Высококонцентрированные жидкие композиции анти-egfr антител

Высококонцентрированные жидкие композиции анти-egfr антител

Реферат

Предпосылки изобретения

Изобретение относится к способам получения высококонцентрированных жидких композиций, включающих, по крайней мере, одно анти-EGFR антитело и/или один из его вариантов и/или фрагментов, в частности моноклональное антитело против рецептора EGF, в частности, предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) и Mab h425 (EMD 72000), путем ультрафильтрации. Кроме того, изобретение также относится к высококонцентрированным жидким композициям анти-EGFR антител, в частности, антител против рецептора EGF, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаба) и Mab h425 (EMD 72000) и/или их вариантов и/или фрагментов, характеризующихся тем, что высококонцентрированные, жидкие композиции имеют содержание анти=EGFR антител 10-250 мг/мл, предпочтительно 50-180 мг/мл, особенно предпочтительно 100-150 мг/мл, а также к их применению.

Успехи в области биотехнологии сделали возможным в течение последних 10 лет получение ряда белков для фармацевтического применения с помощью методик рекомбинантной ДНК. Белковые лекарственные средства, такие как моноклональные антитела, используются, например, в терапии опухолей, например, для специфической иммунотерапии или опухолевой вакцинации. Терапевтические белки являются более крупными и более сложными, чем традиционные органические и неорганические активные ингредиенты, они имеют сложные трехмерные структуры и многочисленные функциональные группы, которые определяют биологическую активность белка или, альтернативно, могут вызывать нежелательные эффекты. В процессе получения, хранения и транспортировки белковые лекарственные средства подвергаются многочисленным экзогенным воздействиям, которые могут оказывать воздействие на белковый активный ингредиент, которое снижает его стабильность. Таким образом, является необходимым досконально изучить случаи и механизмы специфических реакций разложения для того, чтобы сделать возможной стабилизацию белка, например, посредством прибавления определенных стабилизирующих вспомогательных веществ (см., например, Manning M.C., Patel К. и Borchardt R.T. (1989). Стабильность белковых лекарственных средств. Pharm. Res. 6, 903-918).

Литературные источники раскрывают многочисленные композиции терапевтических белков. Однако требования к композициям фармацевтических препаратов белковых активных ингредиентов могут быть весьма различными и, в общем случае, не является возможным применять уже имеющиеся белковые композиции для новых белковых активных ингредиентов по причине специфических физико-химических свойств и реакций разложения различных белков. Приемлемые фармацевтические композиции и стабильные формы этих новых активных ингредиентов, таким образом, остаются основной проблемой.

Несмотря на то что ультрафильтрация на сегодняшний момент описывается в литературе как стандартный способ низовой обработки при очистке рекомбинантных белков (Taylor и Francis (2000). Развитие фармацевтических композиций пептидов и белков, London, стр.1-212; McPherson A. (1989) Способы разделения, получение и анализ кристаллов белков: New York, Robert E. Krieger. Publishing Co., Inc., стр.1-51), высокие концентрации не являются достижимыми при низовой обработке. В дополнение к этому может повторно возникнуть необходимость разведения растворов, полученных в результате процесса, вследствие последующей очистки и хроматографических этапов.

Несмотря на то что US 6252055 описывает получение высококонцентрированных композиций антитела с помощью ультрафильтрации, композиции антитела, полученные таким путем, имеют однако высокое содержание растворимых агрегатов ≥4% даже непосредственно после получения. В дополнение к этому полученные композиции антитела не охарактеризованы в отношении своей нативной структуры и стабильности, что должно рассматриваться, например, как очень важная характеристика в отношении иммуногенности и эффективности композиции антитела.

Вредное влияние агрегатов как на повышение иммуногенности и снижение эффективности, так и на снижение биодоступности белковых композиций является известным из литературы (Marshall, G.A.Lazar, A.J.Chirino и J.R.Desjarlais. Целесообразное конструирование и создание терапевтических белков. Drug Discovery Today 8 (5): 212-221, 2003; Schellekens H. Биоэквивалентность и иммуногенность биофармацевтических препаратов. Nat. Rev. Drug. Discov. 1 (6): 457-462, 2002).

