Полипептид со свойствами агониста рецептора гормона роста, кодирующая его нуклеиновая кислота, вектор для его экспрессии и продуцирующая его клетка

Полипептид со свойствами агониста рецептора гормона роста, кодирующая его нуклеиновая кислота, вектор для его экспрессии и продуцирующая его клетка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к полипептидам, содержащим по меньшей мере два домена, способных связываться с рецептором цитокина, где данные домены соединены пептидной линкерной молекулой.

Группа факторов роста, именуемых цитокинами, участвует в целом ряде различных клеточных функций. Эти функции включают, в качестве примера, но не как ограничение, модуляцию иммунной системы, регуляцию энергетического метаболизма и контроль роста и развития. Цитокины опосредуют свои эффекты посредством рецепторов, экспрессируемых на клеточной поверхности клеток-мишеней. Рецепторы цитокинов можно разделить на три отдельные подгруппы. Рецепторы типа 1 (семейство гормона роста (GH)) характеризуются четырьмя консервативными остатками цистеина в аминоконцевой части их внеклеточного домена и присутствием консервативного мотива Trp-Sex-Xaa-Trp-Ser в С-концевой части. Повторяющийся Cys мотив также присутствует у типа 2 (семейство интерферона) и типа 3 (семейство фактора некроза опухолей).

Известно, что многие домены цитокинов взаимодействуют со своим распознающим рецептором через специфические сайты. Некоторые рецепторы цитокинов имеют как сайты связывания домена с высоким сродством, так и сайты связывания с низким сродством.

Например, известно, что одна молекула GH связывается с двумя молекулами рецептора (GHR) (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clackson et al., 1998). Это осуществляется через два уникальных рецептор-связывающих сайта на GH и общий карман связывания на внеклеточном домене двух рецепторов. Сайт 1 на молекуле GH имеет более высокое сродство, чем сайт 2, и полагают, что димеризация рецептора происходит последовательно, причем один рецептор связывается с сайтом 1 на GH, с последующим рекрутированием второго рецептора к сайту 2. Внеклеточный домен GHR существует в виде двух связанных доменов, причем каждый из них состоит приблизительно из 100 аминокислот. Именно конформационное изменение в этих двух доменах происходит при связывании гормона с образованием тримерного комплекса GHR-GH-GHR. После интернализации комплекса GHR-GH-GHR следует стадия рециклинга, посредством чего молекула рецептора регенерируется для дальнейшего использования в клетке.

Цитокины и другие домены часто образуют комплексы рецептор-домен при связывании. Рецепторы, участвующие в образовании комплексов, могут быть гомогенными или гетерогенными. Например, эритропоэтин и GH образуют тримерный комплекс рецептор-гормон-рецептор. Интерлейкин-4 образует тримерный комплекс рецептор-гормон-другой рецептор. Фактор некроза опухолей индуцирует сигнал через образование гомотипных тримеров клеточных трансмембранных рецепторов фактора некроза опухолей, TNF-1/p55 или TNF-2/p75. Другие цитокины, например лептин и GCSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), образуют тетрамерные комплексы рецептор-гормон-гормон-рецептор, а некоторые цитокины (например, интерлейкин 6) возможно образуют гексамерные комплексы, состоящие из двух растворимых рецепторных молекул, двух трансмембранных рецепторных молекул и двух молекул цитокина. В каждом случае существуют первичный сайт связывания с высоким сродством, который локализует цитокин в комплексе с рецептором, и дополнительные сайты, которые играют вторичную роль в изменении конформации или рекрутинге других молекул, инициируя, посредством этого, передачу сигнала.

Надсемейство цитокинов TNF (tumour necrosis factor, фактор некроза опухолей) активирует пути передачи сигнала для выживания клеток, их гибели и дифференциации, которые регулируют развитие, организацию и гомеостаз лимфоидной ткани, ткани молочной железы, нервной и эктодермальной ткани. Для TNF продемонстрирована его роль в защите хозяина, которая включает, например, дифференциацию клеток селезенки, полный lgG ответ и переключение изотипа, активацию макрофагов, генерацию оксида азота и радикалов активных форм кислорода. Однако при его сверхэкспрессии TNF также участвует в патогенезе. Доказательство такого участия обнаружили в следующих патологиях: бактериальный сепсис; реакция трансплантат против хозяина; церебральная малярия; ревматоидный артрит; гнездная алопеция / общее облысение; астма; рак; болезнь Крона; диабет; ожирение; псориаз и псориатический артрит; саркоидоз; склеродермия и токсический шок. Эти патологии считают установленными и/или потенциальными патологиями для применений анти-TNF агентов.

