Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела

Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 60/558290, поданной 31 марта 2004, данная заявка заявляет приоритет этой предварительной заявки согласно 35 U.S.C. § 119, содержание которой включено сюда в виде ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гуманизированным анти-ТФР-бета-антителам и способам их получения и их применению в способах для лечения связанных ТФР-бета нарушений. Антитела являются пригодными, например, для иммуноаффинных очисток, иммуноанализов, визуализации в условиях in vivo, радиорецепторного анализа и лечений, где желательно получить антагонистическое действие в отношении активности ТФР-бета, в частности активности ТФР-бета1.

Уровень техники

Трансформирующий фактор-бета роста (ТФР-бета) представляет собой полифункциональный цитокин, первоначально названный за его способность трансформировать нормальные фибробласты в клетки, способные к «якорь»-независимому росту. ТФР-бета, в основном продуцируемый гематопоэтическими и опухолевыми клетками, может регулировать, т.е. стимулировать или ингибировать рост и дифференциацию клеток из различных нормальных тканей и новообразований (Sporn et al., Science, 233: 532 (1986)) и стимулировать образование и развитие различных стромальных элементов. Общий обзор по ТФР-бета и его функциям смотри у Sporn et al., J. Cell Biol., 105: 1039-1045 (1987) и Sporn and Roberts, Nature, 332: 217-219 (1988).

Известно, что они принимают участие во многих пролиферативных и не относящихся к пролиферации клеточных процессах, таких как пролиферация и дифференциация клеток, эмбриональное развитие, образование внеклеточного матрикса, развитие костей, заживление ран, гематопоэз и иммунные и воспалительные реакции. Pircher et al., Biochem Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986); Wakefield et al., Growth Factors, 1: 203-218 (1989); Roberts and Sporn, pp 419-472 in Handbook of Experimental Pharmacology eds M.B.Sporn & A.B.Roberts (Springer, Heidelberg, 1990); Massague et al., Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990); Singer and Clark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999). Также ТФР-бета применяется для лечения и профилактики заболеваний слизистой кишечника. WO 2001/24813.

Особый интерес с точки зрения иммунологии представляет высокая иммуносупрессивная активность ТФР-бета, которая включает ингибирование лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) (Ranges et al., J. Exp. Med., 166: 991 (1987); Espevik et al., J. Immunol., 140: 2312 (1988); Grimm et al., Cancer Immunol. Immunother., 27: 53 (1988); Kasid et al., J. Immunol., 141: 690 (1988); Mule et al., Cancer Immunol. Immunother., 26: 95 (1988)), ингибирование лимфопоэза В-клеток и экспрессии легкой цепи каппа (Lee et al., J. Exp. Med., 166: 1290 (1987)), отрицательную регуляцию гематопоэза (Hino et al., Br. J. Haematol., 70: 143 (1988); Sing et al., Blood, 72: 1504 (1988)), понижающую регуляцию экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках (Czarniecki et al., J. Immunol., 140: 4217 (1988); Zuber et al., Eur. J. Immunol., 18: 1623 (1988)) и ингибирование пролиферации антиген-активированных В-лимфоцитов в ответ на фактор роста В-клеток (Petit-Koskas et al., Eur. J. Immunol., 18: 111 (1988)). На основании наблюдения о том, что многие опухоли человека (deMartin et al., EMBO J., 6: 3673 (1987); Kuppner et al., Int. J. Cancer, 42: 562 (1988)) и многие линии опухолевых клеток (Derynck et al., Cancer Res., 47: 707 (1987); Roberts et al., Br. J. Cancer, 57: 594 (1988)) продуцируют ТФР-бета, можно предположить о возможном механизме для данных опухолей ускользать от нормального иммунологического контроля. На основании данной отрицательной иммуномодуляции в сочетании с наблюдением о том, что некоторые трансформированные клеточные линии теряют способность к ответной реакции на ТФР-бета аутокринным образом (Wakefield et al., J. Cell Biol., 105: 965 (1987); McMahon et al., Cancer Res., 46: 4665 (1986)), и что ТФР-бета стимулирует образование стромы и снижает иммунный контроль над опухолью, можно предположить о привлекательных моделях отмены контроля и пролиферации новообразований (Roberts et al., Br. J. Cancer, выше).

Кроме того, в патентах США № 5824297 и 5262319 раскрывается способ ингибирующего цитотоксического отравления нормальных клеток введением в них ТФР-бета, такого как ТФР-бета3.

В настоящее время идентифицировано, по меньшей мере, пять форм ТФР-бета, ТФР-бета1, ТФР-бета2, ТФР-бета3, ТФР-бета4 и ТФР-бета5. Известны подходящие способы для очистки данного семейства ТФР-бета от различных видов, таких как человек, мышь, зеленая мартышка, свинья, крупный рогатый скот, курица и лягушка, и из различных источников организма, таких как кость, тромбоциты или плацента, для получения его в рекомбинантной клеточной культуре и для определения его активности. Смотри, например, Derynck et al., Nature, 316: 701-705 (1985); публикации Европейского патента № 200341, опубликованная 10 декабря 1986, 169016, опубликованная 22 января 1986, 268561, опубликованная 25 мая 1988, и 267463, опубликованная 18 мая 1988; патент США № 4774322; Cheifetz et al., 48: 409-415 (1987); Jakowlew et al., Molecular Endocrin., 2: 747-755 (1988); Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 4715-4719 (1988); Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986); Sharples et al., DNA, 6: 239-244 (1987); Derynck et al., Nucl. Acids Res., 15: 3188-3189 (1987); Derynck et al., Nucl. Acids Res., 15: 3187 (1987); Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988)); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 261: 5693-5695 (1986); Madisen et al., DNA, 7: 1-8 (1988) и Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 79-82 (1988), полное содержание которых включено здесь в краткой форме для сведения.

