Протеин, связанный с заболеванием

Протеин, связанный с заболеванием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для обнаружения и лечения дегенеративных заболеваний сетчатки. В частности, изобретение относится к протеину, обладающему защитной функцией в отношении дегенерации колбочек, молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такой протеин, антителам, распознающим протеин, и способам диагностики дегенеративных заболеваний сетчатки.

Предпосылки создания изобретения

Фоторецепторы представляют собой специализированную подгруппу нейронов сетчатки, ответственных за зрение. Фоторецепторы состоят из палочек и колбочек, которые представляют собой фоточувствительные клетки сетчатки. Каждая палочка и колбочка продуцируют специализированные реснички, обозначаемые как внешний сегмент, который обладает способностью к фототрансдукции. Палочки содержат специфический светопоглощающий зрительный пигмент родопсин. У человека существуют три класса колбочек, характеризующихся способностью экспрессировать различные зрительные пигменты: пигменты колбочек, специфических в отношении синего цвета, специфических в отношении зеленого цвета и специфических в отношении красного цвета. Каждый тип протеина зрительного пигмента характеризуется способностью максимально поглощать свет в определенном диапазоне длин волн, отличном от диапазона длин волн других типов протеина. Родопсин палочек опосредует скотопическое зрение (в тусклом свете), в то время как пигменты колбочек являются ответственными за фототопическое зрение (в ярком свете). Красный, синий и зеленый пигменты являются также основой цветного зрения у человека. Зрительные пигменты в палочках и колбочках реагируют на свет и создают биоэлектрический потенциал в клетках, генерирующих выходной сигнал, т.е. в биполярных нейронах палочек, который затем транслируется ганглиозными нейронами сетчатки, вызывая зрительный стимул в зрительной области коры головного мозга.

У человека многие заболевания сетчатки сопровождаются прогрессирующей дегенерацией и в конце концов гибелью фоторецепторов, что неизбежно приводит к слепоте. Все заболевания, связанные с дегенерацией фоторецепторов, такие как наследственные дистрофии сетчатки (например, пигментный ретинит), связанная с возрастом дегенерация желтого пятна и другие макулопатии, или отслоение сетчатки, характеризуются прогрессирующей атрофией и потерей функции фоторецепторов внешних сегментов. Кроме того, гибель фоторецепторов или утрата фоторецепторной функции у пациентов, страдающих дистрофией сетчатки, приводит к частичной дифференцировке вторичных нейронов сетчатки (биполярных клеток и горизонтальных клеток палочек), что вызывает снижение общей эффективности распространения электрического сигнала, генерируемого фоторецепторами. Вторичные изменения в глие и пигментном эпителии, обусловленные дегенерацией фоторецепторов, вызывают изменения в сосудах, приводящие к ишемии и глиозу. Для лечения таких состояний можно применять методы, основанные на использовании трофических факторов, которые обладают способностью защищать фоторецепторы от гибели клеток и/или восстанавливать функцию нефункционирующих (атрофических или дистрофических) фоторецепторов.

Прогрессирующее развитие этих состояний свидетельствует о последовательной гибели двух классов фоторецепторов: сначала погибают палочки вследствие непосредственного генетического повреждения или нарушения, вызванного окружающей средой, или имеющее неизвестное происхождение, что приводит к ночной слепоте и снижению поля зрения, после чего неизбежно происходит гибель колбочек, приводящая к полной слепоте. Таким образом, гибель колбочек происходит в результате косвенного действия, поскольку они не подвергаются первичному повреждению.

