Конструкции нуклеиновой кислоты и способы получения масла с измененным составом из семян

Конструкции нуклеиновой кислоты и способы получения масла с измененным составом из семян

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка притязает согласно разделу 35 Кодекса законов США на приоритет предварительной заявки на патент США № 60/772614, озаглавленной “Modified Gene Silencing”, которая была подана 13 февраля 2006 г.; предварительной заявки на патент США № 60/781519, озаглавленной “Soybean Seed and Oil Compositions and Method for Making Same”, которая была подана 10 марта 2006 г.; и заявки на патент США № 11/376328, озаглавленной “Nucleic Acid Constructs and Methods for Producing Altered Seed Oil Compositions”, которая была подана 16 марта 2006 г.

Включение списка последовательностей

В настоящее описание изобретения в качестве ссылки включена бумажная копия списка последовательностей и компьютерная форма списка последовательностей на дискете, содержащей файл с именем “Omni2 AS FILED.txt” размером 60690 байт (измерен в MS-DOS), который был записан 25 сентября 2003 г. и подан в заявке на патент США № 10/669888. В настоящее описание изобретения в качестве ссылки включена бумажная копия списка последовательностей и компьютерная форма списка последовательностей на дискете, содержащей файл с именем “OmniChild.txt” размером 61434 байт (измерен в MS-DOS), который был записан 15 марта 2006 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к молекулам рекомбинантной нуклеиновой кислоты, конструкциям и другим агентам, ассоциированным с координированной манипуляцией многими генами в пути синтеза жирных кислот. В частности, агенты по настоящему изобретению ассоциированы с одновременным повышением экспрессии определенных генов в пути синтеза жирных кислот и подавлением экспрессии других генов в том же пути. Настоящее изобретение относится также к растениям, содержащим такие агенты, и, в частности, к растениям, содержащим такие конструкции, которые характеризуются измененными составами масла из семян.

Уровень техники

Растительные масла применяются в разных областях. Необходимы новые составы растительных масел и более совершенные методы получения составов масла из биосинтезированных или природных растительных источников. В зависимости от предполагаемого применения масла желательны разные составы жирных кислот. Растения, в частности виды, синтезирующие большое количество масла в семенах, являются важным источником масел как для пищевого, так и для промышленного применения. Масла из семян почти полностью состоят из триацилглицеринов, в которых жирные кислоты этерифицированы в три гидроксильные группы глицерина.

Соевое масло обычно содержит примерно 16-20% насыщенных жирных кислот: 13-16% пальмитата и 3-4% стеарата. См. публикацию Gunstone et al., The Lipid Handbook, Chapman & Hall, London (1994). Соевые масла были модифицированы разными методами селекции в соответствии с требованиями конкретных рынков сбыта. Однако до сих пор не существует соевого масла, которое отвечало бы требованиям основных потребителей, таких как пищевая промышленность, где используется масло для заправки салатов, масло для выпечки и масло для жарения, и промышленные рынки, где соевое масло служит для производства биологического дизельного топлива и биологических смазочных масел. Ранее использовавшиеся соевые масла были или слишком дороги, или у них отсутствовало важное свойство пищевого качества, такое как устойчивость к окислению, хороший вкус жареной пищи или содержание насыщенных жиров, либо важное свойство биологического топлива, такое как требуемое выделение оксида азота, стойкость в холодном состоянии или текучесть на холоде.

Высшие растения синтезируют жирные кислоты в соответствии с обычным путем метаболизма, каким является путь жирная кислота-синтетаза (FAS), локализованный в пластидах. β-Кетоацил-АСР-синтазы являются важными ограничивающими синтез ферментами в FAS растительных клеток и существуют в нескольких вариантах. β-Кетоацил-АСР-синтаза I катализирует удлинение цепи до образования пальмитоил-АСР (С16:0), а то время как β-кетоацил-АСР-синтаза II катализирует удлинение цепи до образования стеароил-АСР (С18:0). β-Кетоацил-АСР-синтаза IV является вариантом β-кетоацил-АСР-синтазы II и может также катализировать удлинение цепи до 18:0-АСР. В сое основными продуктами FAS являются 16:0-АСР и 18:0-АСР. Десатурация 18:0-АСР с образованием 18:1-АСР катализируется локализованной в пластидах растворимой дельта-9-десатуразой (именуемой также “стеароил-АСР-десатураза”). См. публикацию Voelker et al., 52 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 335-61 (2001).