По упомянутым выше причинам является понятным, что получение жидких высококонцентрированных композиций антитела, которые являются стабильными в течение достаточно длительного времени, является сложным для специалиста в данной области техники. В дополнение к этому получение высококонцентрированной жидкой композиции является непривлекательным для специалиста в данной области, так как достаточно известной является отчетливая тенденция к агрегации белков и, в частности, антител, даже в интервале низкой концентрации (S.A.Marshall, G.A.Lazar, A.J.Chirino и J.R.Desjarlais. Целесообразное конструирование и создание терапевтических белков. Drug Discovery Today 8 (5): 212-221, 2003). Таким образом, агрегация белков описывается в литературе как наиболее общая реакция физической нестабильности (W.Wang. Нестабильность, стабилизация и получение жидких белковых фармацевтических средств. Pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 185 (2): 129-188,1999).

Несмотря на то что композиции, включающие Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), описываются в WO 03053465 и WO 03/007988, композиции, раскрытые в WO 03053465, имеют, однако, относительно низкую концентрацию белка и не являются стабильными в течение длительного периода хранения при комнатной температуре. Композиции, раскрытые в WO 03007988, также имеют относительно низкую концентрацию белка и препарата (лиофилизата), который должен восстанавливаться перед употреблением.

Процесс лиофилизации для стабилизации композиций белка раскрыт, например, в WO 9300807 и WO 9822136, но существенные недостатки лиофилизированных препаратов заключаются в том, что пользователь должен восстанавливать лиофилизат перед употреблением, что представляет собой значительный источник ошибки при получении его перед применением. Поскольку по сравнению с жидкими композициями прибавляется дополнительный процесс получения, этот процесс является нецелесообразным в отношении осуществления дополнительной работы для проведения процесса (подтверждение стабильности в процессе лиофилизации), приготовления (затраты на получение и длительности) и, например, его аттестации.

В случае композиций с низкой концентрацией белка, известных на сегодняшний день, высокие объемы для инфузии являются необходимыми при внутривенном введении. Задача настоящего изобретения, таким образом, состоит в том, чтобы концентрация антител в соответствии с изобретением, несмотря на снижения вводимых объемов, при подкожном введении также была обоснованной. Композиции, которые вводятся подкожно, должны не превышать объема 1,0-1,5 мл и должны, кроме того, быть истинно водными (рН 7,2 или рН 4,0-9,0) и изотоническими (приблизительно 290 мОсм). Дополнительное преимущество подкожных композиций состоит в возможности самостоятельного введения пациентом, то есть повышение содержания продуктов разложения и агрегации должно быть приемлемым в пределах границ описания. Кроме того, такие композиции должны быть свободными от токсикологически неприемлемых веществ или только включать последние в физиологически приемлемых концентрациях.

Поскольку по причине ожидаемых трудностей уже существующие белковые композиции, в общем случае, не могут применяться к новым белковым активным ингредиентам, то задача настоящего изобретения заключалась в том, чтобы отыскать новые, стабильные, высококонцентрированные, жидкие композиции для терапевтических белков, в частности, моноклональных антител против рецептора

EGF, например, Mab C225 (цетуксимаба) и Mab h425 (EMD 72000). которые обладают повышенной стабильностью к стрессовым условиям, таким как повышенная температура, атмосферная влажность и/или сдвиговые силы, так, чтобы их эффективность сохранялась в процессе получения, хранения, транспорта и введения, и эти композиции не содержали неприемлемых вспомогательных веществ.

Краткое изложение сущности изобретения

Неожиданно выяснилось, что высококонцентрированные фармацевтические препараты анти-EGFR антител, которые в виде жидкой композиции имеют концентрации белка от 10 до 250 мг/мл, в частности, предпочтительно от 50 до 180 мг/мл, особенно предпочтительно от 100 до 150 мг/мл, могут быть получены с помощью процессов ультрафильтрации.

Композиции, полученные с помощью процесса ультрафильтрации, являются предпочтительно стабильными в течение длительного периода времени, или они могут, в случае необходимости, быть смешаны с приемлемыми стабилизирующими вспомогательными веществами или могут быть стабилизированы с помощью последующей лиофилизации.

Препараты в соответствии с изобретением являются физиологически хорошо переносимыми, легкими в приготовлении, могут точно отмеряться и являются стабильными при хранении, в процессе механического стресса, например при многократных процессах замораживания и оттаивания.