Сверхэкспрессия цитокинов является причиной целого ряда заболеваний человека, например акромегалии, гигантизма, дефицита GH, синдрома Тернера, почечной недостаточности, остеопороза, остеоартрита, сахарного диабета, рака, ожирения, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, гипертензии, анемии, аутоиммунных и инфекционных заболеваний, воспалительных расстройств, включая ревматоидный артрит.

Подходом для ингибирования действия цитокинов, например GH, пролактина или TNF, является введение антагонистов.

Одним примером антагониста GH является пегвисомант, который представляет собой модифицированную молекулу GH, покрытую полиэтиленгликолем (PEG). Пегвисомант имеет несколько полезных эффектов, включая, например, пониженную скорость клубочковой фильтрации, обусловленную повышенной эффективной молекулярной массой, что обеспечивает снижение дозы, требующейся для получения желательного эффекта [смотри Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581, (1977)]. Однако следствием пэгилирования является снижение сродства молекулы модифицированного GH к GHR.

Пример антагониста пролактина раскрыт в WO 03/057729 (которая включена в данное описание изобретения во всей ее полноте посредством ссылки и, более конкретно, последовательности белка и нуклеотидные последовательности, кодирующие указанный антагонист пролактина). Антагонист пролактина содержит модификацию аминокислотной последовательности пролактина человека, которая представляет собой замену остатка глицина в положении 129 остатком аргинина. Модифицированный белок пролактин действует как ингибитор активации рецептора пролактина.

Разработали целый ряд терапевтических стратегий для ингибирования TNF на основе возможности: 1) ингибировать синтез TNF (например, используя ингибиторные цитокины, IL-10; талидомид, кортикостероиды, циклоспорин А; антисмысловые олигонуклеотиды); 2) ингибировать процессинг TNF (например, ингибиторы металлопротеаз (ТАСЕ, TNF-α конвертирующий фермент)); 3) нейтрализовать TNF (например, используя растворимые рецепторы TNF или антитела к TNF).

Авторы данного изобретения описывают полипептиды, содержащие многочисленные лиганд-связывающие домены цитокиновых рецепторов и их применение в модуляции опосредованной рецептором активации цитокинов.

Согласно одному аспекту данного изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере два цитокиновых связывающих домена, способный связываться с цитокиновым рецептором, где данные домены соединены пептидной линкерной молекулой, которая содержит негибкий спиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид действует как антагонист указанного(ых) цитокинового(ых) рецептора(ов). В качестве альтернативы, указанный полипептид действует как агонист.

Предпочтительно полипептид содержит домены, расположенные в тандемном порядке. В предпочтительных воплощениях изобретения данный полипептид содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 доменов в тандемном порядке.

В еще одном другом предпочтительном воплощении изобретения данный полипептид содержит более 10 доменов в тандемном порядке.

Предпочтительно негибкий спиральный участок содержит по меньшей мере одну копию мотива А(ЕАААК)_хА или ее функциональный вариант. Предпочтительно пептидная линкерная молекула содержит две копии мотива ЕАААК, причем длину молекулы данного пептидного линкера можно увеличить путем пошагового добавления по меньшей мере одной аминокислоты.

«Функциональный вариант» представляет собой линкерную молекулу, которая может отличаться в аминокислотной последовательности одной или более чем одной заменой, вставкой, делецией, но которая по существу сохраняет спиральную или неспиральную конформацию. Среди предпочтительных вариантов находятся варианты, которые отличаются от эталонной аминокислотной последовательности консервативными аминокислотными заменами. Такие замены представляют собой замены, при которых данная аминокислота заменяется другой аминокислотой со схожими характеристиками. Следующий неограничивающий список аминокислот рассматривают как консервативные замены (сходные): а) аланин, серин и треонин; б) глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; в) аспарагин и глутамин; г) аргинин, лизин и гистидин; д) изолейцин, лейцин, метионин и валин и е) фенилаланин, тирозин и триптофан. Наиболее предпочтительными являются аминокислотные замены, которые по существу сохраняют гибкий или жесткий спиральный линкерный участок.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения линкерная молекула содержит по меньшей мере один гибкий неспиральный участок.