Продукты FAS и дельта-9-десатуразы в пластидах, 16:0-АСР, 18:-АСР и 18:1-АСР, гидролизуются специфичными тиоэстеразами (FAT). Растительные тиоэстеразы могут быть отнесены к двум семействам генов на основании гомологии последовательностей и предпочтения субстрата. Первое семейство, FATA, включает ацил-АСР-тиоэстеразы с длинными цепями, обладающие главным образом активностью 18:1-АСР. Ферменты второго семейства, FATB, обычно используют 16:0-АСР (пальмитоил-АСР), 18:0-АСР (стеароил-АСР) и 18:1-АСР (олеоил-АСР). Такие тиоэстеразы играют важную роль в определении длины цепи в процессе биосинтеза новых жирных кислот в растениях, поэтому указанные ферменты могут быть использованы для разных модификаций составов жирных кислот, в частности, для определения относительных соотношений групп разных жирных кислот, присутствующих в маслах из семян.

Продукты реакций FATA и FATB, свободные жирные кислоты, выводятся из пластид и превращаются в соответствующие сложные эфиры ацил-СоА. Ацил-СоА представляют собой субстраты для пути биосинтеза липидов (путь Кеннеди), который локализован в эндоплазматической сети (ER). Данный путь отвечает за образование мембранных липидов, а также за биосинтез триацилглицеринов, образующих масло из семян. В эндоплазматической сети находятся дополнительные мембранообразующие десатуразы, которые могут далее десатурировать 18:1 в полиненасыщенные жирные кислоты. Дельта-12 десатураза (FAD2) катализирует введение двойной связи в 18:1 с образованием линолевой кислоты (18:2). Дельта-15 десатураза (FAD3) катализирует введение двойной связи в 18:2 с образованием линоленовой кислоты (18:3).

Многие комплексные биохимические пути в настоящее время поддаются генетической манипуляции обычно путем подавления или сверхэкспрессии отдельных генов. Дальнейшее использование возможности генетической манипуляции растениями требует координированной манипуляции многими генами в пути. Были использованы разные методы объединения трансгенов в одном растении, которые включают скрещивание, ретрансформацию, котрансформацию и применение связанных трансгенов. Для координированного подавления многих эндогенных генов растения может быть использован химерный трансген со связанными неполными последовательностями генов. Конструкции, созданные на основе вирусных полипротеинов, могут быть использованы для одновременного введения нескольких кодирующих генов в растительные клетки. См. публикацию Halpin et al., Plant Mol. Biol. 47:295-310 (2001).

Таким образом, желаемый фенотип растения может потребовать экспрессии одного или нескольких генов и одновременного снижения экспрессии другого гена или генов. Поэтому существует потребность в одновременной сверхэкспрессии одного или нескольких генов и подавлении или снижении экспрессии другого гена или генов в растениях с использованием одной трансгенной конструкции.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к одной или нескольким молекулам рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые при введении в клетку или организм способны подавлять, по крайней мере частично снижать, сокращать, значительно сокращать или эффективно устранять экспрессию по крайней мере одной или нескольких эндогенных РНК FAD2, FAD3 или FATB и в то же время коэкспрессировать, одновременно экспрессировать или координированно продуцировать одну или несколько РНК или белков, транскрибированных из гена, кодирующего бета-кетоацил-АСР-синтазу I, бета-кетоацил-АСР-синтазу IV, дельта-9-десатуразу или СР4 EPSPS. Настоящее изобретение относится также к растительным клеткам и растениям, трансформированным одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, к семенам, маслу и другим продуктам, получаемым из трансформированных растений.