В настоящее время идентифицированы не все гены, связанные с дистрофией сетчатки. Идентификация таких генов может позволить как осуществлять диагностику, так и разрабатывать эффективные методы терапевтического лечения.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение в целом относится к новому семейству генов, выведенному из палочек фактору жизнеспособности колбочек (Rod-derived Cone Viability Factor) (Rdcvf). Первым объектом изобретения является выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. Установлено, что такой полипептид или его фрагменты присутствуют в глазу человека, страдающего дистрофиями сетчатки, в существенно меньших количествах, чем в глазу человека, который не страдает дистрофией сетчатки. Фрагменты выделенного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, включают полипептиды, содержащие от приблизительно 5 до 10 аминокислот, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 100 аминокислот и наиболее предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 50 аминокислот. Данный объект изобретения относится к новому полипептиду, происходящему из организма млекопитающего, в частности из организма мыши или человека, а также к его фрагментам, вариантам и производным, вариантам и производным фрагментов и их аналогам, которые можно применять в биологических, диагностических или терапевтических целях. Под объем изобретения подпадают также полипептиды, практически аналогичные полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, например, аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14.

Вторым объектом изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. Под объем изобретения подпадают также нуклеиновые кислоты, практически аналогичные нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, например, нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13. Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, выбранный из группы, включающей полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14, например, нуклеотиды 45-374 SEQ ID NO: 1, нуклеотиды 26-676 SEQ ID NO: 3, нуклеотиды 24-353 SEQ ID NO: 5, нуклеотиды 48-686 SEQ ID NO: 7, нуклеотиды 265-570 SEQ ID NO: 9, нуклеотиды 300-770 SEQ ID NO: 11 или нуклеотиды 331-738 SEQ ID NO: 13. В предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенная ДНК находится в форме векторной молекулы, содержащей ДНК, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

Третьим объектом настоящего изобретения является способ диагностики дистрофии сетчатки у человека, предусматривающий выявление снижения транскрипции матричной РНК, транскрибируемой на основе Rdcvf-1- или Rdcvf'2-кодирующей ДНК, в глазу млекопитающего, предпочтительно человека, где такое снижение транскрипции является диагностическим признаком того, что пациент страдает от дистрофии сетчатки или патологического старения (ARMD). Другой вариант осуществления изобретения относится к способу диагностики дистрофии сетчатки в организме млекопитающего, предпочтительно человека, предусматривающему измерение количества полипептида Rdcvf1 или Rdcvf2 или его фрагментов в глазу человека, в отношении которого имеется предположение о том, что он страдает от дистрофии сетчатки, оценку снижения количества полипептида или его фрагментов по сравнению с количеством полипептида или его фрагментов в глазу человека, не страдающего от дистрофии сетчатки, что служит является диагностическим признаком наличия у пациента дистрофии сетчатки.

Следующим объектом настоящего изобретения являются антисмысловые полинуклеотиды, которые регулируют транскрипцию гена Rdcvf1 или Rdcvf2; другим вариантом осуществления изобретения является двухцепочечная РНК, которая обладает способностью регулировать транскрипцию гена Rdcvf1 или Rdcvf2.

Еще одним объектом изобретения является способ получения указанных выше полипептидов, фрагментов полипептидов, вариантов и производных, фрагментов вариантов и производных и их аналогов. Предпочтительным вариантом осуществления этого объекта изобретения являются способы получения указанных выше полипептидов Rdcvf1, предусматривающие культивирование клеток-хозяев, которые несут встроенный экспрессионный вектор, содержащий полученный экзогенным путем полипептид, кодирующий Rdcvf1 или Rdcvf2, в условиях, пригодных для экспрессии полипептидов Rdcvf1 или Rdcvf2 в хозяине, и последующее выделение экспрессированного полипептида.

Еще одним объектом изобретения являются продукты, композиции, процессы и способы, в которых применяют указанные выше полипептиды и полинуклеотиды в том числе для научных, биологических, клинических и терапевтических целей.

Другими конкретными предпочтительными объектами изобретения являются антитело или его фрагмент, обладающие способностью специфически связываться с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, т.е. Rdcvf1, или SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, т.е. Rdcvf2. В этой связи наиболее предпочтительными объектами являются антитела, обладающие высокой избирательной способностью в отношении полипептидов Rdcvf1 или Rdcvf2 млекопитающего, предпочтительно мыши и наиболее предпочтительно человека, или фрагментами таких полипептидов Rdcvf1 или Rdcvf2. Родственным с этим объектом изобретения является антитело или его фрагмент, которое(й) связывается с фрагментом или частью аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14.