В то время как наличие негибкого спирального участка поддерживает пространственное разделение доменов, как описано выше, наличие гибкого неспирального участка позволяет доменам ориентироваться в связывающие сайты цитокинового(ых) рецептора(ов).

В одном воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на аминотерминальном конце молекулы пептидной линкерной молекулы или около него, тем самым делая возможной ориентацию связывающего домена, находящегося на аминотерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к его распознающему рецептору.

В другом воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы или около него, тем самым делая возможной ориентацию связывающего домена, находящегося на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к его распознающему рецептору.

В еще одном другом воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на амино- и карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы или около них, тем самым делая возможной ориентацию связывающих доменов, расположенных, соответственно, на амино- и карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к их распознающим рецепторам.

Предпочтительно гибкий неспиральный участок расположен рядом с по меньшей мере одним связывающим доменом. Еще более предпочтительно гибкий неспиральный участок образует соединение между связывающим доменом и негибким спиральным участком.

Еще более предпочтительно негибкий спиральный участок содержит по меньшей мере одну копию мотива А(ЕАААК)_хА. Длина негибкого неспирального участка может быть увеличена путем увеличения числа повторов этого мотива А(ЕАААК)_хА.

В предпочтительном воплощении данного изобретения «х» в мотиве А(ЕАААК)_хА составляет менее 10 копий. Еще более предпочтительно «х» составляет менее 5 копий. Еще более предпочтительно «х» выбран из 1, 2, 3, 4 или 5 копий.

В предпочтительном воплощении данного изобретения не существует гибких соединений между жесткими альфа-спиральными линкерами и связывающими доменами, но указанные связывающие домены непосредственно связаны негибким альфа-спиральным линкером.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные связывающие домены соединены соединительной молекулой, состоящей из негибкой альфа-спирали.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная спиральная линкерная молекула соединяет карбоксильный конец одного связывающего домена с аминоконцом второго связывающего домена.

В этом воплощении данного изобретения спиральный линкер является непрерывным между С-концевой спиралью молекулы первого цитокина и N-концевой спиралью молекулы второго цитокина, жестко связывая, таким образом, два цитокиновых связывающих домена в по существу фиксированной ориентации. Например, это может включать делецию короткого N-концевого и пост-спирального С-концевого участка из домена первого цитокина и короткого предспирального N-концевого участка из второго цитокина (например, остатков 182-190 из первого цитокина и остатков 1-5 из второго цитокина, так как они представляют собой короткие участки случайной кольцевой конформации после С-концевой спирали (например, спираль 4 на Фиг.1Б) в первом цитокине и перед N-концом (спираль 1' на Фиг.1Б) второго цитокина.

В различных конструктах эту фиксированную ориентацию (как трансляционную, так и ротационную) можно изменить либо путем вставки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислот, либо путем делеции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, чтобы получить молекулы с новыми свойствами, например с антагонистическими свойствами. Добавление дополнительной аминокислоты даст дополнительное относительное перемещение двух доменов приблизительно на 1,5 Å и относительное вращение двух доменов вокруг оси спирали примерно на +100°. Типично линкеры могут начинаться с двух единиц ЕАААК и будут удлиняться путем добавления последовательностей А, АА, ААА, АААА, ЕАААА и ЕАААК.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения связывающие домены полипептида являются одинаковыми или сходными друг с другом.

Кроме того, в других воплощениях данного изобретения полипептид содержит связывающие домены цитокинов, выбранных из группы, состоящей из гормона роста, лептина, эритропоэтина, пролактина, интерлейкинов (IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, р35 субъединицы IL-12, IL-13, IL-15; гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF); гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF); кардиотрофина (СТ-1); фактора, ингибирубщего миграцию лейкоцитов (LIF); онкостатина М (OSM); интерферона, IFNα и IFNγ; фактора некроза опухолей (TNF)α, TNFβ и лиганда RANK.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения по меньшей мере один домен содержит связывающий домен гормона роста.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит по меньшей мере два связывающих домена гормона роста или варианта гормона роста.

