Дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-a] бензимидазола и фармацевтическая композиция на его основе

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармации, и касается применения дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола при производстве лекарственного средства, обладающего противоишемическими, гемореологическими и антирадикальными свойствами, а также фармацевтической композиции, содержащей указанный активный компонент и обладающей указанными выше свойствами. Средство обладает высокой и не обладает выраженными побочными эффектами. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 18 табл., 1 ил.

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической химии, фармакологии и технологии лекарственных форм, и направлено на создание лекарственного препарата с противоишемическими, гемореологическими и антирадикальными свойствами.

Известно, что при ишемии ограничивается поступление кислорода и запускается каскад метаболических процессов, в которые вовлечена генерация свободных радикалов кислорода и азота (S.Love. Oxidative stress in brain ischemia. // Brain Pathology. - 1999. - Vol.9. - P.119-131), играющих ключевую роль при ишемических и, в особенности, реперфузионных поражениях (M.Fujimura, T.Tominaga, P.H.Chan. Neuroprotective effect of antioxidant in ischemic brain injury. // Neurocritical Care. - 2005. - Vol.2, №1. - P.59-66).

Одним из наиболее перспективных направлений фармакологической коррекции поражений мозга является применение нейропротекторов с разными механизмами действия, таких как «ловушки» свободных радикалов (СР), ингибиторы NO-синтазы и селенорганичекие соединения (Е.И.Гусев, В.И.Скворцова. Ишемия головного мозга. // - М.: Медицина, 2001). При этом, помимо использования для монотерапии, препараты, элиминирующие свободные радикалы, могут быть полезны в комбинации с другими терапевтическими подходами, в особенности, со средствами, восстанавливающими нарушенный кровоток, когда реперфузия вызывает массированное увеличение продукции СР (I.Margaill, M.Plotkine, D.Lerrouet. Antioxidant strategies in the treatment of stroke. // Free Rad. Biol. Med. - 2005. - Vol.39, №4. - 429-443).

Как правило, в лечении ишемических поражений используется сочетание нескольких препаратов, влияющих на основные патогенетические звенья ишемии. Поэтому в качестве препаратов сравнения при изучении противоишемических свойств был выбран кавинтон, нейропротективное действие которого опосредовано его сосудистыми и гемореологическими эффектами (Г.Н.Авакян, А.А.Никонов, Е.И.Чуканова. Кавинтон в эксперименте и клинической практике: Методические рекомендации. - М.: Медицина, 1998. - 55 с.), при исследовании антирадикальных и мембранопротекторных свойств - препарат мексидол (соль эмоксипина и янтарной кислоты), для которого характерно антирадикальное и противогипоксическое действие и который эффективен при острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Т.А.Воронина. Отечественный препарат нового поколения мексидол, основные эффекты, механизм действия, применение. Изд-во НИИ Фармакологии PAMH. - M. - 2003. - 20 c.), а при исследовании гемореологических свойств - препарат пентоксифиллин, оказывающий влияние на вязкостные характеристики крови (H.Flint, M.A.Cotter, N.E.Cameron. Pentoxifylline effects on nerve conduction velocity and blood flow in diabetic rats. // Int. J. Exp. Diabetes. Res. - 2000. - Vol., №1. - P.49-58) и эталонный антиагрегант - ацетилсалициловая кислота, широко используемая в клинической практике (В.А.Алмазов, B.C.Гуревич, Л.В.Шатилина и др. Роль гиперпероксидации липидов в нарушении структурой организации тромбоцитарных мембран. // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. - 1992. - №9. - С.265-267).

Техническим результатом изобретения является создание средства, обладающего более высокой противоишемической, гемореологической и антирадикальной активностью.

Технический результат достигается дигидробромидом 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола формулы I

Известно, что дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтил-аминоэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола оказывает церебропротекторное действие при радиационных поражениях (Патент РФ №2238938, C07D 235/04, 2004 г.).

Способ получения дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола заключается в конденсации 1-диэтиламиноэтил-2-аминобензимидазола с 3,4-диметоксифенацилбромидом, последующей циклизации образующегося в результате конденсации бромида 1-диэтиламиноэтил-3-(3,4-диметоксифенацил)-2-аминобензимидазолия в 48%-ной бромистоводородной кислоте (т.кип. 127°С), сопровождающейся деметилированием метоксигрупп и образованием искомого дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)замещенного имидазо[1,2-а]бензимидазола (аналогию см. Хим.-фарм. журнал, 2006 г., т.40, №10, с.3-10).

Ниже приведен пример получения соединения I.

Пример. Дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-этиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола (I).