Следующим объектом изобретения являются способы лечения заболевания у пациента, где заболевание опосредуется или связано с изменением экспрессии гена Rdcvf1 или Rdcvf2, например, снижением уровня полипептида RDCVF1 или RDCVF2 в глазу, предусматривающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества протеина RDCVF1 или RDCVF2, представленного в SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, или родственного протеина или его фрагмента или части. В изобретении предложены также способы диагностики с помощью иммуноанализа заболевания или состояния, связанного со снижением экспрессии гена Rdcvf1 или Rdcvf2 или со снижением количества полипептида RDCVF1 или RDCVF2, у пациента, предусматривающие применение антитела, которое связывается с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, или ее фрагмент или часть.

Еще одним объектом изобретения являются клетки, которые могут размножаться in vitro, предпочтительно клетки позвоночных, которые способны при их выращивании в виде культуры продуцировать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14 или ее фрагменты, где клетки содержат контролирующие транскрипцию последовательности ДНК, отличные от мышиных или человеческих контролирующих транскрипцию последовательностей Rdcvf1 или Rdcvf2, причем контролирующие транскрипцию последовательности контролируют транскрипцию ДНК, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14 или ее фрагменты.

Родственным объектом настоящего изобретения является способ получения полипептидов Rdcvf1 или Rdcvf2, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, содержащей встроенный в нее экспрессионный вектор, который содержит полученный экзогенным путем полинуклеотид, кодирующий Rdcvf1 или Rdcvf2, в условиях, пригодных для экспрессии полипептидов Rdcvf1 или Rdcvf2 в клетке-хозяине, с получением экспрессированного полипептида, и выделение экспрессированного полипептида.

Еще одним объектом настоящего изобретения являются способы анализа и наборы, включающие компоненты, необходимые для обнаружения аномальной экспрессии, например, пониженного по сравнению с нормальным уровня экспрессии полинуклеотидов Rdcvf1 или Rdcvf2 или полипептидов или их фрагментов в образцах ткани, полученных из организма пациента, где такие наборы содержат, например, антитела, которые обладают способностью к связыванию с Rdcvf1 или Rdcvf2, или олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с полинуклеотидами по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие наборы содержат также инструкции, подробно описывающие процессы применения компонентов набора.

Следующим объектом изобретения является полипептид Rdcvf1 или Rdcvf2, предназначенный для лечения человека или животного. Родственным объектом изобретения является применение полипептида Rdcvf1 или Rdcvf2 или его фрагмента, нуклеотида, кодирующего Rdcvf1 или Rdcvf2, или его фрагмента, или антитела, которое связывается с Rdcvf1 или Rdcvf2 или его фрагментом, для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения дистрофии сетчатки.

Еще одним объектом изобретения является обладающий защитным действием в отношении сетчатки агент, содержащий полипептид, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель. Родственный объект изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид Rdcvf1 или Rdcvf2 или его фрагмент, нукдеотид, кодирующий Rdcvf1 или Rdcvf2 или его фрагмент, предназначенным для лечения дистрофии сетчатки. Еще одним родственным объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида, выбранного из группы, включающей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще одним родственным объектом изобретения является способ лечения дистрофии сетчатки, заключающийся во введении пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полипептида, выбранного из группы, включающей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Еще одним объектом изобретения являются способы идентификации молекул, которые обладают способностью связываться с Rdcvf1 или Rdcvf2 и/или модулировать активность Rdcvf1 или Rdcvf2, или молекул, которые обладают способностью связываться с нуклеотидными последовательностями, которые модулируют транскрипцию или трансляцию Rdcvf1 или Rdcvf2. Такие методы описаны, например, в патентах US 5541070, 5567317, 5593853, 5670326, 5679582, 5856083, 5858657, 5866341, 5876946, 5989814, 6010861, 6020141, 6030779 и 6043024, содержание всех перечисленных патентов включено в полном объеме в настоящее описание в качестве ссылки. Молекулы, выявленные такими методами, также подпадают под объем настоящего изобретения.