Активированная форма ТФР-бета представляет гомодимер, образованный при димеризации С-концевых 112 аминокислот 390-аминокислотного предшественника (Derynck et al., Nature, выше). ТФР-бета2 имеет предшественник из 414 аминокислот и он также процессируется в гомодимер из С-концевых 112 аминокислот, который обладает примерно 70% гомологией с активной формой ТФР-бета1 (Marquardt et al., J. Biol. Chem., 262: 12127 (1987)). ТФР-бета2 выделили из свиных тромбоцитов (Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: 1946-1949 (1987)) и клеток человеческой глиобластомы (Wrann et al., EMBO J., 6: 1633 (1987)) и был клонирован рекомбинантный человеческий ТФР-бета2 (deMartin et al., выше). Клонировали рекомбинантный ТФР-бета1 (Derynck et al., Nature, выше) и экспрессировали в клетках яичника китайских хомяков (Gentry et al., Mol. Cell Biol., 7: 3418-3427 (1987)). Смотри патенты США № 4774322; 4843063 и 4848063, касающиеся CIF-A и CIF-B, в настоящее время названные соответственно ТФР-бета1 и 2. Ellingsworth et al., J. Biol. Chem., 261: 12362-12367 (1986). Несмотря на наличие 14 аминокислотных различий в первых 36 аминокислотных остатках двух форм (ТФР-бета1 и ТФР-бета2) их биологическая активность является сходной. Cheifetz et al., Cell, 48: 409-415 (1987); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262, выше.

ТФР-бета3, ТФР-бета4 и ТФР-бета5, которые являются наиболее поздними открытыми формами ТФР-бета, были идентифицированы при скрининге библиотек кДНК. Ни один из данных трех предполагаемых белков не был выделен из природных источников, хотя, в нозерн-блоттинге была показана экспрессия соответствующих мРНК. Были клонированы человеческий и свиной ТФР-бета3, и они были описаны как гомодимеры и их экспрессировали в клетках яичника китайских хомяков (Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988); ten Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715 (1988); патент США № 4886747). Также смотри WO 1992/00318, касающуюся белков ТФР-бета3 и антител к ним. ТФР-бета1 отличается от ТФР-бета2 в основном 27 консервативными заменами и от ТФР-бета3 в основном 22 консервативными заменами. Данные различия относятся к 3-D структуре. Schlunegger and Grutter, Nature, 358: 430-434 (1992).

ТФР-бета4 и ТФР-бета5 клонировали соответственно из библиотеки кДНК куриных хондроцитов (Jakowlew et al., Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 (1988)) и из библиотеки кДНК ооцитов лягушки. Библиотеку кДНК ооцитов лягушки можно подвергнуть скринингу с использованием зонда, полученного из одной или более последовательностей другого типа ТФР-бета. мРНК ТФР-бета4 детектируется в куриных хондроцитах эмбрионов, но в меньшем количестве по сравнению с мРНК ТФР-бета3 в развивающихся эмбрионах или в фибробластах куриных эмбрионов. мРНК ТФР-бета5 экспрессировали в эмбрионах лягушки на стадии, предшествующей нейруле, и в клетках головастика Xenopus (ХТС).

Рекомбинантная продукция ТФР-бета1, ТФР-бета2 и ТФР-бета3 описана в патентах США № 5061786, 5268455 и 5801231. Смотри также патент США № 5120535 по ТФР-бета2, использованному для лечения гормонально зависимой карциномы и для продукции антител. Был идентифицирован гетеродимер ТФР-бета1 и ТФР-бета2, названный ТФР-бета1.2 и были показаны его применения, как раскрыто в патентах США № 4931548 и 5304541, в последнем также раскрывается антитело к нему. В WO 1990/00900, поданной 20 июля 1989, раскрывается лечение воспалительных нарушений гомодимерами ТФР-бета1 и -бета2 и гетеродимером ТФР-бета1.2. В патенте США № 5462925 раскрывается гетеродимер ТФР-бета2 и ТФР-бета3. В патенте США № 5780436 раскрываются небольшие пептидные миметики ТФР-бета.