Настоящее изобретение относится также к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей первую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна подавлять эндогенную экспрессию по крайней мере одного, предпочтительно двух генов, выбираемых из группы, включающей гены FAD2, FAD3 и FATB; и вторую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна повышать эндогенную экспрессию по крайней мере одного гена, выбираемого из группы, включающей ген бета-кетоацил-АСР-синтазы I, ген бета-кетоацил-АСР-синтазы IV, ген дельта-9-десатуразы и СР4 EPSPS.

Настоящее изобретение далее относится к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей первую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна образовывать конструкцию дцРНК и подавлять эндогенную экспрессию по крайней мере одного, предпочтительно двух генов, выбираемых из группы, включающей гены FAD2, FAD3 и FATB, при этом первая совокупность последовательностей ДНК включает первую некодирующую последовательность, экспрессирующую первую последовательность РНК, которая по крайней мере на 90% идентична некодирующей области гена FAD2, первую антисмысловую последовательность, экспрессирующую первую антисмысловую последовательность РНК, способную образовывать молекулу двухцепочечной РНК с первой последовательностью РНК, вторую некодирующую последовательность, экспрессирующую вторую последовательность РНК, которая по крайней мере на 90% идентична некодирующей области гена FATB, и вторую антисмысловую последовательность, экспрессирующую вторую антисмысловую последовательность РНК, способную образовывать молекулу двухцепочечной РНК со второй последовательностью РНК; и вторую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способа повышать эндогенную экспрессию по крайней мере одного гена, выбираемого из группы, включающей ген бета-кетоацил-АСР-синтазы I, ген бета-кетоацил-АСР-синтазы IV, ген дельта-9-десатуразы и СР4 EPSPS.

Настоящее изобретение относится к способам трансформации растений при помощи указанных молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Данные способы включают способ создания трансформированного растения с повышенным содержанием олеиновой кислоты, пониженным содержанием насыщенных жирных кислот и пониженным содержанием полиненасыщенных жирных кислот в семени, который включает (А) трансформацию растительной клетки молекулой рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей первую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна подавлять эндогенную экспрессию по крайней мере одного, предпочтительно двух генов, выбираемых из группы, включающей гены FAD2, FAD3 и FATB, и вторую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна повышать эндогенную экспрессию по крайней мере одного гена, выбираемого из группы, включающей ген бета-кетоацил-АСР-синтазы I, ген бета-кетоацил-АСР-синтазы IV, ген дельта-9-десатуразы и СР4 EPSPS; и (В) выращивание трансформированного растения, образующего семя с повышенным содержанием олеиновой кислоты, пониженным содержанием насыщенных жирных кислот и пониженным содержанием полиненасыщенных жирных кислот по сравнению с семенем растения, имеющего подобную генетическую среду, но не содержащего молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение далее относится к способам трансформации растительных клеток молекулами рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Указанные способы включают способ изменения состава масла растительной клетки, который включает (А) трансформацию растительной клетки молекулой рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающей первую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна подавлять эндогенную экспрессию по крайней мере одного, предпочтительно двух генов, выбираемых из группы, включающей гены FAD2, FAD3 и FATB, и вторую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна повышать эндогенную экспрессию по крайней мере одного гена, выбираемого из группы, включающей ген бета-кетоацил-АСР-синтазы I, гена бета-кетоацил-АСР-синтазы IV, ген дельта-9-десатуразы и СР4 EPSPS; и (В) выращивание растительной клетки в условиях инициации транскрипции первой совокупности последовательностей ДНК и второй совокупности последовательностей ДНК, в результате чего изменяется состав масла по сравнению с растительной клеткой, имеющей подобную генетическую среду, но не содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится также к трансформированному растению, содержащему молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающую первую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна подавлять эндогенную экспрессию по крайней мере одного, предпочтительно двух генов, выбираемых из группы, включающей гены FAD2, FAD3 и FATB, и вторую совокупность последовательностей ДНК, которая при экспрессии в клетке-хозяине способна повышать эндогенную экспрессию по крайней мере одного гена, выбираемого из группы, включающей ген бета-кетоацил-АСР-синтазы I, ген бета-кетоацил-АСР-синтазы IV, ген дельта-9-десатуразы и СА4 EPSPS. Настоящее изобретение далее относится к трансформированному растению сои с семенем, в состав масла которого входит 55-80 мас.% олеиновой кислоты, 10-40 мас.% линолевой кислоты, 6 мас.% или меньше линоленовой кислоты и 2-8 мас.% насыщенных жирных кислот, к кормовому продукту, частям растения и семени, полученным из данного растения. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к трансформированному растению сои с семенем, в состав масла которого входит около 65-80% олеиновой кислоты, около 3-8% насыщенных жирных кислот и около 12-32% полиненасыщенных жирных кислот. Настоящее изобретение относится также к кормовому продукту, частям растения и семени, полученным из такого растения. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к трансформированному растению сои с семенем, в состав масла которого входит около 65-80% олеиновой кислоты, около 2-3,5% насыщенных жирных кислот и около 16,5-33% полиненасыщенных жирных кислот. Настоящее изобретение относится также к кормовому продукту, частям растения и семени, полученным из такого растения.