Неожиданно было обнаружено, что высококонцентрированные композиции анти-EGFR антител, полученные при использовании процессов в соответствии с изобретением, включают количественное содержание мономера ≥99%. Полученные высококонцентрированные жидкие композиции в соответствии с изобретением, имеющие концентрации 10-250 мг/мл, в частности, предпочтительно до 50-180 мг/мл, особенно предпочтительно до 100-150 мг/мл, являются физически и химически стабильными, то есть не возникает никакого изменения в содержании мономера с сопровождающимся увеличением содержания возникающих при этом растворимых агрегатов, что можно считать в высшей степени ключевым фактором в отношении эффективности и иммуногенных побочных эффектов (Schellekens H. Биоэквивалентность и иммуногенность биофармацевтических препаратов. Nat. Rev. Drug. Discov. 1 (6): 457-462, 2002). Ни один из используемых процессов ультрафильтрации не вызывает изменения первичной структуры белка. В дополнение к этому, не имеется никаких недостатков в отношении механической стабильности и термической стабильности по сравнению с белковыми композициями низкой концентрации. В частности, характерные продукты агрегации также пребывают в пределах оговоренных нормативов для высококонцентрированных жидких композиций антител в соответствии с изобретением.

Это явилось неожиданным, поскольку тенденция к нестабильности для высококонцентрированных белковых композиций является намного более высокой, чем для разведенных белковых композиций (Fields G., Alonso D., Stiger D., Dill K. (1992) «Теория агрегации белков и сополимеров» J. Phys. Chem. 96, 3974-3981). «Плотность упаковки» белковых молекул увеличивается при высокой концентрации белка. В соответствии с этим необходимо предполагать повышенное количество соударений, и в результате могут возникать случайные белковые ассоциации. Этот процесс в общем случае происходит с помощью механизмов образования и роста, при которых критические ядра часто представляют собой растворимые ассоциированные белки, которые, однако, могут быстро превращаться в нерастворимые белковые преципитаты (денатурированный белок) (Reithel, J.F. (1962) «Диссоциация и ассоциация белковых структур». Adv. Protein Chem. 18, 123). Размер белковых агрегатов увеличивается с увеличением концентрации белка, как было показано для β-лактоглобулина (Roefs, S.P.F.M., De Kruif, K.G. (1994) «Модель для денатурации и агрегации β+-лактоглобулина» Eur. J. Biochem. 226, 883-889).

Композиции анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением, описанные ниже, отличаются, что явилось неожиданностью, одним или более преимуществами, выбранными из высокой концентрации белка, высокой стабильности, низкой тенденции к агрегации, низкой вязкости, высокой чистоты, отсутствия фармацевтически неприемлемых агентов и, таким образом, высокой безопасности и факта, что они являются хорошо переносимыми и обладают способностью непосредственного применения.

Процессы получения в соответствии с изобретением, описанные ниже, неожиданным образом отличаются одним или более преимуществами, выбранными из простоты, сохранения времени и средств, применения фармацевтически приемлемых агентов, высокого выхода. Процессы в соответствии с изобретением могут, таким образом, предпочтительно осуществляться с помощью значительно более простого способа, экономят время и эффективны в отношении затрачиваемых средств, по сравнению с методами, описанными в литературе, поскольку неожиданным образом было установлено, что стабильные высококонцентрированные жидкие композиции анти-EGFR антител, которые имеют все перечисленные выше преимущества, получают с помощью ультрафильтрации.

Изобретение, таким образом, относится к процессам получения высококонцентрированных жидких композиций, включающих, по крайней мере, одно анти-EGFR антитело и/или один из его вариантов и/или фрагментом путем ультрафильтрации. Процессы в соответствии с изобретением, в частности, характеризуются тем, что получаемые высококонцентрированные жидкие композиции имеют содержание, по крайней мере, одного анти-EGFR антитела от 10 до 250 мг/мл, предпочтительно от 50 до 180 мг/мл, особенно предпочтительно от 100 до 150 мг/мл.

Процессы в соответствии с изобретением дополнительно характеризуются тем, что анти-EGFR антитела являются моноклональными или имеют происхождение от мыши или от человека, предпочтительно имеют мышиное происхождение, являются химерными или гуманизированными. Особое предпочтение отдается анти-EGFR антителам Mab C225 (цетуксимабу) или Mab h425 (EMD72000), и/или их вариантам, и/или фрагментам.

Процессы ультрафильтрации в соответствии с изобретением представляют собой процессы ультрафильтрации, такие как ультрафильтрация с перемешиванием или тангенциальная проточная фильтрация (TFF).