В раствор 2,32 г (10 ммоль) 2-амино-1-диэтиламиноэтилбензимидазола в 25 мл ацетона вносят 2,6 г (10 ммоль) 3,4-диметоксифенацилбромида. Выпавший осадок бромида 2-амино-1-(2-диэтиламиноэтил)-3-(3,4-диметоксифенацил)бензимидазолия отфильтровывают, промывают ацетоном. Выход 4,6 г (93,5%). Т.пл. 182°С (разложение, из спирта). Найдено, %: C 56,2; H 6,4; Br 16,4; N 11,3. C23H30N4O3·HBr. Вычислено, %: C 56,2; H 6,4; Br 16,3; N 11,4. ИК-спектр (вазелиновое масло): 1685 см-1 (C=O).

Кипятят 4 г (~8 ммоль) полученного бромида в 160 мл конц. HBr (т.кип.127°С) до полного протекания реакции (контроль - ТСХ: исчезновение пятна исходного имина и промежуточно образующегося 2-(3,4-диметоксифенил)замещенного имидазо[1,2-а]бензимидазола). По охлаждении осадок искомого дигидробромида отфильтровывают, промывают ацетоном. Выход 4,1 г (96%). Кристаллизуется соль из 80%-ного водного спирта в виде белоснежных волокнистых кристаллов, которые после высушивания при 110-120°С имеют т.пл. 289-290°С (разложение). Кристаллогидрат с 1 молекулой воды плавится при 180°С. В ИК-спектре полученного дигидробромида отсутствует полоса поглощения карбонильной группы, присутствующая в ИК-спектре четвертичной соли. Найдено, %: C 47,6; H 5,3; Br 30,0; N 10,7. C21H24N4O2·2HBr. Вычислено, %: C 47,9; H 5,0; Br 30,4; N 10,7.

Фармакологические свойства заявленного соединения I.

Данное соединение (I) проявляет противоишемические и гемореологические свойства, обладает широким спектром антирадикальной активности.

Исследование противоишемической активности соединения I in vivo (модель 4-сосудистой перевязки артерий мозга с реперфузией у крыс)

Материалы и методы

Опыты выполнены на 40 неинбредных крысах обоего пола массой 180-230 г, которых содержали в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ. Забой животных проводили согласно требованиям, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989).

Соединение I (5 мг/кг) и препарат сравнения кавинтон (5 мг/кг) вводили однократно внутрибрюшинно за 10 мин перед окклюзией каротидных артерий. Для исследования было сформировано 3 группы: 1) контроль - ложнооперированные крысы; 2) ишемия; 3) животные с ишемией, которым за 10 мин до окклюзии вводили исследуемое вещество.

Тотальную ишемию головного мозга с последующей реперфузией моделировали по методу (C.Bromont, C.Marie, J.Bralet. Increased lipid peroxidation in vulnerable brain regions after transient forebrain ischaemia in rats. // Stroke. - 1989. - Vol.20, №7. - P.918-924). Первоначально производили термокоагуляцию вертебробазилярных артерий. Через 4 сут после восстановления животных на каротидные артерии накладывали окклюзоры без пережатия. Все этапы операции проводили под наркозом (калипсол 80-100 мг/кг, в/бр). На следующие сутки после второй операции моделировали тотальную ишемию головного мозга пережатием каротидных артерий окклюзорами в течение 30 мин. Реперфузия достигалась снятием окллюзоров, восстановление кровотока контролировали визуально.

В восстановительном периоде оценивали показатели двигательной активности (актометр Ugo Basile, Италия) в 1-е и 2-е сут реперфузии. В течение первых 7 сут оценивали неврологический статус животных и динамометрию передних лап, которую определяли по усилию удержания кольца динамометра при рефлексе хватания передними лапами, как описано (В.В.Дрозд, В.А.Косолапов, О.В.Островский, А.А.Спасов. Динамика восстановительного периода у крыс, перенесших тотальную ишемию головного мозга. // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 2000. - Т.130, №10. - С.475-477.). Неврологический статус оценивали по 3-х балльной шкале с учетом нормальных (2 балла), сниженных (1 балл) или отсутствующих (0 баллов) рефлексов (роговичного, отдергивания хвоста, задней лапы, переворачивания, хватания передними лапами и вздрагивания на звуковой раздражитель). На 7-е сут реперфузии исследовали запоминание аверсивного стимула в тесте условной реакции пассивного избегания (УРПИ), обучение проводили предварительно за 1 час до начала ишемии. При наблюдении за животными позже 7 сут динамики отмечено не было.

Смертность в ходе эксперимента колебалась между 25 и 35%. Гибель после термокоагуляции вертебробазилярных артерий составляла не более 10%. После 2-го этапа - наложения окклюзора на каротидные артерии гибели животных не наблюдали.