Настоящее изобретение относится к семени сои, в состав масла которого входит 55-80 мас.% олеиновой кислоты, 10-40 мас.% линолевой кислоты, 6 мас.% или меньше линоленовой кислоты и 2-8 мас.% насыщенных жирных кислот, а также относится к семени сои, в состав масла которого входит 65-80 мас.% олеиновой кислоты, 10-30 мас.% линолевой кислоты, 6 мас.% или меньше линоленовой кислоты и 2-8 мас.% насыщенных жирных кислот. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к семени сои, в состав масла которого входит около 65-80% олеиновой кислоты, около 3-8% насыщенных жирных кислот и около 12-32% полиненасыщенных жирных кислот. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к семени сои, в состав масла которого входит около 65-80% олеиновой кислоты, около 2-3,5% насыщенных жирных кислот и около 16,5-33% полиненасыщенных жирных кислот.

Настоящее изобретение относится также к продуктам сои, в состав масла которых входит 69-73 мас.% олеиновой кислоты, 21-24 мас.% линолевой кислоты, 0,5-3 мас.% линолевой кислоты и 2-3 мас.% насыщенных жирных кислот.

Неочищенное соевое масло по настоящему изобретению имеет состав, включающий 55-80 мас.% олеиновой кислоты, 10-40 мас.% линолевой кислоты, 6 мас.% или меньше линоленовой кислоты и 2-8 мас.% насыщенных жирных кислот. Другое неочищенное соевое масло по настоящему изобретению имеет состав, включающий 65-80 мас.% олеиновой кислоты, 10-30 мас.% линолевой кислоты, 6 мас.% или меньше линоленовой кислоты и 2-8 мас.% насыщенных жирных кислот. В другом варианте осуществления изобретения неочищенное соевое масло по настоящему изобретению имеет состав, включающий около 65-80% олеиновой кислоты, около 3-8% насыщенных жирных кислот и около 12-32% полиненасыщенных жирных кислот. В другом варианте осуществления изобретения неочищенное соевое масло по настоящему изобретению имеет состав, включающий около 65-80% олеиновой кислоты, около 2-3,5% насыщенных жирных кислот и около 16,5-33% полиненасыщенных жирных кислот.

Настоящее изобретение относится также к семени сои, в состав масла которого входит от около 42 мас.% до около 85 мас.% олеиновой кислоты и от около 8 мас.% до около 1,5 мас.% насыщенных жирных кислот. В другом варианте осуществления изобретения семя сои по настоящему изобретению имеет состав масла, включающий от около 42 мас.% до около 85 мас.% олеиновой кислоты, от около 8 мас.% до около 1,5 мас.% насыщенных жирных кислот, менее 35 мас.% линоленовой кислоты, при этом объединенное количество олеиновой кислоты и линоленовой кислоты составляет от около 65 мас.% до около 90 мас.% от общего состава масла; и указанное семя содержит в клетке-хозяине молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты с последовательностью ДНК, включающей фрагмент интрона FAD2-1 длиной от около 50 до около 400 последовательных нуклеотидов, 3'-UTR FATB и 5'-UTR FATB, гетерологичную бета-кетоацил-АСР-синтазу IV и гетерологичную дельта-9-десатуразу.