Повышенная активность ТФР-бета принимает участие в развитии большого количества патологических состояний, включая, но не ограничиваясь этим: i) фиброз, рубцевание и адгезию во время заживления ран; ii) фиброзные заболевания легких, печени и почек; iii) атеросклероз и артериосклероз; iv) некоторые типы злокачественных опухолей, включая злокачественные опухоли простаты, нейроэндокринные опухоли пищеварительной системы, опухоль шейки матки, глиобластому и опухоль желудка; v) ангиопатию, васкулопатию, нефропатию; vi) рассеянный склероз; vii) вирусную инфекцию, такую как гепатит С и ВИЧ; и viii) иммунологические и воспалительные нарушения и недостаточности, такие как ревматоидный артрит. Модуляция иммунной и воспалительной реакций под действием ТФР-бета включает: i) ингибирование пролиферации всех подгрупп Т-клеток; ii) ингибирующие эффекты в отношении пролиферации и функции В-лимфоцитов; iii) понижающую регуляцию активности природных клеток-киллеров и ответной реакции Т-клеток; iv) регуляцию продукции цитокинов иммунными клетками; v) регуляцию функции макрофагов и vi) рекрутинг и активацию лейкоцитов.

Конкретно в отношении злокачественных опухолей известно, что члены семейства ТФР-бета обладают рядом биологических активностей, имеющих отношение к онкогенности (включая ангиогенез) и метастазирование. ТФР-бета ингибирует пролиферацию многих клеточных типов, включая эндотелиальные клетки капилляров и клетки гладкой мускулатуры. ТФР-бета снижает экспрессию интегрина (альфа1бета1, альфа2бета1 и альфаvбета3, принимающих участие в миграции эндотелиальных клеток). Интегрины участвуют в миграции всех клеток, включая относящиеся к метастазам. ТФР-бета снижает экспрессию матричной металлопротеиназы, необходимой и для ангиогенеза, и для метастазирования. ТФР-бета индуцирует ингибитор активатора плазминогена, который ингибирует каскад протеиназы, необходимый для ангиогенеза и метастазирования. ТФР-бета индуцирует нормальные клетки для подавления трансформированных клеток. Смотри, например, Yingling et al., Nature Reviews, 3 (12): 1011-1022 (2004), где раскрывается, что отмена регулирования ТФР-бета участвует в патогенезе различных заболеваний, включая злокачественную опухоль и фиброз, и представляет обоснование для рассмотрения ингибиторов сигнальных путей с участием ТФР-бета в качестве препаратов для лечения злокачественных опухолей, биомаркеров/диагностических средств, разрабатываются небольшие молекулы ингибиторов, и для их разработки применяется целенаправленная модель для открытия лекарственных препаратов. Очень важна ранняя диагностика злокачественной опухоли (Ruth et al., Nature Reviews Cancer, 3: 243-252 (2003)), и исследуется патогенез метастазирования опухолей. Fidler, Nature Reviews Cancer, 3: 453-458 (2003).

ТФР-бета проявил себя основным модулятором ангиогенеза при регуляции пролиферации, миграции эндотелиальных клеток, метаболизма внеклеточного матрикса (ECM) и экспрессии молекул адгезии. Он представляет эффективный ингибитор роста нормальных эпителиальных клеток молочной железы и ряда линий опухолевых клеток молочной железы. Оказалось, что ТФР-бета проявляет плейотропное действие в онкогенезе опухолей молочной железы контекстуальным образом, т.е. он подавляет онкогенез на ранней стадии посредством непосредственного ингибирования ангиогенеза и роста опухолевых клеток. Однако гиперпродукция ТФР-бета развившейся опухолью может усиливать прогрессирование заболевания посредством опосредованной стимуляции ангиогенеза и иммунной супрессии. Антиген мембраны клеток CD 105 (эндоглин) связывается с ТФР-бета1 и ТФР-бета3 и предпочтительно экспрессируется в ангиогенных васкулярных эндотелиальных клетках. Снижение уровня CD 105 в HUVEC приводит к подавлению ангиогенеза в условиях in vitro и высокой гибели клеток в присутствии ТФР-бета1. Мыши с отсутствием CD 105 погибают в утробе при нарушении сосудистой сети, указывая на важную роль CD 105 в развитии сосудов. Li et al., Microsc. Res. Tech., 52: 437-449 (2001). Аномальный ангиогенез, но не нарушенный гематопоэз наблюдали у мышей с дефицитом рецептора ТФР-бета типа I. Larsson et al., EMBO J., 20(7): 1663-1673 (2001). Кроме того, дефицит рецептора ТФР-бета типа II приводит к дефектам гематопоэза и васкулогенеза желточного мешка. Oshima et al., Developmental Biology, 179 (1): 297-302 (1996). Кроме того, аномалии сердца и печени и пониженную чувствительность к трансформирующему фактору-бета 2 роста наблюдали в эмбрионах с дефицитом рецептора ТФР-бета типа III. Stenvers et al., Mol. Cell Biol., 23(12): 4371-4385 (2003). Кроме того, направленный разрыв мышиного гена ТФР-бета1 приводит к развитию многоочагового воспалительного заболевания Shull et al., Nature, 359 (6397): 693-699 (1992). Было показано, что многоочаговое воспаление с ранним началом у мышей с отсутствием ТФР-бета является опосредованным лимфоцитами. Diebold et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA), 92 (26): 12215-12219 (1995).