Статистическую обработку данных проводили в пакете Statistica 6.0. па (StatSoft, США) с использованием дисперсионного анализа множественных сравнений и критерия Шеффе (p≤0,05 или p≤0,01).

Результаты.

При изучении влияния соединения I на восстановление крыс в реперфузионном периоде после ишемии было установлено, что соединение I превосходило препарат сравнения кавинтон по активности, более выражено восстанавливая нарушенную двигательную активность в 1-е и 2-е сут реперфузии (Таблица 1). Соединение I достоверно улучшало неврологический статус и вызывало его полную нормализацию на 7-е сут наблюдений (Таблица 2), а также практически полное восстановление мышечной силы (Таблица 3). Кавинтон не приводил к полной нормализации неврологического статуса и динамометрии - на 7-е сут дефицит составлял 34% и 23,5% соответственно. Соединение I нормализовало запоминание обучающего задания в тесте УРПИ у животных, перенесших тотальную ишемию мозга, сокращая дефицит памяти до 15,3% (p<0,01) (Таблица 4). Препарат сравнения также оказывал некоторое корректирующее влияние на памятный след, однако дефицит памяти под влиянием кавинтона составлял 50,3%.

Таким образом, соединение I превосходит препараты сравнения дибунол и кавинтон по противоишемической активности.

Исследование антирадикальной активности соединения I in vitro

Материалы и методы

В качестве препарата сравнения использовали мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия). Исследование процессов хемилюминесценции проводили на хемилюминометре «Хемилюминомер-03» (Уфа, Россия), связанном интерфейсом с компьютером.

Способность веществ взаимодействовать с липидными радикалами LOO исследовали на модели Fe2+-индуцированной хемилюминесценции липидов (P.P.Фархутдинов, В.А.Лиховских. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. // - Уфа, 1995. - 110 с.). Реакционная смесь объемом 20 мл содержала липиды куриного желтка, содержащего липопротеиновые комплексы. Содержание белка определяли с помощью кумасси синего и доводили до 1 мг на мл дальнейшим разведением. Инициирование ПОЛ осуществляли FeSO4 (чда, Украина) в конечной концентрации 2,5 мМ при интенсивном перемешивании и t 37°C, после чего в течение 10 мин измеряли кинетику хемилюминесценции.

Для измерения ХЛ, сопровождающей аутоокисление люминола с генерацией активных форм кислорода (АФК) (С.Г.Семешко, P.P.Фархутдинов. Общая антиоксидантная активность слезной жидкости. // Клин. лаб. диаг. - 2002. - №24. - С.33-34), в кювету хемилюминометра добавляли фосфатный буфер pH 7,45, содержащий 1 мкМ люминола (Serva, Германия) и 5 мМ цитрата натрия (ЧД, Россия) в конечном объеме 20 мл. Инициирование ХЛ осуществляли FeSO4 в конечной концентрации 2,5 мМ при интенсивном перемешивании и в течение 5 мин измеряли кинетику ХЛ.

Для оценки способности веществ инактивировать супероксидный анион-радикал использовали непрямой метод (В.А.Костюк, А.И.Потапович, Ж.В.Ковалева. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина. // Вопр. мед. химии. - 1990. - Т.36, №2. - С.88-91) с применением кверцетина (Sigma, США). Ингибиторную активность соединений регистрировал по торможению падения оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, Россия) при λ 406 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Степень ингибирования реакции рассчитавали: % инг=100-(ΔDвещ/ΔDкверц×100), где ΔDвещ - изменение оптической плотности за 10 мин в опытной пробе, содержащей вещество; ΔDкверц - изменение оптической плотности за 10 мин в контрольной пробе, не содержащей вещества. Также применяли прямой хемилюминесцентный метод ксантин-ксантиноксидаза индуцированной люцигенин-зависимой ХЛ (B.Gunaydin, A.T.Demiryurek. Interaction of lidocaine with reactive oxygen and nitrogen species. // Eur. J. Anaesthesiol. - 2001. - Vol.18, №12 - P.816-822). Генерацию супероксидного радикала вызывали внесением 0,25 мл ксантиноксидазы (Sigma, США) (0,25 U/ml) в пробу, содержащую 10 мл фосфатного буфера pH 7,45, содержащего 5 мкМ люцигенина (Fluka, Швейцария) и 0,5 мл 1 мМ ксантина (Sigma, США). Кинетику хемилюминисценции оценивали в течение 5 мин при интенсивном перемешивании и t 37°C.