Семя сои по настоящему изобретению может иметь состав масла, включающий от около 50 мас.% до около 80 мас.% олеиновой кислоты, от около 8 мас.% до около 1,5 мас.% насыщенных жирных кислот, от около 2 мас.% до около 45 мас.% линолевой кислоты, от около 4 мас.% до около 14 мас.% линоленовой кислоты, при этом объединенное количество олеиновой кислоты и линоленовой кислоты составляет от около 65 мас.% до около 90 мас.% от общего состава масла, и указанное семя содержит молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты с последовательностью ДНК, включающей фрагмент интрона FАD2-1 длиной от около 50 до около 400 последовательных нуклеотидов, кодирующую область СТР FATB и 42 последовательных нуклеотида 5'-UTR FATB. В другом варианте осуществления изобретения семя сои может содержать молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты с последовательностью ДНК, подавляющей эндогенную экспрессию FAD2 и FATB, при этом указанное семя имеет состав масла, включающий 46-75 мас.% олеиновой кислоты, 1,5-8,5 мас.% насыщенных жирных кислот, 2,5-38 мас.% линолевой кислоты и 4,5-17,5 мас.% линоленовой кислоты.

Настоящее изобретение относится также к способу уменьшения величины подавления гена FAD2 по сравнению с величиной подавления гена FAD2, достигаемой в результате экспрессии конструкции дцРНКи, содержащей рекомбинантную последовательность FAD2, включающую весь интрон FAD2 или всю UTR FАD2, путем: i) экспрессии рекомбинантной последовательности FAD2 в растительной клетке, при этом рекомбинантная последовательность FAD2, выделяемая из эндогенного гена FAD2 в растительной клетке, содержит фрагмент интрона FAD2 или фрагмент UTR FAD2, и ii) подавления эндогенного гена FAD2 рекомбинантной последовательностью FAD2, при этом величина подавления гена FAD2 меньше величины экспрессии гена, достигаемой в результате экспрессии конструкции дцРНКи, содержащей рекомбинантную последовательность FAD2, включающую весь интрон FAD2 или всю UTR FAD2.

Настоящее изобретение относится также к способам изменения состава масла в растительной клетке путем: трансформации растительной клетки рекомбинантной последовательностью FAD2, выделенной из части эндогенного гена FAD2, которая включает фрагмент интрона FAD2 или фрагмент UTR FAD2, и выращивания растительной клетки в условиях инициации транскрипции рекомбинантной последовательности FAD2, в результате чего состав масла изменяется по сравнению с растительной клеткой, имеющей подобную генетическую среду, но не содержащей рекомбинантную последовательность FAD2. Другой вариант осуществления изобретения относится к способу повышения содержания олеиновой кислоты и уменьшения содержания насыщенных жирных кислот в семени растения путем: i) укорачивания длины первой рекомбинантной последовательности FAD2 по крайней мере до частичного уменьшения величины подавления гена FAD2 в растении, трансформированном первой рекомбинантной последовательностью FAD2, по сравнению с величиной подавления гена FAD2 в растительной клетке, имеющей подобную генетическую среду и вторую рекомбинантную последовательность FAD2, которая состоит из более эндогенной последовательности FAD2, чем первая рекомбинантная последовательность FAD2; ii) экспрессии рекомбинантной последовательности FATB, способной по крайней мере частично уменьшать экспрессию гена FATB в растительной клетке по сравнению с подавлением FATB в растительной клетке, имеющей подобную генетическую среду, но не содержащей рекомбинантную последовательность FATB; iii) выращивания растения с молекулой рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей первую рекомбинантную последовательность FAD2 и рекомбинантную последовательность FATB, и iv) культивирования растения, образующего семя с меньшим содержанием насыщенных жирных кислот по сравнению с семенем растения, имеющего подобную генетическую среду, но не содержащего первую рекомбинантную последовательность FAD2 и рекомбинантную последовательность FATB.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения трансформированного растения, семя которого характеризуется меньшим содержанием насыщенных жирных кислот, путем: трансформации растительной клетки молекулой рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность рекомбинантной ДНК, подавляющей эндогенную экспрессию FAD2 и FATB, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты рекомбинантного гена FAD2 и рекомбинантного гена FATB, при этом последовательность FAD2 содержит не всю последовательность интрона FAD2; и выращивания трансформированного растения, образующего семя с пониженным содержанием насыщенных жирных кислот, по сравнению с семенем растения, имеющего подобную генетическую среду, но не содержащего последовательность рекомбинантной ДНК.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу модуляции состава жирных кислот в масле из семян масличной культуры умеренного пояса путем выделения генетического элемента длиной, равной по крайней мере 40 нуклеотидам, способного подавлять экспрессию эндогенного гена в пути синтеза жирных кислот; создания нескольких укороченных фрагментов генетического элемента; введения всех укороченных фрагментов в растительную клетку масличной культуры умеренного пояса с целью создания трансгенного растения и отбора трансгенного растения, содержащего укороченный фрагмент определенной длины и последовательность, обеспечивающую требуемое изменение в составе жирных кислот масла из семян.