Ультрафильтрацию антител в соответствии с изобретением предпочтительно осуществляют в приемлемой буферной системе, то есть стабилизация реакционных растворов, такая как, например, с помощью детергентов, не является необходимой. Использования детергентов в препаратах для парентерального введения следовало бы, как правило, избегать или минимизировать, поскольку они имеют значительный токсический и иммуногенный потенциал (Sweetana S. и Akers M.J. (1996) Принципы растворимости и практика для разработки парентеральных дозированных форм для лекарственных средств. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50, 330-342), они также могут приводить к изменению во вторичной структуре белков (Vermeer A.W.P. и Norde W. (2000). Влияние связывания сурфактантов с низким молекулярным весом на термальную стабильность и вторичную структуру IgG. Коллоиды и поверхности А: Физико-химический и инженерный аспекты 161, 139-150). В дополнение к этому, осуществление процесса ультрафильтрации композиций, содержащих детергенты, как продемонстрировано на практике, является сложным, поскольку неблагоприятное и неконтролируемое обогащение продукта детергентами может возникать по причине возможного образования мицелл детергента.

В отношении анти-EGFR антител в соответствии с изобретением и для целей настоящего изобретения термины «биологически активный», «нативный» и «эффективный» взяты для обозначения факта, что анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением способны выявлять свой биологический эффект даже после превращения в композиции в соответствии с изобретением, в частности, связывание с EGFR, ингибирование связывания лигандов, в частности, EGF, с EGFR, модуляцию, в частности, ингибирование опосредованной EGFR сигнальной трансдукции, и эффект в отношении профилактики или терапии заболеваний, опосредованных EGFR.

«Анти-EGFR антитела»: анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением предпочтительно представляют собой моноклональные антитела и такие, которые имеют происхождение от мыши или от человека, а также химерные или гуманизированные антитела. Антитело, направленное против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), в частности, представляет собой Mab С225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000) и/или их варианты или фрагменты. Дополнительные антитела против EGFR описаны, например, в ЕР 0586002 и в J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528).

Mab С225 (цетуксимаб. Эрбитукс™): Mab С225 (цетуксимаб) представляет собой клинически одобренное антитело, которое связывается с рецептором EGF. Mab С225 (цетуксимаб) представляет собой химерное антитело, вариабельные участки которого имеют мышиное происхождение, а константные участки - происхождение от человека. Это антитело было впервые описано Naramura и др., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349, и в WO 96/40210 A1.

Mab h425 (EMD 72000): Mab h425 (EMD 72000) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (Mab), полученное из мышиного анти-EGFR антитела 425 (Mab 425) (ЕР 0531472). Мышиное моноклональное антитело Mab 425 было разработано на основе линии клеток карциномы человека А431, поскольку здесь оно связывается с внеклеточным эпитопом рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Было обнаружено, что оно ингибирует связывание EGF (Murthy и др., 1987). Повышенная экспрессия EGFR была обнаружена в злокачественных тканях, полученных из различных источников, и, следовательно, Mab 425 является возможным активным ингредиентом для диагностики и терапевтического лечения опухолей человека. Так, было обнаружено, что Mab 425 опосредует опухолевую цитотоксичность in vitro и супрессирует опухолевый рост линии клеток эпидермоидных и колоректальных карцином in vitro (Rodeck и др., 1987). В дополнение к этому, было показано, что Mab 425 связывается с ксенотрансплантатами человеческих злокачественных глиом у мышей (Takahashi и др., 1987). Гуманизированные и химерные формы этого антитела были раскрыты, например, в ЕР 0531472; Kettleborough и др., Белковая инженерия, 1991, 4: 773-783; Bier и др.. Cancer Chemother Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier и др.. Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46: 167-173. Mab h425 (EMD 72000) представляет собой гуманнизированное антитело (h425), которое находится на клинической фазе испытаний I/II, его константные участки состоят из к и человеческой γ-1 цепи (ЕР 0531472).

Человеческие анти-EGFR антитела могут быть получены с помощью методики XenoMouse, как описано в WO 9110741, WO 9402602 и WO 9633735. Антитело, которое проходит в настоящее время клинические испытания и было получено в соответствии с этой методикой, представляет собой, например, ABX-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).