Способность веществ к перехвату и инактивации пероксильного радикала (ROO) оценивали по методу (Г.И.Клебанов, О.Б.Любицкий, О.В.Васильева и др. // Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина. // Вопр. мед. химии. - 2001. - Т.47. - С.288-300). Инициирование реакции осуществляли водорастворимым 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлоридом (АБАП) (Fluka, Швейцария), который при t 37°C разлагается, образуя пероксильные радикалы. В пробу, содержащую 2,5 мкМ люминола (Serva, Германия) в фосфатном буфере pH 7,4 при постоянном перемешивании и t 37°C, вносили 50 мМ АБАП и измеряли кинетику ХЛ в течение 30 мин.

Изучаемые вещества вводили в среду инкубации за 1 мин перед инициированием реакции в широком диапазоне концентраций.

Результаты оценивали статистически в программе Statistica 6.0 с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферони (t). Отличия от контроля во всех группах считали статистически значимыми при Р≤0,05. Для сравнительной оценки эффективности веществ рассчитывали величины ИК50 (концентрация вещества, ингибирующая реакцию на 50%). Расчет ИК50 проводили с помощью простого линейного регрессионного анализа, реализованного во встроенном пакете анализа программы Microsoft Excel 2000 с расчетом парного коэффициента корреляции R2. Достоверность регрессии оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа в программе «Statistica 6.0» (Stat Soft, США).

Результаты

Исследуемое вещество I дозозависимо подавляло образование липопероксильных радикалов (Таблица 5) и по величине ИК50 почти на два порядка превосходило мексидол по активности. Соединение I почти в 15 раз превосходило мексидол по способности инактивировать активные формы кислорода в реакции Fe2+-индуцированной хемилюминесценции в присутствии люминола (Таблица 6). У соединения I отмечалась выраженная ингибирующая активность в отношении супероксидного радикала как в реакции с кверцетином (Таблица 7), так и при исследовании хемилюминесценции в системе ксантин-ксантиноксидаза в присутствии люцигенина (Таблица 8). Мексидол по способности к перехвату супероксида уступал соединению I более чем на порядок. Исследуемое соединение I дозозависимо угнетало образование пероксильных радикалов (Таблица 9), регистрируемых с помощью хемилюминесценции, сопровождающей термическое разложение АБАП, почти в десять раз превосходя мексидол по величине ИК50.

Таким образом, соединение I превосходило мексидол более чем в десять раз по способности перехватывать липопероксильный, супероксидный и другие активные формы кислорода и АБАП-радикалы.

Исследование гемореологических свойств соединения I in vitro и in vivo

Материалы и методы

Антиагрегантную активность веществ исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов/счетчике (модель 220 LA) (НПФ "Биола", Москва) по методу (G.V.R.Born. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. // Nature. - 1962. - Vol.194. - P.927-929) в модификации (З.А.Габбасов, Е.Г.Попов, И.Ю.Гаврилов и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов. // Лабораторное дело. - 1989. - №10. - С.15-18). Исследования "in vitro" проводили на богатой тромбоцитами плазме (В.А.Люсов, Ю.Б.Белоусов. Метод графической регистрации агрегации тромбоцитов и изменения ее при ишемической болезни сердца. // Кардиология. - 1971. - №8. - С.459-461). Количество тромбоцитов регистрировали с помощью счетчика тромбоцитов. В качестве индуктора использовали 5 мкМ динатриевую соль АДФ (Reanal, Венгрия). Антиагрегантную активность соединений изучали в диапазоне концентраций от 1×10-4 до 1×10-6 М. Уровень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Расчет антиагрегационого действия изучаемых веществ проводили по формуле (А-В)×100/А, где А -уровень агрегации тромбоцитов нативной плазмы, В - уровень агрегации тромбоцитов плазмы после инкубации с исследуемым веществом. Препаратом сравнения служили мексидол и ацетилсалициловая кислота.

Исследование влияния соединения I и препарата сравнения мексидола на агрегацию тромбоцитов "in vivo" проводили в опытах на 30 интактных нелинейных крысах массой 220-260 г.

Соединение I вводили в дозах 30 мг/кг внутрижелудочно в течение 3-х дней, мексидол вводили в эквимолярной дозе. Контрольные животные получали растворитель (дистиллированная вода). Забор крови из брюшной аорты осуществляли под нембуталовым (40 мг/кг) наркозом через 2 часа после введения соединений. Агрегацию тромбоцитов изучали по описанной выше методике с расчетом степени максимальной агрегации и степени дезагрегации (как разность между максимальной агрегацией тромбоцитов и агрегацией на 5-й мин), и скорость агрегации тромбоцитов (по величине максимального наклона кривой), выраженные в процентах к контролю, при этом степень агрегации тромбоцитов в контроле принимали за 100%. Подсчет количества тромбоцитов проводили на счетчике модели 220LA (НПФ "Биола", Москва) (З.А.Габбасов и др., 1989).