Настоящее изобретение относится также к семени сои, состав масла которого характеризуется значительно меньшим содержанием насыщенных жирных кислот и умеренно повышенным содержанием олеиновой кислоты и которое содержит последовательность ДНК, подавляющую эндогенную экспрессию FAD2 в растительной клетке, при этом последовательность ДНК имеет рекомбинантную последовательность FAD2, включающую фрагмент интрона FAD2. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность интрона FAD2-1A длиной от около 60 до около 320 последовательных нуклеотидов. Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения относится также к семени сои, содержащему первую последовательность рекомбинантной ДНК, которая подавляет экспрессию эндогенного гена FAD2-1 сои, включающего интрон FAD2-1 сои, и вторую последовательность рекомбинантной ДНК, которая экспрессирует повышенные уровни гена, выбираемого из группы, включающей ген KAS I, дельта-9-десатуразы, KAS IV и их комбинации.

Настоящее изобретение относится также к растительной клетке семени сои, характеризующегося составом жирных кислот масла из семян, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание насыщенных жирных кислот составляет менее 8 мас.% от общего содержания жирных кислот. Настоящее изобретение относится также к растительной клетке семени сои, характеризующегося составом масла, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание линоленовой кислоты составляет менее примерно 3 мас.% от общего содержания жирных кислот.

Настоящее изобретение относится также к молекуле нуклеиновой кичслоты с последовательностью интрона FAD2-1A длиной от около 60 до около 320 последовательных нуклеотидов. В объем настоящего изобретения входит также конструкция рекомбинантной ДНК, включающая фрагмент интрона FAD2-1 сои длиной от около 20 до около 420 последовательных нуклеотидов и фрагмент гена FATB сои длиной от около 40 до около 450 последовательных нуклеотидов. Другой вариант осуществления изобретения относится к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей первую последовательность ДНК, подавляющую эндогенную экспрессию FAD2-1 и FATB сои, которая включает фрагмент интрона FAD2-1 длиной от около 20 до около 420 последовательных нуклеотидов, 3'-UTR FATB сои, 5'-UTR FATB сои или кодирующую область СТР, и вторую последовательность рекомбинантной ДНК, которая повышает экспрессию по крайней мере одного из генов, выбираемых из группы, включающей бета-кетоацил-АСР-синтазу IV и дельта-9-десатуразу.