Антитело: антитело или иммуноглобулин используется в самом широком смысле для целей настоящего изобретения и относится, в частности, к поликлональным антителам и мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам) и, в частности, предпочтительно интактным моноклональным антителам (Mab), которые являются биологически активными, к их вариантам и фрагментам. Термин также охватывает гетероантитела, которые состоят из двух или более антител или их фрагментов и/или имеют различные связывающие специфичности и связываются друг с другом. В зависимости от аминокислотной последовательности их константных участков антитела могут относиться к различным классам антител (иммуноглобулинов): IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Этот ряд может быть разделен далее на подклассы (изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Антитела обычно имеют молекулярный вес приблизительно 150 кДа и состоят из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Моноклональные антитела получают из популяции гомогенных клеток. Они являются высоко специфическими и направлены против одного эпитопа, в то время как поликлональные антитела охватывают различные антитела, которые направлены против различных эпитопов. Способы получения моноклональных антител включают, например, гибридомный способ, описанный Kohler и Milstein (Nature 256, 495 (1975)), a также у Burdon и др., (1985) «Технология моноклональных антител, получение и характеристика гибридом грызунов и человека», изд. Лабораторные способы в биохимии и молекулярной биологии, том 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. Они могут быть получены, в частности, с помощью известных способов рекомбинантной ДНК (см., например, US 4816567). Моноклональные антитела также могут быть изолированы из библиотеки фаговых антител, например, с помощью методик, описанных у Clackson и др. (Nature, 352:624-628 (1991)) и Marks и др. (J. Mol. Biol., 222:58, 1-597 (1991)).

Варианты и фрагменты: варианты (мутеины) антител представляют собой структурно родственные белки, например, такие, которые могут быть получены путем модификации первичной последовательности (аминокислотной последовательности), гликоинженерии (варианты сайтов гликозилирования или структур, а также дегликозизилированные белки), с помощью ПЭГилирования, посредством получения в модифицированных хозяйских клетках или с помощью других методик. Варианты в соответствии с изобретением не ограничены приведенными выше примерами, а включают все варианты антител в соответствии с изобретением, которые являются известными специалисту в данной области. Фрагменты (частичные сегменты) антител представляют собой продукты расщепления полученных антител, например, с помощью ограниченного ферментативного переваривания с помощью папаина, пепсина и плазмина, или путем получения частичных сегментов при использовании генетической инженерии. Типичные частичные сегменты представляют собой, например, бивалентный фрагмент F(ab')₂, моновалентный фрагмент Fab и фрагмент Fc (Lottspeich F,, H. Zorbas (ред.). Bioanalytik, Heidelberg; Berlin: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, (1998) стр.1035). Фрагменты в соответствии с изобретением не ограничиваются приведенными выше примерами, а включают все фрагменты антител в соответствии с изобретением, которые известны специалисту в данной области.

Фармацевтический препарат: термины «фармацевтическая композиция» и «фармацевтический препарат» используются как синонимы для целей настоящего изобретения.

Как используется в данной заявке термин «фармацевтически переносимый» относится к лекарственным средствам, осаждающим реагентам, наполнителям, вспомогательным веществам, стабилизаторам, растворителям и другим агентам, которые способствуют введению фармацевтических препаратов млекопитающему при отсутствии нежелательных побочных эффектов, таких, как, рвота, головокружение, проблемы с перевариванием пищи или тому подобное.

В фармацевтических препаратах для парентерального введения существует требование в отношении изотоничности, эугидрии, переносимости и безопасности композиции (низкая токсичность), используемых вспомогательных веществ и первичного упаковки. Неожиданно было обнаружено, что высококонцентрированные, жидкие композиции анти-EGFR антител в соответствии с изобретением предпочтительно обладают преимуществом, которое заключается в том, что является возможным непосредственное применение, поскольку для получения используются физиологически приемлемые агенты. Получение высококонцентрированных, жидких композиций анти-EGFR антител в соответствии с изобретением преимущественно с одновременным высоким выходом нативного и фармацевтически приемлемого белка высокой чистоты является, таким образом, простым, экономящим время и недорогим.

Ультрафильтрация представляет собой процесс разделения под давлением с использованием полупроницаемой мембраны для разделения растворенных и суспендированных материалов. Принцип разделения основывается на размере и измерениях молекулы, то есть вещества, которые являются меньшими, чем размер пор, поступают в фильтрат (пермеат), в то время как вещества, которые являются большими, чем размер пор, остаются в ретентате (концентрате). Сила, необходимая для осуществления разделения, может быть применена, например, в виде сил центрифугирования, источника давления газа (например, азота) или мембранного насоса.