Следующий объект изобретения относится к способам введения нуклеиновых кислот по изобретению в один или несколько типов ткани пациента, нуждающегося в таком лечении, для того, чтобы внутри ткани происходила экспрессия и/или секреция клетками одного или нескольких протеинов, кодируемых нуклеиновыми кислотами.

Еще одним объектом изобретения является способ получения предназначенных для имплантации фоторецепторных клеток, предусматривающий культивирование фоторецепторных клеток совместно с RdCVF1 или RdCVF2.

Другие цели, особенности, преимущества и объекты настоящего изобретения будут очевидны специалистам на основе приведенного ниже описания. При этом следует понимать, что приведенное ниже описание и конкретные примеры, касающиеся предпочтительных вариантов осуществления изобретения, представлены только с целью иллюстрации. Для специалистов в данной области после изучения приведенного ниже описания и изучения других разделов настоящего изобретения будет очевидно, что можно сделать различные изменения и модификации в рамках объема и сущности изобретения.

Краткое описание чертежей

На чертежах представлены:

на фиг.1 - нуклеотидная последовательность мышиного Rdcvf1, полученная путем экспрессионного клонирования, и аминокислотная последовательность мышиного RdCVF1;

на фиг.2 - аминокислотная последовательность мышиного Rdcvf1L;

на фиг.3 - нуклеотидная последовательность человеческого Rdcvf1 и аминокислотная последовательность человеческого Rdcvf1;

на фиг.4 - нуклеотидная последовательность человеческого Rdcvf1L и аминокислотная последовательность человеческого Rdcvf1L;

на фиг.5 - нуклеотидная последовательность мышиного Rdcvf2 и аминокислотная последовательность мышиного Rdcvf2;

на фиг.6 - нуклеотидная последовательность мышиного Rdcvf2L и аминокислотная последовательность мышиного Rdcvf2L;

на фиг.7 - нуклеотидная последовательность человеческого Rdcvf2 и аминокислотная последовательность человеческого Rdcvf2;

на фиг.8 - сравнение аминокислотных последовательностей коротких форм Rdcvf: (SEQ ID NO 2, 6, 10 и 14) и длинных форм Rdcvf: (SEQ ID NO 4, 8, 12 и 14);

на фиг.9 - праймеры для GST-Rdcvf1;

на фиг.10 - множественные сравнения последовательностей RDCVF1/RDCVF2;

на фиг.11 - результаты сравнительного анализа последовательностей мышиного и человеческого RDCVF2;

на фиг.12 - результаты множественного сравнительного анализа последовательности мышиного Rdcvf2 и последовательностей EST-клонов be552141, bi517442, bg707818 и bi603812;

на фиг.13 - результаты множественного сравнительного анализа последовательности Rdcvf1 и последовательностей клонов EST bg299078, ai716631, bg294111, be108041 и bg395178;

на фиг.14 - EST-последовательность bg299078, скорректированная для того, чтобы она совпадала с последовательностью Rdcvf1;

на фиг.15 - EST-последовательность bg294111, скорректированная для того, чтобы она совпадала с последовательностью Rdcvf1L;

на фиг.16 - результаты проведенного в режиме реального времени ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аррестина палочками (А) и RdCSF1 (Б) в 5-недельной сетчатке C57BL/6 и 5-недельной N (обозначено серым цветом) и С3Н/НЕ и N (обозначено красным цветом);

на фиг.17 - результаты ОТ-ПЦР-анализа, свидетельствующие о том, что экспрессия Rdcvf2 зависит от присутствия палочек и его экспрессия происходит в других частях ЦНС;

на фиг.18 - результаты ПЦР-анализа, свидетельствующие о том, что экспрессия RdCVF1 зависит от присутствия палочек.