Настоящее изобретение относится также к несмешанному соевому маслу, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание насыщенных жирных кислот составляет от около 1,5 мас.% до около 8 мас.% от общего содержания жирных кислот; к несмешанному соевому маслу, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание насыщенных жирных кислот составляет около 8 мас.% или меньше от общего содержания жирных кислот; к несмешанному соевому маслу, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание линоленовой кислоты составляет менее 3 мас.% от общего содержания жирных кислот; и к несмешанному соевому маслу, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот, содержание насыщенных жирных кислот составляет около 8 мас.% или меньше от общего содержания жирных кислот и содержание линоленовой кислоты составляет около 1,5 мас.% или меньше от общего содержания жирных кислот.

Настоящее изобретение относится также к соевой муке, получаемой из семени сои, характеризующегося составом жирных кислот в масле из семян, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание насыщенных жирных кислот составляет менее 8 мас.% от общего содержания жирных кислот. В объем настоящего изобретения входит также соевая мука, получаемая из семени сои, характеризующегося составом жирных кислот в масле из семян, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание линоленовой кислоты составляет менее примерно 3 мас.% от общего содержания жирных кислот.

Настоящее изобретение относится также к способу уменьшения величины подавления гена FAD2 по сравнению с величиной подавления гена FAD2, достигаемой в результате экспрессии конструкции дцРНКи, содержащей гетерологичную последовательность FAD2, включающую весь интрон FAD2 или всю UTR FAD2, путем: i) экспрессии гетерологичной последовательности FAD2 в растительной клетке, при этом гетерологичная последовательность FAD2, выделяемая из эндогенного гена FAD2 растительной клетки, состоит из фрагмента интрона FAD2 или фрагмента UTR FAD2, и ii) подавления эндогенного гена FAD2 гетерологичной последовательностью FAD2, при этом величина подавления гена FAD2 меньше величины экспрессии гена, достигаемой в результате экспрессии гетерологичной последовательности FAD2, включающей весь интрон FAD2 или всю UTR FAD2.

Настоящее изобретение относится также к способу изменения состава масла растительной клетки путем трансформации растительной клетки гетерологичной последовательностью FAD2, выделенной из части эндогенного гена FAD2, которая включает фрагмент интрона FAD2 или фрагмент UTR FAD2, и выращивания растительной клетки в условиях инициации транскрипции гетерологичной последовательности FAD2, в результате чего происходит изменение состава масла по сравнению с растительной клеткой, имеющей подобную генетическую среду, но не содержащей гетерологичную последовательность FAD2.

Настоящее изобретение относится также к способу увеличения содержания олеиновой кислоты и уменьшения содержания насыщенных жирных кислот в семени растения, который включает: i) укорачивание длины первой гетерологичной последовательности FAD2 по крайней мере до частичного уменьшения величины подавления гена FAD2 в растении, трансформированном первой гетерологичной последовательностью FAD2, по сравнению с величиной подавления гена FAD2 в растительной клетке, имеющей подобную генетическую среду и вторую гетерологичную последовательность FAD2, которая состоит из более эндогенной последовательности FAD2, чем первая гетерологичная последовательность FAD2, ii) экспрессию гетерологичной последовательности FATB, способной по крайней мере частично уменьшать экспрессию гена FATB в растительной клетке по сравнению с подавлением FATB в растительной клетке, имеющей подобную генетическую среду, но не содержащей гетерологичную последовательность FATB, iii) выращивание растения, включающего геном с первой гетерологичной последовательностью FAD2 и гетерологичной последовательностью FATB, и iv) культивирование растения, образующего семя с пониженным содержанием насыщенных жирных кислот по сравнению с семенем растения, имеющего подобную генетическую среду, но не содержащего первую гетерологичную последовательность FAD2 и гетерологичную последовательность FATB.

Настоящее изобретение относится также к способу модуляции состава жирных кислот в масле из семян масличной культуры умеренного пояса, выделения фрагмента генетического элемента длиной, равной по крайней мере 40 нуклеотидам, способного подавлять экспрессию эндогенного гена в пути синтеза жирных кислот; введения указанного генетического элемента в растительную клетку масличной культуры умеренного пояса; создания трансгенного растения и отбора семени трансгенного растения, содержащего указанный генетический элемент, модулирующий состав жирных кислот в масле из семян.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке семени сои, характеризующегося составом жирных кислот в масле из семян, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот и содержание насыщенных жирных кислот составляет менее 8 мас.% от общего содержания жирных кислот.