Высококонцентрированные, жидкие композиции анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут быть предпочтительно получены путем концентрирования раствора, содержащего анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением, с помощью процесса ультрафильтрации. С этой целью раствор, имеющий определенную концентрацию анти-EGFR антител в соответствии с изобретением (например, для С225: от 0,01 до 150 мг/мл, предпочтительно от 2 до 100 мг/мл, особенно предпочтительно приблизительно 20 мг/мл, для EMD 72000: от 0.01 до 150 мг/мл, предпочтительно от 5 до 100 мг/мл, особенно предпочтительно приблизительно 20 мг/мл), как получено в его препарате, предпочтительно вводят в ультрафильтрационную единицу и подвергают процессу концентрирования в определенных условиях при контроле давления. Если антитело находится в форме твердого вещества, например, в виде лиофилизата, то высококонцентрированная, жидкая композиция в соответствии с изобретением может быть получена путем первичного растворения анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в воде или водном растворе, включающем один или более других ингредиентов, и последующей обработки раствора с помощью процесса ультрафильтрации.

Продукт, полученный с помощью процесса ультрафильтрации, может быть последовательно стабилизирован путем прибавления вспомогательных веществ, приведенных ниже. Полученный раствор, включающий соответствующее антитело, доводят до значения рН от 4 до 10, предпочтительно рН от 5 до 9, стерильно фильтруют и, в случае необходимости, возможно, превращают в твердую форму с помощью последующего этапа лиофилизации для стабилизации. Последовательность прибавления различных вспомогательных веществ или антитела в соответствии с изобретением существенно не зависит от процесса получения и находится в рамках компетенции специалиста в данной области.

Анти-EGFR антитела предпочтительно присутствуют в биологически активной форме в высококонцентрированных жидких композициях в соответствии с изобретением, и денатурация антител предпочтительно не происходит во время осуществления процессов в соответствии с изобретением. Биологическая эффективность белка, таким образом, предпочтительно сохраняется.

Полиэфирсульфон (PES) или регенерированная целлюлоза, например, может использоваться в качестве мембраны для ультрафильтрации в процессах в соответствии с изобретением: теоретически возможное отсечение находится в интервале от 5 до 500 кДа, предпочтительно в интервале от 10 до 100 кДа, особенно предпочтительно от 30 до 50 кДа.

Центрифужные силы, используемые для центрифужных пробирок Ultrafree (Millipore), находятся в интервале от 1 до 20000×g, предпочтительно в интервале от 1000 до 12000×g, особенно предпочтительно 2000×g. Давление газа, используемое в камере для перемешивания Amicon (Millipore), находится в интервале от 0,1 до 5 фунтов на квадратный дюйм, предпочтительно 4 фунта на квадратный дюйм. Давление на входе, которое используется в системе Labscale TFF (Millipore), находится в интервале от 0,1 до 85 фунтов на квадратный дюйм, предпочтительно в интервале от 10 до 30 фунтов на квадратный дюйм, особенно предпочтительно 20 фунтов на квадратный дюйм. Давление на выходе, которое используется в системе Labscale TFF (Millipore), находится в интервале от 0,1 до 85 фунтов на квадратный дюйм, предпочтительно в интервале от 5 до 20 фунтов на квадратный дюйм, особенно предпочтительно 10 фунтов на квадратный дюйм.

Следующие буферы, например, могут использоваться в процессах в соответствии с изобретением: фосфатные буферы: Na (или К) фосфат; возможное значение рН приблизительно 6,0-8,2; нитратные буферы: цитрат Na или лимонная кислота, возможное значение рН приблизительно 2,2-6,5, сукцинатные буферы со значением рН приблизительно 4,8-6,3, ацетатные буферы, например, ацетат натрия со значением рН приблизительно от 2,5 до 6,0; гистидиновые буферы со значением рН приблизительно 6,0-7,8; буферы на основе глутаминовой кислоты со значением рН от 8,0 до 10,2; глициновые буферы (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин) со значением рН приблизительно от 8,6 до 10,6; глицинатные буферы со значением рН приблизительно 6,5-7,5; буферы на основе имидазола со значением рН от 6,2 до 7,8; буферы на основе хлорида калия со значением рН приблизительно от 1,0 до 2,2; лактатные буферы со значением рН приблизительно 3,0-6,0; малеатные буферы со значением рН приблизительно 2,5-5,0; тартратные буферы со значением рН приблизительно 3,0-5,0; Трис: значение рН приблизительно 6,8-7,7; фосфатно-цитратные буферы. Прибавление изотонических агентов для влияния на изотоничность также является возможным (например, NaCI (или KCI) или также других солей).

