл радиоактивного раствора для количественного определения первоначальной радиоактивности. Через каждые 30 минут в течение 120 минут отбирали образцы объемом 500 мкл с базолатеральной стороны или объемом 250 мкл с апикальной стороны для изучения транспорта в направлении соответственно АВ и ВА. Образцы сразу же заменяли свежим буфером HBSS/HEPES или плацебо-композицией (в случае опыта с липидными композициями в направлении ВА).

Радиоактивность образцов измеряли путем подсчета радиоактивности методом β сцинтилляции после добавления сцинтилляционной жидкости Aqueous Counting Scintillant (ACS, Amersham Buckinghamshire, UK) с корректировкой гашения в режиме простой маркировки (LKB Wallac 1214, Broma, Sweden). Для изучения транспорта в направлении АВ в присутствии 7 мкМ и 100 мкМ соединения А количественный анализ проводили методами LC/MS/MS.

г) Проверка целостности мембран

Перед каждым экспериментом по изучению транспорта проверяли слитность клеток Сасо-2 путем измерения величины электрического транс-эпителиального сопротивления с помощью прибора Endhom (WPI), снабженного плоскими электродами. Эта величина составила около 360 ом·см² для монослоев слитых клеток Сасо-2. Для опытов по изучению транспорта использовали только слитые и дифференцированные клетки Сасо-2.

В конце каждого опыта по изучению транспорта снова проверяли целостность монослоя путем измерения электрического транс-эпителиального сопротивления. Считается, что целостность мембран в монослое клеток Сасо-2 нарушена, когда значение электрического транс-эпителиального сопротивления уменьшено более чем на 25%, а кажущееся проникновение маннита выше 10^-6 см/с.

e) Расчет потока

В условиях равновесия величины однонаправленных потоков в направлении АВ и в направлении ВА рассчитывали с помощью следующего уравнения:

J=dQ/dt×1/A,

где dQ обозначает количество активного начала (импульсы/мин), накопленного в приемной камере в течение интервала времени dt, и А обозначает экспонированную поверхность монослоя (1,13 см²).

f) Расчет кажущегося проникновения

Величину кажущегося проникновения (Р_арр) маннита или соединения А определяли исходя из однонаправленного потока с использованием следующего уравнения:

Р_арр=J/C_i

где C_i обозначает первоначальное число импульсов/мл в донорской среде.

g) Расчет абсорбированной экстраполированной фракции.

Абсорбированную экстраполированную фракцию рассчитывали в соответствии с уравнением (Pontier et al., J. Pharm. Sci. 2001, 90: 1608-1619):

Абсорбированную экстраполированную фракцию рассчитывали при изучении транспорта в направлении АВ, исходя из гипотезы, что ни растворимость, ни степень растворения, ни механизм эффлюкса, ни стабильность в желудочно-кишечном тракте не являются препятствием для абсорбции при оральном приеме.

1.5) Изучение внутриклеточной концентрации

а) Определение потока и внутриклеточного накопления

Внутриклеточное накопление соединения А определяли одновременно с изучением транспорта в направлениях АВ и ВА, используя либо донорскую эталонную композицию, либо донорский раствор, содержащий композицию В, причем каждая из этих композиций содержала соединение А, меченное ¹⁴С в концентрации 5×10^-5 М.

Когда композиция В исследовалась в направлении ВА, базолатеральная сторона содержала донорский эталонный раствор, и апикальная сторона заполнялась плацебо-композицией В. Как и в опытах по изучению транспорта, общее содержание ингредиентов не превышало 1% от среды.

Для каждой композиции и в каждом направлении использовались в целом 24 лунки.

[1] Определение потоков

Через периоды времени Т=0, 30, 60, 120 и 180 минут отбирали образцы либо с апикальной стороны, либо с базолатеральной стороны и определяли значения потоков (в DPM/см²·час) в направлениях АВ и ВА как описано выше.

[2] Определение внутриклеточного накопления

Одновременно в каждый из указанных периодов 6 лунок полностью освобождались от среды и соответствующие фильтры собирали и промывали в PBS (Phosphate buffered saline) при 4°С.

Эти фильтры, несущие клетки Сосо-2, помещали в пробирку, содержащую 1 мл смеси 50/50 (об/об) буфера HBSS/HEPES и этанола (95 об.%).

После суспендирования клеток путем обработки ультразвуком в течение 1 минуты жидкость центрифугировали с ускорением 1000 д в течение 5 минут.

Отбирали образец супернатанта объемом 200 мкл и подсчитывали радиоактивность на сцинциляционном счетчике.

Результаты выражали в количестве распадов в минуту, происходящих в кажущемся объеме клеток, равном 1 см³. Для расчета объема монослоев клеток исходят из следующей гипотезы: каждая клетка образует цилиндр с высотой 17,9 мкм и диаметром 13,3 мкм, и каждый монослой содержит 1,1×10⁶ клеток на см², как говорится в отчете (Pontier et al., J. Pharm. Sci. 2001 90: 1608-1619). Следовательно, кажущийся объем разросшихся монослоев на поликарбонатном фильтре, имеющих поверхность 1,13 см², составил 1,24×10² см³. Для каждого времени отсчета рассчитывалось среднее значение из полученных при подсчете 6 соответствующих лунок (в DPM/см³).

b) Изменение проницаемости апикальных и базолатеральных мембран.

При расчете значений кажущейся проницаемости внутриклеточного пространства в базолатеральном направлении (СВ) и внутриклеточного пространства в апикальном направлении (СА) с использованием контрольной композиции и композиции В исходили из гипотезы, что полученные значения потоков в опытах по изучению транспорта в направлениях АВ и ВА отражают массоперенос изнутри клетки к наружной стороне, либо со стороны базолатеральной по направлению АВ (J^AB в DPM/см²·час), либо с апикальной стороны в направлении ВА (J^BA в DPM/см²·час).

Исходили также из того, что оба потока J^AB и J^BA зависят от внутриклеточных концентраций С_c ^AB и С_с ^BA (выраженных в DPM/см³), рассчитанных на основании экспериментов с внутриклеточным накоплением, проводимых параллельно с соответствующими экспериментами по изучению транспорта в направлениях АВ и ВА соответственно. В этом случае потоки, измеренные в направлении АВ (J^AB) и в направлении ВА (J^BA), равны потокам изнутри клетки к наружной ее части в базолатеральной мембране (J^CB) и в апикальной мембране (J^CA) соответственно.

Мембранная проницаемость рассчитывается согласно сле