Подробное описание изобретения

Все процитированные заявки на патент, патенты и литературные публикации включены в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки.

При осуществлении настоящего изобретения применяют многочисленные пригодные для данной цели методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК. Эти методы хорошо известны и описаны, например, в Current Protocols in Molecular Biology, тома I, II и III (под ред. F.M.Ausubel), 1997; Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е изд., Cold Spring Harbor, N.Y.; ДНК Cloning: A Practical Approach, тома I и II (под ред. D.N.Glover.), 1985; Oligonucleotide Synthesis (под ред. M.L.Gait.), 1984; Nucleic Acid Hybridization (под ред. Hames и Higgins), 1985; Transcription and Translation (под ред. Hames и Higgins), 1984; Animal Cell Culture (под ред. R.I.Freshney), 1986; Immobilized Cells and Enzymes, изд-во IRL Press, 1986; Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology, изд-во Academic Press, Inc., 1984; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (под ред. J.H.Miller и M.P.Calos, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1987; и Methods in Enzymology, том 154 и том 155 (под ред. Wu и Grossman и Wu соответственно).

В контексте настоящего описания понятие «дифференциально экспрессируемый ген» относится к (а) гену, содержащему по меньшей мере одну из указанных в настоящем описании последовательностей ДНК (например, представленную на фиг.1 и SEQ ID NO: 1, или представленную на фиг.2 и SEQ ID NO: 3); (б) любой последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность, которая кодируется последовательностями ДНК, представленными в настоящем описании (например, представленными на фиг.1 и SEQ ID NO: 2 или представленными на фиг.2 и SEQ ID NO: 4); или (в) любой последовательности ДНК, практически аналогичной приведенным в настоящем описании кодирующим последовательностям.

В контексте настоящего описания понятие "практически аналогичный" применительно к нуклеотидной последовательности в наиболее широком смысле относится к нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности, с которой производится сравнение, где соответствующая последовательность кодирует полипептид, имеющий практически такую же структуру и функцию, что и полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, например, в том случае, если замены аминокислот не оказывают влияния на функцию полипептида. Предпочтительно, чтобы практически аналогичная нуклеотидная последовательность кодировала полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение. Предпочтительно процент идентичности между практически аналогичной нуклеотидной последовательностью и нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, составляет по меньшей мере 90, более предпочтительно по меньшей мере 95, еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Сравнение последовательностей осуществляют с использованием алгоритма сравнения последовательностей Смита-Уотермана (см., например, Waterman M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes, изд-во Chapman & Hall., London: 1995, ISBN 0-412-99391-0, или на сайте http://www-hto.usc.edu/software/seqaln/index.html). В программе localS, версия 1.16, используют следующие параметры: совпадение: 1, штраф за несовпадение: 0,33, штраф за открытие бреши: 2, штраф за расширение бреши: 2. Нуклеотидную последовательность, которая является «практически аналогичной» нуклеотидной последовательности, с которой производится сравнение, гибридизуют с нуклеотидной последовательностью, с которой производится сравнение, в 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С при отмывке 2Х SSC, 0,1% ДСН при 50°С, более предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С при отмывке 1X SSC, 0,1% ДСН при 50°С, еще более предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С при отмывке 0,5Х SSC, 0,1% ДСН при 50°С, предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С при отмывке 0,1X SSC, 0,1% ДСН при 50°С, более предпочтительно в 7% додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК, 0,5 М NaPO₄, 1 мМ ЭДТК при 50°С при отмывке 0,1X SSC, 0,1% ДСН при 65°С, при этом она все еще сохраняет способность кодировать функционально эквивалентный генный продукт.