Наиболее важной, не относящейся к пролиферации функцией ТФР-бета, является увеличение образования внеклеточного матрикса. Хотя, в основном это достигается посредством увеличенной транскрипции коллагена и фибронектина, ингибирование протеаз из деградирующего матрикса также вносит свой вклад в его стабильность. Деградация внеклеточного матрикса подавляется при снижении секреции самих протеаз и одновременном повышении концентрации ингибиторов протеаз.

В WO 1984/001106 описывается ТФР-бета1 и его применение для стимуляции клеточной пролиферации и восстановления тканей, заживления ран и лечения травм. В патенте США № 4806523 раскрываются ТФР-бета1 и ТФР-бета2, оба обладающие противовоспалительной активностью, и они представляют собой ингибиторы стимулированной митогеном пролиферации Т-клеток и активации В-клеток. Также сообщается, что ТФР-бета локализуется в центрах гематопоэза и лимфопоэза, и что ТФР-бета может, следовательно, быть пригодным для лечения показаний, связанных с нарушением функции или дисфункции гематопоэза и лимфопоэза.

Было показано, что ТФР-бета2 является преобладающей изоформой ТФР-бета в невральной сетчатке, пигментной сосудистой оболочке глаза и стекловидном теле человеческого глаза (Pfeffer et al., Exp. Eye Res., 59: 323-333 (1994)), и он был обнаружен в глазной жидкости человека в образцах из глаз после удаления катаракты с имплантацией внутриглазных линз. Jampel et al., Current Eye Research, 9: 963-969 (1990). Нетрансформированные пигментные эпителиальные клетки сетчатки человека преимущественно секретируют ТФР-бета2. Kvanta, Ophtalmic Res., 26: 361-367 (1994).

Другие заболевания, которые потенциально могут поддаваться лечению антителами против ТФР-бета, включают респираторный дистресс-синдром взрослых, цирроз печени, состояние после инфаркта миокарда, рестеноза после ангиопластики, келоидные рубцы и склеродерму. Повышенная экспрессия ТФР-бета2 при остеопорозе (Erlenbacher et al., J. Cell Biol., 132: 195-210 (1996)) означает, что это заболевание потенциально можно лечить антителами против ТФР-бета2.

В результате участия ТФР-бета в развитии большого количества патологических состояний существует большой интерес к разработке ингибиторов ТФР-бета. Многие предположения для ингибиторов ТФР-бета основаны на антителах.

Это насущная задача выделить фрагмент антитела, специфичный для ТФР-бета одинаковых видов. У животных в норме не продуцируются антитела к собственным антигенам, это явление было названо толерантностью (Nossal, Science, 245: 147-153 (1989). В основном вакцинация собственным антигеном не приводит к продукции циркулирующих антител. Следовательно, трудно индуцировать образование антител у человека к собственным антигенам человека. Кроме того, также существуют этические проблемы при вакцинации людей. При индукции образования антител, не относящихся к человеческим, специфичным к ТФР-бета, имеется ряд проблем. ТФР-бета представляет собой иммуносупрессивную молекулу и дополнительно имеется высокая консервативность последовательности между человеческой и мышиной молекулами ТФР-бета. Мышиный и человеческий ТФР-бета1 различаются только по одному аминокислотному остатку, замена аланина (человеческий) на серин (мышиный) в глубоком остатке. Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986). Мышиный и человеческий ТФР-бета2 различаются только по трем аминокислотным остаткам; остаток 59 (Т мышиный, S человеческий); остаток 60 (К мышиный, R человеческий) и остаток 94 (N мышиный, К человеческий). Это затрудняет индукцию антител у мышей против человеческого ТФР-бета. Кроме того, любые индуцированные антитела могут быть направлены только против ограниченной группы эпитопов.

Были получены моноклональные антитела против ТФР-бета при иммунизации цыплят и иммортализации В-клеток, использованные, например, для диагностики и пассивного лечения заболевания, как описано в патенте США № 6143559.

Были индуцированы поликлональные антитела, связывающиеся с человеческим ТФР-бета1 и человеческим ТФР-бета2, против обоих нейтрализующих и не-нейтрализующих эпитопов у кроликов (Danielpour et al., Growth Factors, 2: 61-71 (1989); Roberts et al., Growth Factors, 3: 277-286 (1990)), кур (R&D Systems, Minneapolis) и индеек (Danielpour et al., J. Cell Physiol., 138: 79-86 (1989); Danielpour and Sporn, J. Cell Biochem., 13B: 84 (1989)).