Измерение вязкости крови проводили на реологическом анализаторе крови АКР-2 (Россия) (Н.А.Добровольский, Ю.М.Лопухин, А.С.Парфенов и др. Анализатор вязкости крови. // Реологические исследования в медицине: Сб. науч. тр. / М.: НЦХ РАМН, 1998. - С.45-51) при нескольких скоростях сдвига (от 200 до 5 с-1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах. При этом вязкость в области малых скоростей сдвига служит характеристикой агрегации эритроцитов, а в области более высоких скоростей сдвига - показателем их деформируемости. Все исследуемые образцы приводились к единому гематокриту 45 у.е., измеряемому на микрогемоцентрифуге МГЦ-8 (8000 об/мин, 2 мин). Исследования изучаемых соединений in vitro проводили в концентрациях от 1×10-4 до 1×10-6 М. Соединение I и препарат сравнения пентоксифиллин растворяли в физиологическом растворе, непосредственно перед исследованием, и 20 мкл раствора добавляли к исследуемой пробе перед термостатированием. В контрольные образцы вносили эквивалентное количество физиологического раствора (37°С). Кровь забирали из локтевой вены здоровых доноров и стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.

Изучение влияния соединения I на реологические свойства крови при реперфузионном поражении головного мозга проводили на 40 нелинейных крысах-самцах массой 240-280 г, наркотизированных хлоралгидратом в дозе 400 мг/кг. Измерение вязкости крови проводили как описано выше. Глобальную ишемию головного мозга воспроизводили билатеральной окклюзией общих сонной артерий в сочетании с контролируемой гипотензией (Методические указания по экспериментальному изучению перпаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени: Метод, рекомендации. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; Сост.: Р.С.Мирзоян, А.С.Саратиков, М.Б.Плотников и др. - М., 2000. - 398 с.). Предварительно артериальное давление снижалось под влиянием забора крови из яремных вен до 50 мм рт.ст. (полученные образцы использовались для оценки исходных реологических показателей). Соединение I в дозе 10 мг/кг и пентоксифиллин в дозе 8 мг/кг вводили перорально за 30 мин до ишемии. Контрольным группам (ишемия - контроль и ложнооперированные животные) вводили физиологический раствор в аналогичном объеме. В качестве нормального контроля использовалась группа ложнооперированных животных. Через 1 час ишемии производили снятие лигатур с сонных артерий, что обеспечивало реперфузию головного мозга. Спустя час после реперфузии кровь забирали из нижней полой вены. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.

Для изучения влияния веществ на оксидативный гемолиз эритроцитов забор крови производили из ушной вены кролика в пробирки с 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 1:9. Эритроциты трехкратно отмывали трис-NaCl-буфером pH 7,4, Суспензия эритроцитов в буфере приводилась к единому гематокриту 45 у.е. Соединение I и препарат сравнения мексидол вводили в эритроцитарную суспензию непосредственно перед термостатированием в дозах 10-4, 10-5 и 10-6 М. За основу был выбран метод (M.Tsuchiya, A.Asada, E.Kasahara et al. Antioxidant protection of propofol and its recycling in erythrocyte membranes. // Am. J. Resp. Crit. Care Med. - 2002. - Vol.165. - P.54-60) в нашей модификации. Гемолиз эритроцитов индуцировали 50 мМ водорастворимым 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлоридом (АБАП) (Fluka, Швейцария), который при t 37°C разлагается, образуя пероксильные радикалы. После инкубирования с разными интервалами времени образы центрифугировали при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3 (Россия) 10 мин и в супернатанте измеряли поглощение при 540 нм на СФ-46 (Ломо, Россия). Уровень гемолиза оценивали в процентах по отношению к абсолютному гемолизу эритроцитов в дистиллированной воде.

Статистическую обработку результатов экспериментов производили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0» с использованием парного критерия Стьюдента при предварительной проверке выборки на нормальность распределения или критерия Манна-Уитни.

Результаты.

При изучении влияния соединения I и препаратов сравнения мексидола и ацетилсалициловой кислоты на агрегацию тромбоцитов in vitro, индуцированную 5 мкМ АДФ, было установлено (Таблица 10), что соединение I, ЭК50 которого составила 3,30×10-4 М, превосходило препараты сравнения по активности.