Модифицированные варианты GH раскрыты в US 5849535, который включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Модификации GH находятся как в связывающем сайте 1, так и в сайте 2. Модификации в сайте 1 продуцируют молекулу GH, которая имеет более высокое сродство к GHR по сравнению с GH дикого типа. Эти модифицированные молекулы GH действуют как агонисты. Также существует раскрытие модификаций сайта 2, которые приводят к созданию антагонистов GH. Дополнительные примеры модификаций GH для сайта 1, которые изменяют сродство связывания GH, раскрыты в US 5854026; US 6004931; US 6022711; US 6057292 и US 6136563, каждый из которых включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Также описаны модификации сайта 2, в частности аминокислотного остатка G120 в GH, которые при модификации в любой из аргинина, лизина, триптофана, тирозина, фенилаланина или глутаминовой кислоты создают молекулу GH со свойствами антагониста.

В находящейся на одновременном рассмотрении заявке на патент WO 03/070765 авторов данного изобретения, которая включена в данное описание изобретения посредством ссылки, авторы изобретения описывают продукт слияния варианта GH с антагонистической активностью по отношению к активации рецептора GH. Данный вариант GH слит через гибкий линкер с внеклеточным доменом рецептора гормона роста. Этот химерный полипептид демонстрирует замедленный клиренс и антагонистическую активность. Предложение аналогичного химерного полипептида, но с негибким или частично гибким линкером также находится в пределах объема изобретения, раскрытого здесь.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит по меньшей мере два связывающих домена пролактина или варианта пролактина.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид варианта пролактина содержит аминокислотную последовательность, которая модифицирована в положении 129 пролактина человека.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная модификация представляет собой аминокислотную замену. Предпочтительно указанная замена представляет собой замену остатка аминокислоты глицина остатком аминокислоты аргинина. Предпочтительно указанная модификация дополнительно содержит делецию по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминоконцевых аминокислотных остатков.

В альтернативном воплощении данного изобретения связывающие домены полипептида отличаются друг от друга.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит первый связывающий домен, который представляет собой связывающий домен гормона роста, и второй связывающий домен, который представляет собой связывающий домен пролактина.

Предпочтительно указанный полипептид состоит из связывающего домена гормона роста и связывающего домена пролактина.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит первый связывающий домен, который представляет собой модифицированный связывающий домен гормона роста, и второй связывающий домен, который представляет собой модифицированный связывающий домен пролактина.

Предпочтительно указанный полипептид состоит из модифицированного связывающего домена гормона роста и модифицированного связывающего домена пролактина.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный модифицированный связывающий домен гормона роста содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты глицина 120. Предпочтительно указанная модификация представляет собой замену глицина 120 аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина, триптофана, тирозина, фенилаланина или глутаминовой кислоты.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная модификация представляет собой замену глицина 120 остатком аминокислоты аргинин.

В дополнительном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный модифицированный связывающий домен пролактина содержит модификацию глицина 129. Предпочтительно указанная модификация представляет собой замену глицина 129 остатком аминокислоты аргинина. Предпочтительно указанная модификация дополнительно содержит делецию по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминоконцевых аминокислотных остатков.

В дополнительном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид дополнительно содержит лиганд-связывающий домен рецептора цитокина. Предпочтительно указанный рецептор представляет собой рецептор гормона роста. В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный рецептор представляет собой рецептор пролактина.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный лиганд-связывающий домен может быть соединен с указанным связывающим доменом цитокина линкером, содержащим негибкий спиральный участок или состоящим из него.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно данному изобретению.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, адаптированный для экспрессии указанного полипептида.

Типично данная адаптация включает обеспечение последовательностей контроля транскрипции (промоторных последовательностей), которые опосредуют экспрессию, специфичную для клеток/тканей. Эти промоторные последовательности могут быть специфичными для клеток/тканей, индуцируемыми или конститутивными.