Пептиды, представляющие частичные или полные последовательности ТФР-бета, также использовали в качестве иммуногенов для получения нейтрализующей поликлональной антисыворотки у кроликов. Ellingsworth et al., J. Biol. Chem., 261: 12362 (1986); Ellingsworth et al., Cell Immunol., 114: 41 (1988); Border et al., Nature, 346: 371-374 (1990); Flanders, Biochemistry 27: 739-746 (1988); Flanders et al., Growth Factors, 3: 45-52 (1990); Flanders et al., Development, 113: 183-191 (1991). Кроме того, имеются ограниченные сообщения о выделении мышиных моноклональных антител против ТФР-бета. После иммунизации бычьим ТФР-бета2 (идентичным человеческому ТФР-бета2) выделяли три не-нейтрализующих моноклональных антитела, которые были специфичными для ТФР-бета2 и одно нейтрализующее антитело, специфичное для ТФР-бета1 и ТФР-бета2. Dasch et al., J. Immunol., 142: 1536-1541 (1989). В другом сообщении после иммунизации человеческим ТФР-бета1 выделяли нейтрализующие антитела, специфичные либо для ТФР-бета1, либо перекрестно реагирующие с ТФР-бета1, ТФР-бета2 и ТФР-бета3. Lucas et al., J. Immunol., 145: 1415-1422 (1990). Было показано, что поликлональная антисыворотка к человеческому и свиному ТФР-бета (Keski-Oja et al., Cancer Res., 47: 6451-6458 (1987)) и к свиному ТФР-бета2 (Rosa et al., Science, 239: 783-785 (1988)) нейтрализует биологическую активность соответственно ТФР-бета1 и ТФР-бета2. Кроличья анти-ТФР-бета сыворотка описана Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4167-4171 (1986). Кроме того, были получены RIA против ТФР-бета1 с использованием кроличьей антисыворотки для количественного определения высвобожденного белка во время агрегации тромбоцитов. Assoian and Sporn, J. Cell Biol., 102: 12178-1223 (1986).

Промышленно доступным является нейтрализующее мышиное моноклональное антитело, которое связывается с изоформами ТФР-бета2 и ТФР-бета3, производства Genzyme Diagnostics. Промышленно доступно мышиное моноклональное антитело против человеческого ТФР-бета1 производства R&D Systems. Данное антитело только в слабой степени нейтрализует ТФР-бета1 в тесте нейтрализации. Также были получены нейтрализующие мышиные моноклональные антитела от мышей, иммунизированных человеческими пептидами ТФР-бета1, имеющими аминокислотные положения 48-60 (антитело реагировало с ТФР-бета1, ТФР-бета2 и ТФР-бета3) и аминокислотные положения 86-101 (антитело, специфичное для ТФР-бета1). Hoefer and Anderer, Cancer Immunol. Immunother., 41: 302-308 (1995).

С помощью фаговой технологии антител (WO 1992/01047; WO 1993/19172; WO 1992/20791; WO 1993/06213 и WO 1993/11236) была предложена возможность непосредственно выделять человеческие антитела против человеческого ТФР-бета. Описано выделение аутоантител из спектра сегментов антител, расположенных в фаге. Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Nissim et al., EMBO J., 13: 692-698 (1994); Griffiths et al., 13: 3245-3260 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10003-10007 (1993) и WO 1993/11236. Кроме того, Tempest et al., Immunotechnology, 2: 306 (1996) описывает человеческие антитела, специфичные для человеческого ТФР-бета, полученного из библиотек фагового дисплея.

В WO 1997/13844 раскрывается выделение человеческих антител, специфичных к человеческому ТФР-бета1, и человеческих антител, специфичных к человеческому ТФР-бета2. В ней описываются антитела с доменом VH 31G9 и варианты домена, конкретнее, антитело CS37, которое включает домен VH 31G9 вместе с VL CS37 и варианты данного домена, включая антитела, которые: i) конкурируют с CS37 в ELISA за связывание с ТФР-бета1; ii) предпочтительно связываются с ТФР-бета1 по сравнению с ТФР-бета3 и iii) нейтрализуют ТФР-бета1.

Патент США № 6492497 основан на идентификации антител, которые относятся к CS37, но которые неожиданно обладают преимущественными свойствами в отношении связывания и нейтрализации ТФР-бета1. Они не связываются или не нейтрализуют ТФР-бета2 или ТФР-бета3. Эпитоп для данных антител находится в С-концевой области ТФР-бета1 (остатки 83-112) и включает петлю, состоящую из остатков 92-98 ТФР-бета1, также известную как «фингер» («палец») 2, область, которая была идентифицирована как взаимодействующая с рецептором ТФР-бета.

Моноклональное антитело против человеческого ТФР-бета1, которое является высоко специфичным, и его можно использовать для диагностики опухолей и аффинной хроматографии, раскрыто в заявке на патент Японии 95068278 В2, опубликованной 26 июля 1995 г.

Применение ТФР-бета и его антагонистов для модуляции кровяного давления и для лечения соответственно гипертензии и гипотензии раскрыто в WO 1991/19513.

В WO 1991/15223 раскрывается очищенный фактор супрессии респираторного приступа, который можно инкубировать с индюшачьим анти-ТФР-бета-антителом, которое специфически связывается с ТФР-бета1. Антитело полностью нейтрализовало активность ТФР-бета1 на активированных макрофагах, но не оказывало влияния на фактор супрессии респираторного приступа на макрофаге.

Подавление активности ТФР-бета и накопления внеклеточного матрикса при диагностике и лечении фиброзных заболеваний, таких как гломерулонефрит, контактированием с супрессором активности продукции ECM, таким как анти-ТФР-бета-антитело, раскрыто в WO 1991/04748 и WO 1993/10808. Также раскрываются антитела против линейных пептидов из ТФР-бета, и клетки, продуцирующие антитела.

В патенте США № 5888705 раскрывается способ индукции пролиферации клеток поджелудочной железы взрослого человека или их дифференциации контактированием первичных культур таких клеток с одним фактором роста гепатоцитов или в комбинации с анти-ТФР-бета-антителами.