Было установлено, что соединение I обладает способностью дозозависимо ингибировать АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и в условиях целого организма (Таблица 11). Оно уменьшало как степень максимальной агрегации тромбоцитов, так и скорость образования агрегатов, а также проявляло дезагрегирующие свойства, практически не меняя количество тромбоцитов, что свидетельствует о том, что изменение способности тромбоцитов к агрегации связано не с изменением их числа, а с возникшей под действием соединения I гипореактивностью кровяных пластинок. Мексидол уступал соединению I как по влиянию на степень максимальной агрегации тромбоцитов и скорость образования агрегатов, так и по влиянию на дезагрегацию.

Соединение I дозозависимо снижало вязкость крови доноров при всех скоростях сдвига (Таблица 12). Так при скорости сдвига 200 сПз соединение I снижало вязкость крови на 4,24%, а пентоксифиллин - на 3,15%, что свидетельствует о влиянии соединений на пластичность мембраны эритроцитов. При снижении концентрации веществ в пробе при указанной скорости сдвига эффективность соединения I снижается и составляет 1,32%, а пентоксифиллин практически не оказывает влияния на вязкость крови. Со снижением скорости сдвига влияние соединения I на данный параметр увеличивается, являясь достоверным в концентрациях вещества 1×10-4 и

1×10-5 М. Препарат сравнения, в указанных концентрациях, оказывается практически не эффективным.

Таким образом, наибольший эффект соединения I на вязкость крови доноров проявляется при низких скоростях сдвига, что подтверждается статистически достоверными изменениями индекса агрегации.

Соединение I также достоверно снижало вязкость крови у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга особенно при низких скоростях сдвига (Таблица 13) (на 30% по сравнению с ишемизированной группой животных), и его эффект был сравним с пентоксифиллином.

При инкубировании в течение 2 ч в присутствии гидрофильного радикального инициатора АБАП можно было наблюдать существенный гемолиз эритроцитов по сравнению с контролем, который составил 81% (Таблица 14) (p<0,05) по сравнению с 29% в контроле с буфером. Соединение I в максимальной дозе 100 мкМ в суспензию эритроцитов приводило к дозозависимому достоверному снижению гемолиза до 39,3%. Мексидол оказался менее эффективен, чем соединение I в соответствующих концентрациях.

Таблица 1
Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на спонтанную двигательную активность крыс в раннем восстановительном периоде после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (M±m)
Группы животных n Первые сутки, у.е. % от контроля Вторые сутки, у.е. % от контроля
Контроль (Ложнооперированные) 9 121,3±9,32 - 107,2±8,54 -
Ишемия 9 16,1±3,01* -86,7 18,7±3,95* -82,6
Ишемия + соединение I 9 75,8±7,72*+ -37,5 58,5±3,58*+ -45,4
Контроль (Ложнооперированные) 9 111,9±44,80 - 75,7±25,99 -
Ишемия 9 44,0±27,00 -60.7 25,2±13,63 -66,7
Ишемия + Кавинтон 9 45,6±13,00 -59,2 21,5±15,72 -71,6
n - число животных в эксперименте
* - данные статистически значимы по отношению к Контролю (p<0,01)
+ - данные статистически значимы по отношению к Ишемии (p<0,01)
Таблица 2
Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на неврологический статус (баллы) крыс в раннем восстановительном периоде после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (М±m)
Группы Сутки после ишемии
1 2 3 5 7
Контроль (Ложнооперированные) 12,0±0,00 12,0±0,00 12,0±0,00 12,0±0,00 12,0±0,00
Ишемия 5,3±0,37* 5,0±0,24* 4,6±0,48* 6,5±0,22* 7,4±0,24*
Ишемия + соединение I 9,5±0,22*+ 10,0±0,37*+# 9,7±0,49*+ 11,4±0,24+# 11,6±0,24+
Контроль (Ложнооперированные) 12,0±0,00 12,0±0,00 12,0±0,00 12,0±0,00 12,0±0,00
Ишемия 5,6±0,50* 5,8±0,40* 5,6±0,50* 5,8±1,33* 6,5±1,32*
Ишемия + Кавинтон 6,5±0,82* 6,5±0,52* 6,6±0,89* 6,8±0,83* 7,9±0,83*
* - данные статистически значимы по отношению к контролю при p≤0,01
+ - данные статистически значимы по отношению к ишемии при p≤0,01
# - данные статистически значимы по отношению к кавинтону при p≤0,05
Таблица 3
Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на мышечную силу передних лап (граммсилы) крыс в раннем восстановительном периоде после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (М±m)
Группы Сутки после ишемии
1 2 3 5 7
Контроль (Ложно-оперированные) 391,0±3,32 390,8±3,74 394,0±2,92 392,0±3,39 392,0±2,54
Ишемия 131,1±22,13* 117,7±16,81* 98,6±24,73* 193,3±8,03* 248,0±13,56*
Ишемия + соединение I 343,3±7,60*+# 337,5±8,70*+ 344,1±9,86*+# 386,0±4,00+# 386,0±5,10+#
Контроль (Ложнооперированные) 392,5±4,23 393,5±8,34 391,2±6,42 390,4±14,2 3 392,5±9,52
Ишемия 218,2±20,88* 221,8±20,49* 170,1±33,32* 160,2±30,5* 211,7±44,23
Ишемия + Кавинтон 275,5±8,9+ 279,1±11,4 250,3±12,25+ 244,0±14,35 272,1±43,29
* - данные статистически значимы по отношению к контролю при p≤0,05
+ данные статистически значимы по отношению к ишемии при p≤0,05
# - данные статистически значимы по отношению к кавинтону при p≤0,05
Таблица 4
Влияние соединения I (5 мг/кг) и кавинтона (5 мг/кг) на запоминание аверсивного стимула крысами в условной реакции пассивного избегания на седьмой день после четырехсосудистой перевязки артерий мозга (М±m)
Группа животных n Латентное время, с % от контроля
Контроль (Ложнооперированные) 5 176,0±4,00 -
Ишемия 5 15,6±5,08* -91,1
Ишемия + соединение I 5 149,0±13,27+ -15,3
Контроль (Ложнооперированные) 9 180,0±0,00 -
Ишемия 9 19,1±5,48* -89,44
Кавинтон 9 89,4±27,2* -50,33
n - число животных в эксперименте
* - данные статистически значимы по отношению к контролю при p≤0,01
+ - данные статистически значимы по отношению к ишемии при p≤0,01