Промотор является признанным в данной области термином и, ради ясности, включает следующие особенности, которые приведены только в качестве примера. Энхансерные элементы представляют собой цис-действующие последовательности нуклеиновых кислот, часто находящиеся 5' по отношению к сайту инициации транскрипции гена (энхансеры также могут быть обнаружены 3' по отношению к последовательности гена или даже могут быть локализованы в интронных последовательностях и, следовательно, являются независимыми от положения). Функция энхансеров заключается в увеличении скорости транскрипции гена, с которым связан энхансер. Активность энхансера является чувствительной к транс-действующим факторам транскрипции (полипептидам), которые, как было показано, специфически связываются с энхансерными элементами. Связывание/активность транскрипционных факторов (пожалуйста, смотрите Eukaryotic Transcription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego) являются чувствительными к целому ряду стимулов среды, которые включают, например, промежуточные метаболиты (например, глюкоза), эффекторы окружающей среды (например, тепло).

Промоторные элементы также включают так называемые ТАТА-бокс и последовательности выбора инициации РНК-полимеразы (RIS), функция которых заключается в выборе сайта инициации транскрипции. Эти последовательности также связывают полипептиды, функция которых, среди прочего, состоит в облегчении выбора инициации транскрипции РНК-полимеразой.

Адаптации также включают обеспечение селектируемых маркеров и последовательностей автономной репликации, которые облегчают поддержание вектора в эукариотической или прокариотической клетке. Векторы, которые поддерживаются автономно, именуются эписомальными векторами.

Адаптации, которые облегчают экспрессию генов, кодируемых вектором, включают обеспечение последовательностей терминации транскрипции/полиаденилирования, что также включает обеспечение внутренних сайтов связывания рибосом (IRES), функция которых состоит в максимизации экспрессии генов, кодируемых вектором, организованных в бицистронные или мультицистронные кассеты экспрессии.

Эти адаптации являются хорошо известными в данной области. Существует значительное количество опубликованной литературы относительно конструкции векторов экспрессии и технологии рекомбинантных ДНК в целом. Пожалуйста, смотрите Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY и ссылки в данной публикации; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Для специалиста в данной области будет очевидным, что векторы согласно данному изобретению могут являться векторами генной терапии. Векторы для генной терапии обычно основаны на вирусах. Целый ряд вирусов обычно используют в качестве векторов для доставки экзогенных генов. Обычно используемые векторы включают рекомбинантно модифицированные ДНК и РНК вирусы с оболочкой или без оболочки, предпочтительно выбранные из baculoviridiae (бакуловирусы), parvoviridiae (парвовирусы), picornoviridiae (пикорновирусы), herpesviridiae (герпесвирусы), poxviridiae (поксвирусы), adenoviridiae (аденовирусы) или picornaviridiae (пикорнавирусы). Также можно использовать химерные векторы, которые эксплуатируют полезные элементы каждого свойства родительского вектора (смотрите, например, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870). Такие вирусные векторы могут быть векторами дикого типа или могут быть модифицированы методами рекомбинантных ДНК так, чтобы быть дефицитными по репликации, условно реплицирующимися или компетентным по репликации.

Предпочтительные векторы происходят из аденовирусных, связанных с аденовирусными, и ретровирусных геномов. В наиболее предпочтительном осуществлении данного изобретения векторы происходят из генома аденовируса человека. Особенно предпочтительные векторы происходят из серотипов 2 или 5 аденовируса человека. Способность к репликации таких векторов можно ослабить (до точки, рассматриваемой как «дефицитная по репликации») путем модификаций или делеций в кодирующих областях Е1а и/или Е1b. Предпочтительными являются другие модификации вирусного генома для достижения конкретных особенностей экспрессии или обеспечения повторного введения, или меньшей иммунной реакции.