В WO 2001/66140 раскрывается применение антагонистов ТФР-бета, таких как антитела, для лечения или профилактики потери функции почек.

В WO 2000/40227 раскрываются способы лечения состояний, связанных с накоплением избытка внеклеточного матрикса с использованием средств, которые ингибируют ТФР-бета, таких как антитела.

Антитела к ТФР-бета раскрываются в качестве средств, ослабляющих апоптоз почечных канальцев при односторонней закупорке мочеточника, Miyajima et al., Kidney International., 58: 2301-2313 (2000).

Продолжительная профилактика почечной недостаточности, избыточной экспрессии гена матрикса и увеличения гломерулярного мезангиального матрикса при обработке моноклональным анти-ТФР-бета-антителом у мышей db/db с диабетом раскрывается Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(14): 8015-8020 (2000).

Описан хороший результат лечения нейтрализующими анти-ТФР-бета-антителами при экспериментальном заболевании почек при диабете, Han and Ziyadeh, Peritoneal dialysis international, 19 Suppl 2: S234-237 (1999). Было установлено, что ТФР-бета является ключевым медиатором в развитии гипергликемии и заболевания почек при диабете. Sharma and Ziyadeh, Diabetes, 44 (10) p 1139-46 (1995). Применение ТФР-бета при диабетической нефропатии раскрыто Border et al., Diabetes Metab. Rev., 12/4: 309-339 (1996).

В патенте США № 5662904 описывается композиция для применения в лечении ран для подавления образования рубцевой ткани. Примером такой композиции является антитело, нейтрализующее фактор роста, такое как антитела против ТФР-бета1, ТФР-бета2 и PDGF.

В патенте США № 5972335 раскрываются композиции, содержащие, по меньшей мере, два антитела, для применения в стимуляции заживления ран при фиброзных заболеваниях, где первое антитело является специфичным для одного эпитопа в ТФР-бета1 и второе антитело специфично для одного эпитопа в ТФР-бета2.

В патенте США № 5958411 раскрываются способы лечения патологии ЦНС введением нейтрализующих анти-ТФР-бета-антител.

В патенте США № 5616561 раскрывается способ лечения повреждения тканей, вызванного облучением, с использованием антагонистов ТФР-бета, таких как антитела.

В патенте США № 6500920 раскрывается пептид из 10-25 аминокислот, содержащий аминокислоты 49-58 ТФР-бета2, где пептид способен ингибировать специфическое связывание ТФР-бета с рецептором ТФР-бета на клетке.

В заявке на патент США № 2002/0176858 и патентах США № 5693607; 6419928; 6090383; 5783185; 5772998 и 5571714, а также ЕР 489062; 557418 и 669833, а также WO 1992/08480; 1994/09815 и 1994/18991 раскрываются моноклональные антитела против ТФР-бета, включая таковые, которые нейтрализуют активность ТФР-бета1 и ТФР-бета2, и их применение в терапевтических целях для лечения показаний, при которых имеется гиперпродукция ТФР-бета (например, при остром поражении печени, интерстициальном фиброзе легких, циррозе печени, хроническом фиброзе печени и фиброзных кожных заболеваниях, таких как склеродерма) и для диагностики или лечения злокачественных образований (например, сарком и меланом) и метастатических опухолей.

Новые антитела для лечения нарушений, связанных с ТФР-бета3, например, остеопороза, СПИДа, злокачественной опухоли и т.д., раскрыты в WO 1992/00330 и патенте США № 5262319. Такие антитела связываются с человеческим ТФР-бета3 и не проявляют перекрестной реактивности с ТФР-бета1 и ТФР-бета2.

В патенте США № 6509318 раскрывается семейство небольших пептидов с ингибирующей в отношении ТФР-бета активностью для применений, таких как подавление образования рубцевой ткани во время заживления раны.

Применение соединения (например, антитела), которое может ингибировать биологическую активность ТФР-бета на предварительно поврежденных нейронах для лечения церебральных нарушений, например ишемии мозга, раскрыто в WO 2000/13705.

Моноклональное антитело, распознающее все три изоформы ТФР-бета, которое может ингибировать биологическую активность ТФР-бета на предварительно поврежденных нейронах для лечения церебральных нарушений, раскрывается в WO 2000/54804. Такое антитело применяли для нейтрализации эндогенного ТФР-бета во время основного периода онтогенетической гибели клеток ресничного узла (CG) и спинномозговых узлов (DRG), а также моторных нейронов спинного мозга в куриных эмбрионах.

Диагностирование или прогнозирование вероятности развития чувствительной к тамоксифену или резистентной к тамоксифену опухоли молочной железы с использованием антитела, специфичного к ангиогенным факторам или рецепторам, такого как антитело, специфичное к ТФР-бета3, раскрыто в WO 2000/34788.

В ЕР 945464 В1 раскрываются члены со специфическим связыванием с человеческим ТФР-бета, т.е. члены со специфическим связыванием, содержащие человеческие домены связывания антитела-антигена, специфичные для человеческого ТФР-бета, которые предпочтительно специфически связываются с изоформами ТФР-бета2 и ТФР-бета1, или обоими, по сравнению с ТФР-бета3. Члены со специфическим связыванием можно выделить и применять для лечения заболевания, в частности, фиброзного заболевания, и также иммунного/воспалительного заболеваний.