Таблица 6
Влияние соединения I и мексидола на образование активных форм кислорода при люминолзависимой хемилюминесценции (М±m)
Вещество С, мкМ n S, отн.ед. % ингибирования ИК50, М
Контроль 0,0 4 76,83±1,21 - -
Соединение I 1,0 3 62,93±2,12* 18,1 4,44×10-6
5,0 3 37,03±0,77+ 51,8 R2=0,99
10,0 3 24,59±1,47+ 67,9 (F=1503,3; P=0,0164)
Контроль 0,0 3 77,06±4,21 - -
10,0 3 76,70±0,00 0,5 1,70×10-4
Мексидол 50,0 3 61,52±0,87* 20,2 R2=0,93
100,0 3 43,82±1,08+ 43,1 (F=13,05; Р=0,1719)
Примечание: n - количество выполненных повторов на каждое исследование, С - концентрация веществ в мкМ, S - суммарная светимость; * - p≤0,05 по отношению к контролю, + - p≤0,001 по отношению к контролю.
Таблица 7
Влияние соединения I и мексидола веществ на генерацию супероксидного радикала в реакции окисления кверцетина
Вещество С, мкМ % ингибирования ИК50, М
Соединение I 1,0 3,0 2,48×10-5
5,0 34,2 R2=0,96
10,0 72,1
Мексидол 1,0 25,8 6,91×10-4
10,0 26,6 R2=0,96
100,0 41,7
Таблица 8
Влияние соединения I и мексидола на генерацию супероксидного радикала в системе ксантин-ксантиноксидаза при люцигенин-зависимой хемилюминесценции (М±m)
Вещество С, мкМ S, отн.ед. % инг. ИК50, М
Контроль 0,0 61,62±3,80 - -
Соединение I 0,5 42,15±9,20 31,6 9,60×10-7
1,0 26,79±2,98+ 56,5 R2=0,97
5,0 8,44±0,40+ 86,3 (F=32,13; P=0,1111)
Контроль 0,0 80,81±7,33 - -
10,0 93,32±0,00 -15,5 1,67×10-4
Мексидол 50,0 57,72±1,93 28,6 R2=0,99
500,0 22,99±1,56* 71,5 (F=88,37; P=0,0694)
Примечание: С, мкМ - концентрация веществ, S - суммарная светимость, * - p<0,05 по отношениею к контролю, + - p<0,001 по отношению к контролю
Таблица 9
Влияние соединения I и мексидола на образование пероксильного радикала при АБАП-индуцированной хемилюминесценции (М±m)
Вещество С, мкМ n S, отн.ед. % ингибирования ИК50, М
Контроль 0,0 4 612,09±23,96 - -
0,1 3 457,37±4,45* 25,2 2,00×10-7
Соединение I 0,25 3 295,02±2,39* 51,8 R2=0,96
0,5 3 58,67±10,92 90,4 (F=28,04;Р=0,1188)
Контроль 0,0 3 698,28±42,64 - -
1,0 3 396,37±16,78* 43,2 1,38×10-6
Мексидол 5,0 3 158,64±68,18* 77,3 R2=0,98
10,0 3 105,19±15,93* 84,9 (F=63,88; Р=0,0792)
Примечание: n - количество выполненных повторов на каждое исследование, С - концентрация веществ в мкМ, S - суммарная светимость; * - p≤0,05 по отношению к контролю.
Таблица 10
Влияние соединения I, мексидола и ацетилсалициловой кислоты на агрегацию тромбоцитов in vitro, индуцированную 5 мкМ АДФ
Вещества Антиагрегантная активность, ЭК50 (М)
1. Соединение I 3,30×10-4
2. Мексидол 1,40×10-3
3. Ацетилсалициловая кислота 7,27×10-4
Таблица 11
Влияние соединения I и мексидола (3-дневное пероральное введение в дозе 60 мМ) на агрегацию тромбоцитов (индуцированную 5 мкМ АДФ) и количество тромбоцитов (М±m)