Представленные в настоящем описании дифференциально экспрессируемые гены экспрессируются в ткани глаза и, в частности, они продуцируются в клетках палочек, однако в тканях человека, страдающего дистрофией сетчатки, такой как пигментный ретинит, связанная с возрастом дегенерация желтого пятна, синдром Барде, синдром Бессена-Корнцвейга, болезнь Беста, хороидема, атрофия мозговых извилин, врожденный амоуроз, синдром Рефсана, синдром Старгардта и синдром Ашера, они продуцируются в уменьшенных количествах, т.е. уровень их экспрессии меньше, чем в соответствующих тканях людей, не страдающих дистрофией сетчатки. Уровни матричной РНК, транскрибированной на основе дифференциально экспрессируемых генов, и протеина, транслированного из такой мРНК, которые присутствуют в тканях палочек и/или связаны с такими тканями, по меньшей мере в два раза, предпочтительно по меньшей мере в пять раз, более предпочтительно по меньшей мере в десять раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно в сто раз ниже уровней мРНК и протеина, выявленных в соответствующих тканях людей, которые не страдают дистрофией сетчатки. В настоящем описании такое снижение транскрипции мРНК Rdcvf1 или Rdcvf2 обозначено как «пониженная транскрипция».

В контексте настоящего описания понятие «клетка-хозяин» относится к прокариотической или эукариотической клетке, несущей гетерологичную ДНК, которая была встроена в клетку путем, например, электропорации, осаждения с помощью фосфата кальция, микроинъекции, трансформации, вирусной инфекции и т.п.

В контексте настоящего описания понятие «гетерологичный» означает «происходящий из различных естественных источников» или относится к состоянию, не встречающемуся в естественных условиях. Например, если клетку-хозяина трансформируют ДНК или геном, полученными из другого организма, в частности, из организма другого вида, то ген является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину, а также по отношению к потомству клеток-хозяев, несущих этот ген. Аналогично этому понятие «гетерологичный» относится к нуклеотидной последовательности, полученной и встроенной в клетку того же исходного типа, встречающегося в естественных условиях, но которая находится в состоянии, не встречающемся в естественных условиях, например, присутствует в другом количестве копий или находится под контролем других регуляторных элементов.

Векторная молекула представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в которую можно встраивать гетерологичную нуклеиновую кислоту и которую затем можно вводить в соответствующую клетку-хозяина. Предпочтительно векторы имеют один или несколько сайтов инициации репликации и один или несколько сайтов, в которые можно встраивать рекомбинантную ДНК. Как правило, векторы обладают определенными характеристиками, по которым клетки, несущие векторы, можно отличать от клеток, не имеющих векторов, например, они кодируют гены, обусловливающие устойчивость к лекарственным средствам. Обычно применяют такие векторы, как плазмиды, вирусные геномы и (прежде всего, в случае дрожжей и бактерий) «искусственные хромосомы».

В настоящем описании «плазмиды», как правило, обозначаются прописной буквой «р», перед которой или после которой следуют заглавные буквы и/или номера в соответствии со стандартными правилами обозначений, известными специалистам в данной области. Указанные в настоящем описании плазмиды, либо поступают в продажу, либо являются общедоступными без ограничений, либо их можно сконструировать на основе доступных плазмид, применяя стандартным образом хорошо известные опубликованные методы. Многие плазмиды и другие клонирующие и экспрессионные векторы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, являются хорошо известными и специалисты в данной области могут легко их использовать. Кроме того, специалисты в данной области легко могут сконструировать любое количество других плазмид, пригодных для применения согласно изобретению. Специалист в данной области на основе настоящего описания легко может понять свойства, конструкцию и применение таких плазмид, а также других векторов по настоящему изобретению.

Понятие «выделенный» означает, что продукт выделен из своего исходного окружения (например, из естественного окружения, если он имеет естественное происхождение). Например, встречающийся в естественных условиях полинуклеотид или полипептид, присутствующий в организме живого животного, не является выделенным, однако этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех сопутствующих материалов, присутствующих в естественных условиях (в природной системе), является выделенным, даже если его затем повторно интродуцируют в природную систему. Такие полинуклеотиды могут представлять собой часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут представлять собой часть композиции и они все еще подпадают под это понятие, если такой вектор или композиция не находятся в их естественном окружении.