В качестве альтернативы, вирусные векторы могут быть условно реплицирующимися или компетентными по репликации. Условно реплицирующиеся вирусные векторы используют для достижения избирательной экспрессии в конкретных типах клеток, при избежании нежелательной инфекции широкого спектра. Примеры условно реплицирующихся векторов описаны в Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30А(8):1165-1171. Дополнительные примеры избирательно реплицирующихся векторов включают те векторы, где ген, существенный для репликации вируса, находится под контролем промотора, который является активным только в конкретном типе клеток или при конкретном состоянии клеток так, что в отсутствие экспрессии такого гена данный вирус не будет реплицироваться. Примеры таких векторов описаны в Henderson et al., патент Соединенных Штатов №5698443, выданный 16 декабря 1997, и Henderson et al., патент Соединенных Штатов №5871726, выданный 16 февраля 1999, все идеи которых включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Дополнительно, вирусный геном можно модифицировать путем включения индуцируемых промоторов, которые обеспечивают репликацию или экспрессию только при определенных условиях. Примеры индуцируемых промоторов известны в научной литературе (смотрите, например, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; and Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371.

Векторы также могут быть невирусными и доступными из целого ряда коммерческих источников, легко доступных специалисту в данной области. Например, данные векторы могут представлять собой плазмиды, которые могут быть эписомальными или интегрирующими.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложена клетка, трансформированная или трансфицированная нуклеиновой кислотой или вектором согласно данному изобретению.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку.

Предпочтительно указанная эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки грибов, например Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp; миксомицетов (например Dictyostelium spp); клетки насекомых (например Spodoptera frugiperda); растительной клетки или клетки млекопитающего (например клетка СНО (яичник китайского хомячка)).

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанная клетка представляет собой прокариотическую клетку.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ получения полипептида согласно данному изобретению, включающий стадии:

1) выращивания клетки согласно данному изобретению в условиях, приводящих к продуцированию полипептида согласно изобретению, и

2) выделения полипептида из клетки или из ее ростовой среды. В предпочтительном способе по данному изобретению указанный полипептид снабжен аффинной меткой.

Аффинные метки являются известными в данной области и включают белок, связывающий мальтозу, глутатион-S-трансферазу, белок, связывающий кальмодулин, и полученные при помощи генной инженерии полигистидиновые участки в белках, которые затем очищают путем аффинной очистки на матрицах, содержащих никель. Во многих случаях имеющиеся в продаже векторы и/или наборы можно использовать для слияния интересующего белка с подходящей аффинной меткой, с последующей его трансфекцией в клетку-хозяина для экспрессии и последующей экстракции и очистки на аффинной матрице.

В находящейся на одновременном рассмотрении заявке WO 03/034275 авторов данного изобретения, содержание которой включено в описание данного изобретения посредством ссылки, авторы изобретения описывают новую аффинную метку для полипептидов, которая использует домен, включающий сигнальную последовательность, которая направляет добавление гликозилфосфатидилинозитола к полипептиду. Полипептиды, которые включают гликозилфосфатидилинозитольную метку, предпочтительно встраиваются в липидные мембраны и могут обладать антагонистическим действием на активацию рецепторов цитокинов. Следовательно, изобретение, раскрытое здесь, охватывает полипептиды с присоединенной молекулой гликозилфосфатидилинозитола.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен полипептид, содержащий первый цитокиновый связывающий домен, соединенный со вторым цитокиновым связывающим доменом, где указанный полипептид дополнительно содержит внеклеточный домен цитокинового рецептора.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй связывающие домены соединены гибкой линкерной молекулой.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй домены связывания соединены пептидной линкерной молекулой, которая содержит негибкий спиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй связывающие домены соединены пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок и гибкий неспиральный участок.

Пептидные линкеры, которые содержат негибкие спиральные участки и комбинации негибких спиральных участков и гибких неспиральных участков, были описаны выше и являются применимыми к этому воплощению данного изобретения, как и определенные ранее цитокины и цитокиновые рецепторы.

В предпочтительном воплощении данного изобретения внеклеточный домен цитокинового рецептора соединен с первым или вторым цитокиновым связывающим доменом посредством линкерной молекулы. Предпочтительно указанная линкерная молекула содержит негибкий спиральный участок.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанная линкерная молекула является гибкой.

Предпочтительно указанная линкерная молекула содержит негибкий спиральный участок и гибкий неспиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный связывающий цитокиновый домен представляет собой гормон роста или вариант гормона роста, и указанный внеклеточный домен является внеклеточным доменом гормона роста. Предпочтительно указанные домены являются человеческими.