Изучаемые вещества Степень агрегации, отн.ед Скорость агрегации, отн.ед. Степень дезагрегации, % Количество тромбоцитов, 109
1. Контроль 84,05±8,14 67,25±11,00 0,95±0,95 359,0±26,70
2. Соединение I 10,44±2,11*# 13,07±2,64*# 15,59±6,56* 342,5±17,50
3. Мексидол 56,10±4,05* 28,65±3,06* 14,85±12,00 330,0±36,00
Примечание: n - количество исследований
* - данные статистически значимы по отношению к контролю (p<0,05)
# - данные статистически значимы по отношению к мексидолу (p<0,05)
Таблица 12
Влияние соединения I и пентоксифиллина (%) на вязкость крови доноров в экспериментах in vitro (M±m).
Соединение I С, М Скорость сдвига Индекс агрегации
200 с-1 40 с-1 10 с-1
Соединение I 1×10-4 -4,24±1,53 -9,72±1,74* -10,93±1,33* -6,69±1,65*
1×10-5 -1,32±0,62 -10,17±1,52* -11,54±1,05* -7,37±1,94*
1×10-6 0,00±0,00 -1,54±0,78 -1,75±0,74 -0,48±0,54
Пентоксифиллин 1×10-4 -3,15±0,92 -10,30±0,93* -10,47±1,07* -7,56±0,63*
1×10-5 0,00±0,00 -0,01±1,17 -0,52±0,52 -0,46±1,32
1×10-6 0,00±0,00 -1,17±3,50 0,24±0,57 -0,24±0,57
* - данные статистически значимы (t) по отношению к контролю (p<0,05)
Таблица 13
Влияние соединения I (10 мг/кг)и пентоксифиллина (8 мг/кг) (при пероральном введении) на вязкость крови (сПз) крыс с ишемией головного мозга при различных скоростях сдвига (М±m)
Группы животных Скорость сдвига
200 с-1 100 с-1 20 с-1 5 с-1
Контроль (Ложнооперированные) 3,44±0,09 3,62±0,09 4,72±0,15 6,62±0,4
Ишемия 4,09±0,22* 4,54±0,24* 6,31±0,33* 10,27±0,63*
Ишемия + соединение I 4,08±0,28 4,23±0,27 5,13±0,39 6,45±0,57
Ишемия + пентоксифиллин 3,76±0,14 3,96±0,17 4,84±0,28 6,28±0,62
* - данные статистически значимы (критерий Манна-Уитни) по отношению к контролю (p<0,05);
♣ - данные статистически значимы (критерий Манна-Уитни) по отношению к ишемии (p<0,05)
Таблица 14
Влияние соединения I и мексидола на АБАП-индуцированный окислительный гемолиз эритроцитов кролика in vitro (M±m).
Вещества С, М Гемолиз, % Статистическая значимость, Р
Контроль (физ. раствор) - 29,78±0,65 -
АБАП - 81,87±5,70 0,01
АБАП + соединение I 1·10-4 39,29±4,03 0,01
1·10-5 46,61±5,38 0,02
1·10-6 60,81±3,44 0,05
АБАП + Мексидол 1·10-4 55,28±0,60 0,04
1·10-5 54,08±2,99 0,03
1·10-6 74,55±13,60 0,68

Создание фармацевтической композиции для получения таблеток

Разработана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества - дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола и в качестве вспомогательных веществ коллидон, лактозу, поливинилпирролидон, тальк, кальция стеарат и натрия метабисульфит. Исследованы композиции при следующем соотношении ингредиентов, вес (г):

1. Дигидробромид 2-(3,4-диоксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо [1,2-а]бензимидазола - или 0,05 г, или 0,20 г, или 1,0 г
2. Коллидона - 0,05