В контексте настоящего описания понятие «контролирующая транскрипцию последовательность» относится к последовательностям ДНК, таким как инициирующие последовательности, энхансерные последовательности и промоторные последовательности, которые индуцируют, подавляют или иным образом контролируют транскрипцию кодирующих протеин нуклеотидных последовательностей, с которыми они функционально связаны.

В контексте настоящего описания понятие «последовательности, контролирующие транскрипцию Rdcvf1» или «последовательности, контролирующие транскрипцию Rdcvf2» обозначают любые из таких контролирующих транскрипцию последовательностей, которые, как правило, связаны с геном Rdcvf1 или Rdcvf2 млекопитающих, предпочтительно с геном Rdcvf2, присутствующим в геноме мыши или человека.

В контексте настоящего описания понятие «полученная из организма кроме человека последовательность, контролирующая транскрипцию» обозначает любую последовательность, контролирующую транскрипцию, которая не присутствует в геноме человека.

В контексте настоящего описания понятие «полипептид» используется взаимозаменяемо с понятиями «полипептиды» и «протеин(ы)».

В контексте настоящего описания «химическое производное» полипептида по изобретению означает полипептид по изобретению, который содержит дополнительные химические фрагменты, которые обычно не содержатся в молекуле. Такие фрагменты могут улучшать растворимость, абсорбцию, биологическое время полужизни молекулы и т.д. В альтернативном варианте фрагменты могут снижать токсичность молекулы, устранять или уменьшать какие-либо нежелательные побочные действия молекулы и т.д. Фрагменты, обладающие способностью оказывать такие действия, описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., изд-во Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980).

В контексте настоящего описания «нейрозащитный агент» обозначает соединение, которое предупреждает дегенерацию нервных клеток или защищает их от нее. «Агент, защищающий сетчатку» обозначает соединение, которое предупреждает дегенерацию клеток сетчатки или защищает их от нее.

Под объем изобретения подпадают молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы ДНК, такие как (1) выделенные молекулы, имеющие нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, (2) выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях с выделенной ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, и (3) нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с последовательностями, указанными выше в (1) или (2). Как указано выше, такие условия гибридизации могут быть строгими или не строгими (расслабленными). В тех случаях, когда молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой дезоксиолигонуклеотиды ("олигонуклеотиды"), строгие условия могут обозначать, например, отмывку в 6Х SSC/0,05% пирофосфате натрия при 37°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 14 оснований), при 48°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 17 оснований), при 55°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 20 оснований) и при 60°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 23 оснований). Пригодные диапазоны таких строгих условий для нуклеиновых кислот различного состава описаны у Krause и Aaronson, Methods in Enzymology, 200, 1991, cc.546-556, а также в процитированном выше справочнике Maniatis и др.

Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут действовать в качестве антисмысловых молекул гена-мишени, которые можно применять, например, для регуляции гена-мишени и/или в качестве антисмысловых праймеров в реакциях амплификации нуклеотидных последовательностей гена-мишени. Кроме того, такие последовательности можно использовать в качестве части рибозима и/или последовательностей тройных спиралевидных структур, которые также можно применять для регуляции гена-мишени. Кроме того, такие молекулы можно применять в качестве компонентов в диагностических методах, благодаря чему можно выявлять присутствие аллеля, вызывающего заболевание, связанное с RdCVF1 или RdCVF2.