Полипептид по данному изобретению может демонстрировать двойную функциональность. Во-первых, первый и второй домены, содержащие цитокины или их части, которые предпочтительно соединены пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок, способны связываться с рецепторами цитокинов поверхности клетки и стерически затруднять ассоциацию этих рецепторов в рецепторные комплексы, предотвращая, таким образом, последующую клеточную передачу сигнала. Во-вторых, предоставление третьего домена, содержащего рецепторы цитокинов или их части, обеспечивает способность функционирования в качестве растворимого рецептора, связывая, таким образом, любой цитокин перед его связыванием с рецептором поверхности клетки. Этот третий домен предпочтительно соединен с первым или со вторым доменом пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок. В альтернативном воплощении данного изобретения третий домен предпочтительно соединен с первым или вторым доменом пептидной линкерной молекулой, содержащей гибкий неспиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные пептидные линкерные молекулы дополнительно содержат аминокислотную последовательность, которая является чувствительной к протеолитическому расщеплению.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложено применение молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению в качестве фармацевтического средства.

Предпочтительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая молекулу полипептида или нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция содержит носитель, эксципиент и/или разбавитель.

При введении терапевтические композиции по настоящему изобретению вводят в фармацевтически приемлемых препаратах. Термин «фармацевтически приемлемый» означает нетоксичное вещество, которое не оказывает вредного воздействия на эффективность биологической активности активных ингредиентов. Такие препараты традиционно могут содержать соли, буферные вещества, совместимые носители, консерванты и возможно другие терапевтические агенты.

При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, однако фармацевтически неприемлемые соли можно с удобством использовать для получения фармацевтически приемлемых солей, и они не исключены из объема данного изобретения. Такие фармакологические и фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из следующих кислот: соляной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной и тому подобных, но не ограничиваются ими. Также фармацевтически приемлемые соли можно получить в виде солей щелочных и щелочноземельных металлов, как, например, соли натрия, калия или кальция.

Данные фармацевтические композиции могут содержать подходящие буферные агенты, включающие уксусную кислоту в соли; лимонную кислоту в соли; борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли.

Данные композиции можно объединять, если это желательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Термин «фармацевтически приемлемый носитель», в том виде, как он здесь используется, означает один или более чем один совместимый твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, которые подходят для введения человеку. Термин «носитель» означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединен активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также способны совместно смешиваться с молекулами по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что отсутствует взаимодействие, которое существенно ухудшило бы желательную фармацевтическую эффективность.

Фармацевтические композиции с удобством могут быть представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любым способом, хорошо известным в области фармации. Все способы включают стадию приведения активного агента в ассоциацию с носителем, который составляет один или более чем один вспомогательный ингредиент. В общем, данные композиции получают путем приведения активного соединения в однородную и тесную ассоциацию с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или ими обоими и затем, если это необходимо, путем формовки данного продукта.

Данные фармацевтические композиции также возможно могут содержать подходящие консерванты, такие как бензалкония хлорид; хлорбутанол; парабены и тимеросал.

Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить любым традиционным путем, включая инъекцию, или путем постепенной инфузии на протяжении определенного промежутка времени. Введение может быть, например, пероральным, внутривенным, интраперитонеальным, внутримышечным, внутриполостным, подкожным или чрескожным.

Композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, таблетки, лепешки, причем каждая из них содержит заданное количество активного соединения. Другие композиции включают суспензии в водных жидкостях или в неводных жидкостях, такие как сироп, эликсир или эмульсия.

Композиции по данному изобретению вводят в эффективных количествах. «Эффективное количество» представляет собой такое количество композиции, которое само по себе или совместно с дополнительными дозами дает желательную реакцию. В случае лечения конкретного заболевания, такого как рак, желательной реакцией является подавление развития заболевания. Это может включать только временное замедление развития заболевания, хотя, более предпочтительно, это включает перманентную остановку развития заболевания. Это можно отслеживать традиционными способами.

Такие количества будут, конечно, зависеть от конкретного состояния, которое лечат, от тяжести состояния, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физическое состояние, размер и массу,