Упомянутые выше буферы могут использоваться в процессе в соответствии с изобретением, например, и при следующих концентрациях: от 1 мМ до 200 мМ, предпочтительно 2-20 мМ, особенно предпочтительно приблизительно 10 мМ.

Могут предпочтительно использоваться следующие интервалы рН: рН 4-10, предпочтение отдается рН=IEP+/-2 рН единиц (2 рН единицы вблизи изоэлектрической точки белка).

Могут предпочтительно использоваться следующие изотонические агенты (обычные концентрации): хлорид натрия, концентрация приблизительно 5 мМ - 305 мМ; хлорид калия; глюкоза; декстроза, концентрация 4-5,5 мМ; сульфат натрия, концентрация 1-1,6 мМ.

Следующие вещества могут предпочтительно использоваться для снижения вязкости: хлорид натрия, гидрохлорид аргинина, тиоцианат натрия, тиоцианат аммония, сульфат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, хлориды кальция, хлориды цинка, ацетат натрия.

Могут предпочтительно использоваться следующие стабилизаторы:

1) Аминокислоты.

(Приблизительно 1-100 мг/мл, в частности, предпочтительно 3-10 мг/мл в виде гидрохлорида) аргинин, орнитин, лизин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серии, пролин.

2) Сахара и сахарные спирты.

(Приблизительно 1-200 мг/мл, особенно предпочтительно 30-65 мг/мл) сахароза, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, раффиноза, трегалоза, глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин, нейраминовая кислота.

3) Антиоксиданты.

Ацетон бисульфит натрия 0,2%, аскорбиновая кислота 0,01%, эстер аскорибиновой кислоты 0,015%, бутилгидроксианизол (ВНА) 0,02%, бутилгидрокситолуол (ВНТ) 0,02%, цистеин 0,5%, нордигидрогуаретовая кислота (NDGA) 0,01% монотиоглицерин 0,5%, бисульфит натрия 0,15%, метабисульфит натрия 0,2%, токоферолы 0,5%, глютатион 0,1%.

4) Консерванты.

М-крезол, приблизительно 0,1-0,3%, хлоркрезол, приблизительно 0,1-0,3%, фенол, приблизительно 0,5%, бензиловый спирт приблизительно 1,0-2,0%, метилпарабен, приблизительно 0,2%, пропилпарабен, приблизительно 0,02%, бутилпарабен, приблизительно 0,015%, хлорбутанол, приблизительно 0,25-0,5%, фенил нитрат ртути, приблизительно 0,002% фенил ацетат ртути, приблизительно 0,002% тимерсал, приблизительно 0,01-0,02%, хлорид бензалкония, приблизительно 0,01%, хлорид бензетония, приблизительно 0,01%.

5) Циклодекстрины.

Например, гидроксипропил-β-циклодекстрин, сульфобутилэтил-β-циклодекстрин, γ-циклодекстрин.

6) Альбумины.

Человеческий сывороточный альбумин (HSA), бычий сывороточный альбумин (BSA).

7) Многоатомные спирты.

Глицерин, этанол, маннит.

8) Соли.

Ацетатные соли (например, ацетат натрия), хлорид магния, хлорид кальция, трометамин, ЭДТА (например, Na-ЭДТА)

Изобретение также охватывает все гидраты, соли и производные упомянутых выше агентов, которые являются известными и доступными для специалиста в данной области.

Кроме того, изобретение относится к высококонцентрированным, жидким композициям, включающим, по крайней мере, одно анти-EGFR антитело и/или один из его вариантов и/или фрагментов. Такие высококонцентрированные, жидкие композиции анти-EGFR антител могут быть получены с помощью процессов ультрафильтрации, описанных выше. Дополнительные возможные процессы концентрирования представляют собой хроматографические процессы, такие как вытеснительная хроматография (например, гель-фильтрация), аффинная хроматография (например, хроматография на основе протеина А) или ионообменная хроматографию, процессы мембранного разделения, такие как, например, диализ, электродиализ, микрофильтрация, обратный осмос, электрофретические процессы или процессы высушивания, лиофилизации, промывание в органических растворителях и последующее высушивание на воздухе, высушивание в жидком слое, высушивание в псевдоожиженном слое, высушивание распыливанием, вальцовую сушку, послойное высушивание, высушивание на воздухе при комнатной температуре и последующее восстановление в меньшем объеме растворителя.