Под объем изобретения подпадают также (а) векторы, содержащие любую из указанных выше кодирующих последовательностей (т.е. смысловые последовательности) и/или ее комплементы (т.е. антисмысловые последовательности); (б) экспрессионные векторы, которые содержат любую из указанных выше кодирующих последовательностей, функционально связанную с регуляторным элементом, который контролирует экспрессию кодирующих последовательностей, и (в) сконструированные методами генной инженерии клетки-хозяева, которые содержат любую из указанных выше кодирующих последовательностей, функционально связанную с регуляторным элементом, контролирующим экспрессию кодирующих последовательностей в клетке-хозяине. В контексте настоящего описания регуляторные элементы включают (но не ограничиваясь ими) индуцибельные и неиндуцибельные промоторы, энхансеры, операторы и другие известные специалистам в данной области элементы, которые контролируют и регулируют экспрессию.

Под объем изобретения подпадают фрагменты любой из указанных в настоящем описании нуклеотидных последовательностей. Фрагменты полноразмерного гена Rdcvf1 или Rdcvf2 можно использовать в качестве зонда гибридизации для библиотеки кДНК с целью выделения полноразмерного гена и выделения других генов, обладающих высоким уровнем сходства с геном Rdcvf1 или Rdcvf2 и аналогичной биологической активностью. Зонды такого типа предпочтительно содержат по меньшей мере приблизительно 30 оснований и могут содержать, например, от приблизительно 30 до приблизительно 50 оснований, от приблизительно 50 до приблизительно 100 оснований, от приблизительно 100 до приблизительно 200 оснований или более 200 оснований (например, 300). Зонд можно применять также для выявления клона кДНК, соответствующего первичному транскрипту, и геномного клона или клонов, которые содержат полный ген Rdcvf1 или Rdcvf2, включая регуляторную и промоторную области, экзоны и интроны. Примером скрининга является выделение кодирующей области гена Rdcvf1 или Rdcvf2 с использованием известной последовательности ДНК для синтеза олигонуклеотидного зонда или случайного примирования выделенной последовательности, представленной на фиг.1-8. Меченые олигонуклеотиды, имеющие последовательность, комплементарную последовательности гена по настоящему изобретению, используют для скрининга библиотеки человеческой кДНК, геномной ДНК для определения индивидуальных клонов из библиотеки, которые гибридизуются с зондом.

Помимо описанных выше последовательностей генов можно без многочисленных экспериментов идентифицировать и легко выделять с помощью методов молекулярной биологии ортологи таких последовательностей, которые могут присутствовать, например, в других видах. Кроме того, в других генетических локусах генома могут присутствовать гены, которые кодируют протеины, обладающие большой степенью гомологии (гомологи) с одним или несколькими доменами таких генных продуктов. Такие гены можно идентифицировать также с помощью аналогичных методов. Примеры ортологов или гомологов представлены на фиг.8, 10, 11, 12 или 13.

Например, в выделенную экспрессированную последовательность гена можно ввести метку и использовать ее для скрининга библиотеки кДНК, полученной из мРНК представляющего интерес организма. Можно использовать расслабленные условия гибридизации, если библиотека кДНК получена из организма, отличного от типа организма, из которого выведена несущая метку последовательность. В альтернативном варианте для скрининга геномной библиотеки, полученной из представляющего интерес организма, можно применять меченый фрагмент, используя и в этом случае соответствующие расслабленные условия. Такие расслабленные условия хорошо известны специалистам в данной области и их можно целенаправленно варьировать в зависимости от филогении конкретных организмов, из которых получают библиотеку и меченые последовательности. Инструкции, касающиеся выбора таких условий, можно найти, например, в процитированном выше руководстве Sambrook и др.

Кроме того, можно выделять ранее неизвестную экспрессируемую последовательность генного типа, осуществляя ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе аминокислотных последовательностей, кодируемых представляющим интерес геном. В качестве матрицы для реакции может служить кДНК, полученная путем обратной транскрипции мРНК, выделенной из линий клеток или ткани человека или организма, отличного от человека, в отношении которых известно или имеется предположение, что они экспрессируют гомологи или полученные в результате сплайсинга варианты.

ПЦР-продукт можно субклонировать и секвенировать для подтверждения того, что амплифицированные последовательности представляют собой последовательности, аналогичные нуклеотидным последовательностям экспрессированного