Было показано, что антитела против ТФР-бета являются эффективными в лечении гломерулонефрита (Border et al., Diabetes Metab. Rev., выше); нейронального рубцевания (Logan et al., Eur. J. Neurosci., 6: 355-363 (1994); WO 1993/19783); рубцевания кожи (Shah et al., Lancet, 339: 213-214 (1992); Shah et al., J. Cell Science, 107: 1137-1157 (1994); Shah et al., J. Cell Science, 985-1002 (1995); WO 1992/17206; фиброза легких (Giri et al., Thorax, 48: 959-966 (1993)); повреждения артерий (Wolf et al., J. Clin. Invest., 93: 1172-1178 (1994)); и ревматоидного артрита (Wahl et al., J. Exp. Medicine, 177: 225-230 (1993)). Было высказано предположение, что ТФР-бета3 действует антагонистически по отношению к ТФР-бета1 и ТФР-бета2 при рубцевании кожи (Shah et al., 1995, выше).

Arteaga et al., J. Clin. Invest., 92: 2569-2576 (1993) раскрывают, что анти-ТФР-бета-антитела ингибируют онкогенность опухолевых клеток молочной железы и повышают активность мышиных природных киллерных клеток селезенки.

Антифиброзные средства для заживления ран и лечения фиброзных нарушений, включая анти-ТФР-бета-антитела, описаны в WO 1993/19769.

Специфические последовательности анти-ТФР-бета2-антител описаны в ЕР 853661 В1.

Другие применения, где антитела против ТФР-бета показали обнадеживающую терапевтическую эффективность, включают применение антител против ТФР-бета для лечения глазных заболеваний, включая фиброз глаз, в том числе пролиферативную ретинопатию (Pena et al., Invest. Ophthalmology Vis. Sci., 35: 2804-2808 (1994)), профилактику катаракты (WO 1995/13827), отслоение сетчатки и уренирование после операции по поводу глаукомы (Khaw et al., Eye, 8: 188-196 (1994)). Connor et al., J. Clin Invest., 83: 1661-1666 (1989) показали, что значительно более высокие концентрации ТФР-бета2 имелись в аспиратах стекловидного тела от пациентов с внутриглазным фиброзом, связанным с пролиферативной ретинопатией, по сравнению пациентами с неосложненным отслоением сетчатки без фиброза глаз и что биологическую активность данного ТФР-бета2 можно нейтрализовать антителами против ТФР-бета2.

Применение антител против ТФР-бета для лечения заболеваний было предметом заявок на патент для фиброзного заболевания (WO 1991/04748); заболеваний с недостаточностью макрофагов (WO 1993/14782); макрофагальных патогенных инфекций (WO 1993/17708; патент США № 5730976); и сосудистых заболеваний (WO 1993/21945).

Обработанная ТФР-бета-антителом композиция стволовых клеток, способная выживать в течение 14 суток в условиях in vitro или ex vivo, и быстрая репопуляция гематопоэтической системы в условиях in vivo, описаны в WO 2000/43499.

Scrip 2580 p 14, 4 октября 2000 сообщил, что Cambridge Antibody Technology (CAT) и Genzyme сотрудничали с целью разработки человеческих моноклональных антител против ТФР-бета. У САТ имеется два полных человеческих ТФР-бета-антитела, САТ-152 и САТ-192, у Genzyme - 1D11, мышиное полиспецифическое моноклональное антитело, которое нейтрализует ТФР-бета1, ТФР-бета2 и ТФР-бета3, и его признали в качестве потенциального эффективного препарата для лечения диффузной склеродермы. САТ разработал человеческий аналог 1D11 с использованием технологии фагового дисплея. Несколько других клинических показаний для лечения анти-ТФР-бета-антителами, включая офтальмические показания, рубцевание после хирургических вмешательств, фиброз основных органов, таких как легкие, почки и печень и некоторые злокачественные опухоли, также будут рассмотрены наряду с лечением злокачественных опухолей мозга ингибированием роста с помощью ТФР-бета2. САТ-152 (анти-ТФР-бета2) находится в фазе II клинических испытаний для профилактики постоперационного рубцевания у пациентов, подвергшихся операции по поводу глаукомы, и для САТ-192 (анти-ТФР-бета1) завершилась фаза I клинических испытаний. Смотри также «Trends in Antibody Research: The Monoclonal Elite», Tim Searle, Bioventure-View 1510, p. 14, 1 октября 2000 г.

Метод количественного определения ТФР-бета с использованием анти-ТФР-бета-антитела раскрыт в WO 1995/19987. Новый тест для определения активного ТФР-бета в пробе с использованием эукариотических клеток, которые содержат ТФР-бета-реакционный экспрессирующий вектор, описан в WO 2000/00641. Данный тест включает определение концентраций изоформ ТФР-бета в пробе, где замороженные срезы предварительно инкубируют с нейтрализующими антителами изоформы анти-TGF-бета. Иммуноанализы на основе ТФР-бета с использованием ТФР-бета-антител описаны, например, в патенте Японии 2126157 и заявке на патент Японии 92041307 В, опубликованной 7 июля 1992 г.