Высококонцентрированные жидкие композиции анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, в частности, характеризуются тем, что они имеют содержание, по крайней мере, одного анти-EGFR антитела, которое составляет 10-250 мг/мл, предпочтительно 50-180 мг/мл, особенно предпочтительно 100-150 мг/мл.

Высококонцентрированные жидкие композиции в соответствии с изобретением в частности, характеризуются тем, что анти-EGFR антитела представляют собой моноклональные антитела, имеющие происхождение от мыши или от человека, имеющие предпочтительно мышиное происхождение, которые являются химерными или гуманизированными. Анти-EGFR антитела, в частности, предпочтительно представляют собой Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD72000) и/или их варианты и/или их фрагменты.

Кроме того, изобретение относится к высококонцентрированным жидким композициям, включающим, по крайней мере, одно анти-EGFR антитело и/или его варианты, и/или его фрагменты, получаемые с помощью процессов в соответствии с изобретением, то есть путем процессов ультрафильтрации, описанных выше.

Изобретение дополнительно относится к высококонцентрированным жидким композициям анти-EGFR антител в соответствии с изобретением в качестве стабильных при хранении лекарственных средств.

Высококонцентрированные жидкие композиции анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут в дополнение к антителам в соответствии с изобретением необязательно включать наполнители и/или вспомогательные вещества и/или дополнительные фармацевтически активные ингредиенты.

Процессы в соответствии с изобретением предпочтительно позволяют получить высококонцентрированные композиции при отсутствии неблагоприятной или нежелательной агрегации антител в соответствии с изобретением или нежелательной возникающей высокой вязкости. Таким образом, готовые к употреблению растворы, имеющие высокое содержание активного ингредиента, могут быть получены с помощью процессов в соответствии с изобретением. Крайне высококонцентрированные композиции белковых активных ингредиентов в настоящее время являются весьма необходимыми. Большинство применяемых для терапии антител используется в дозах в диапазоне мг/кг. Высокая доза и небольшие объемы, которые вводятся (например, от приблизительно 1 до 1,5 мл для подкожного введения), предъявляют требование в высоко концентрированных белковых препаратах, которые имеют концентрации, большие, чем 100 мг/мл. В дополнение к этому, высококонцентрированные белковые композиции могут иметь значительные преимущества в предварительных клинических опытах для изучения приемлемости и эффективности in vitro и in vivo (на животных моделях), в клинических опытах по изучению приемлемости и эффективности у людей и при клиническом применении в продукте (в частности, в случае подкожного введения). Их преимущества состоят, в частности, в относительно небольшом объеме используемого препарата. В противовес инфузии или инъекции белковых лекарственных средств с относительно низкой концентрацией, заявленные препараты позволяют, например, осуществлять подкожное введение белковых лекарственных средств пациенту. Подкожное введение белковых лекарственных средств может иметь различные причины. Например, специфическое нацеливание в связи с «терапевтическим окном» может быть желательным. Кроме того, подкожное введение имеет преимущество, которое заключается в том, что пациент может осуществлять введение самостоятельно, не полагаясь при этом на медицинский персонал. Пример инсулина ясно демонстрирует эти преимущества. Однако поскольку инъекции для подкожного введения могут иметь максимальный объем 1-1,5 мл, высококонцентрированные белковые композиции, содержащие более, чем 100 мг/мл белка, часто являются необходимыми.

Неожиданно было обнаружено, что высококонцентрированные жидкие композиции анти-EGFR антител, которые не имеют упомянутых выше недостатков при концентрации белка 10-250 мг/мл, предпочтительно 50-180 мг/мл, особенно предпочтительно 100-150 мг/мл, могут быть получены с помощью процессов в соответствии с изобретением.

Предел в случае известных высококонцентрированных композиций иммуноглобулинов обычно составляет 2-50 мг/мл при использовании готовых к употреблению жидких композиций антител (Humira®).

С помощью процессов в соответствии с изобретением,