Darland и D'Amore, J. Clin. Invest., 103: 157-158 (1999) раскрывают, что развитие сосудов протекает от стадии зависимости от фактора роста, когда потеря фактора выживаемости приводит к апоптозу. Стабилизация сосудов отмечается при покрытии муральными клетками, местной активации ТФР-бета и продукции базальной мембраны. Возникает несколько вопросов, касающихся роли факторов роста для сформировавшихся сосудов, включая VEGF и ТФР-бета. Benjamin et al., J. Clin. Invest., 103: 159-165 (1999) раскрыли избирательное исчезновение неразвившихся кровеносных сосудов в развитых опухолях человека после удаления VEGF.

Способы получения химерных и гуманизированных антител описаны в и других источниках в данной области, включая, например, патент США № 6235883 по полным моноклональным антителам против рецептора человеческого эпидермального фактора роста; ЕР 184187 по мышиному-человеческому химерному антителу; ЕР 844306 по способу получения рекомбинантных антител с использованием фаговой технологии; патент США № 5859205 по получению CDR-трансплантированных антител, предпочтительно гуманизированных антител, содержащих не относящийся к человеческому донорный и человеческий акцепторные или каркасные участки, ЕР 120694; ЕР 125023; ЕР 171496; ЕР 173494; ЕР 239400; WO 1989/07452; WO 1990/07861 и WO 1986/01533 по способам получения гуманизированных антител; заявка на патент США № 2003/0039649 по супергуманизированным антителам; заявка на патент США № 2003/0039645 по гуманизированным антителам со специфичностью к человеческому TNF-альфа; ЕР 239400 по рекомбинантным антителам и их получению; WO 1991/09967 по гуманизированным антителам; WO 1992/01047 по получению антител; WO 1992/22653 по способам получения гуманизированных антител; WO 1993/11161 по поливалентным антигенсвязывающим белкам; WO 1994/13804 по поливалентным антигенсвязывающим белкам; WO 2000/66631 по членам со специфическим связыванием для ТФР-бета; и Henry «Special Delivery: Alternative methods for delivering drugs improve performance, convenience and patient compliance». C&EN, p. 49-65 (2000). Смотри также патенты США № 6140471 и 5969108, и 5872215, и 5871907, и 5858657, и 5837242, и 5733743; ЕР 1024191; ЕР 774511; WO 1997/13844; ЕР 656941 и 605522, и WO 1994/13804; ЕР 589877; ЕР 585287; WO 1993/19172; ЕР 540586; WO 1993/06213; WO 1992/20791; WO 1992/01787 и WO 1992/01047. Кроме того, в WO 2004/065417 раскрываются различные изменения в антителах и антигенсвязывающих фрагментах для повышения выхода. Также смотри патент США 20050049403.

Существует потребность регуляции молекул ТФР-бета для предупреждения их отрицательного эффекта при развитии заболеваний, таких как представленные выше. Также имеется необходимость в обеспечении моноклональных антител с высокой аффинностью, которые специфически связываются с ТФР-бета и нейтрализуют активность ТФР-бета таким образом, что они действуют в качестве антагонистов ТФР-бета. Очевидное отсутствие регуляции ТФР-бета в клетках новообразований в сочетании с супрессией иммунной функции и индуцируемого ТФР-бета образования стромы делает потенциальное воздействие антагонистов ТФР-бета привлекательной возможностью для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, ТФР-бета-антитела являются пригодными для постановки диагностических тестов и иммуноаффинной очистки.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое связывается с ТФР-бета, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), который включает остатки нечеловеческой гипервариабельной области, включенные в человеческий домен (V_H), где указанный вариабельный домен содержит замену каркасной области (FR) в последовательности SEQ ID NO: 6 в положении, выбранном из группы, состоящей из 48, 49, 67, 69, 71, 73 и 78 при использовании системы нумерации, представленной Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes, Bethesda, MD (1991). Антитело включает интактное IgG1 антитело или фрагмент антитела, такой как Fab.

Предпочтительно гуманизированное антитело включает замены FR в положениях 49, 67 и 71, где более предпочтительно в положении 49 аланин заменен на глицин, в положении 67 фенилаланин заменен на аланин и в положении 71 аргинин заменен на аланин.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело включает замены FR в положениях 48, 49 и 71, где более предпочтительно в положении 48 валин заменен на изолейцин, в положении 49 аланин заменен на глицин и в положении 71 аргинин заменен на аланин.

Также предпочтительно, гуманизированное антитело включает замены FR в положениях 49, 69 и 71, где более предпочтительно в положении 49 аланин заменен на глицин, в положении 69 изолейцин заменен на лейцин и в положении 71 аргинин заменен на аланин. В еще одном аспекте дополнительная замена FR находится в положении 73, более предпочтительно в положении 73 аргинин заменен на лизин.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело включает замены FR в положениях 49, 71 и 73, где более предпочтительно в положении 49 аланин заменен на глицин, в положении 71 аргинин заменен на аланин и в положении 73 аспараги