Настоящее изобретение относится также к молекуле гетерологичной нуклеиновой кислоты, включающей фрагмент интрона FAD2-1 сои длиной от около 20 до около 420 последовательных нуклеотидов и фрагмент гена FATB сои длиной от около 40 до около 450 последовательных нуклеотидов. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к молекуле гетерологичной нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей фрагмент интрона FAD2-1 сои длиной от около 20 до около 420 нуклеотидов, фрагмент гена FATB сои длиной от около 40 до около 450 нуклеотидов и последовательность нуклеиновой кислоты, которая повышает экспрессию бета-кетоацил-АСР-синтазы IV или дельта-9-десатуразы либо обеих вместе.

Настоящее изобретение относится также к способу уменьшения содержания линоленовой кислоты в семени сои путем: i) введения в клетку сои молекулы гетерологичной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по крайней мере из двух членов семейства генов FАD3; ii) экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты из гена FAD2, способной по крайней мере частично уменьшать экспрессию эндогенного гена FAD3 в растительной клетке; iii) выращивания растительной клетки, включающей геном с последовательностью нуклеиновой кислоты по крайней мере из двух членов семейства генов FAD3; и iv) культивирования указанной растительной клетки с уменьшенным содержанием линоленовой кислоты по сравнению с растительной клеткой, имеющей подобную генетическую среду, но не содержащей по крайней мере два члена семейства генов FAD3. Настоящее изобретение относится также к конструкции рекомбинантной ДНК с фрагментами ДНК по крайней мере из двух членов семейства генов FAD3.

Настоящее изобретение относится также к несмешанному соевому маслу, характеризующемуся составом жирных кислот, в котором содержание олеиновой кислоты составляет от около 42 мас.% до около 85 мас.% от общего содержания жирных кислот, содержание насыщенных жирных кислот составляет около 8 мас.% или меньше от общего содержания жирных кислот и содержание линоленовой кислоты составляет около 1,5 мас.% или меньше от общего содержания жирных кислот.

Краткое описание фигур

На фиг.1-4 изображены типичные конфигурации молекулы нуклеиновой кислоты.

На фиг.5(а)-(d) и 6(а)-(с) изображены иллюстративные конфигурации первой совокупности последовательностей ДНК.

На фиг.7-20 изображены молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

На фиг.21 изображена конструкция pMON68537.

На фиг.22 изображена конструкция pMON68539.

Подробное описание изобретения

Описание последовательностей нуклеиновых кислот

SEQ ID NO:1 является последовательностью нуклеиновой кислоты интрона 1 FAD2-1A.

SEQ ID NO:2 является последовательностью нуклеиновой кислоты интрона 1 FAD2-1B.

SEQ ID NO:3 является последовательностью нуклеиновой кислоты промотора FAD2-1B.

SEQ ID NO:4 является последовательностью нуклеиновой кислоты геномного клона FAD2-1A.

SEQ ID NO:5 и 6 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно 3'-UTR и 5'-UTR FAD2-1A.

SEQ ID NO:7-13 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно интронов 1, 2, 3А, 4, 5, 3В и 3С FAD3-1A.

SEQ ID NO:14 является последовательностью нуклеиновой кислоты интрона 4 FAD3-1C.

SEQ ID NO:15 является последовательностью нуклеиновой кислоты неполного геномного клона FAD3-1A.

SEQ ID NO:16 и 17 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно 3'-UTR и 5'-UTR FAD3-1A.

SEQ ID NO:18 является последовательностью нуклеиновой кислоты неполного геномного клона FAD3-1B.

SEQ ID NO:19-25 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно интронов 1, 2, 3А, 3В, 3С, 4 и 5 FAD3-1B.

SEQ ID NO:26 и 27 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно 3'-UTR и 5'-UTR FAD3-1B.

SEQ ID NO:28 является последовательностью нуклеиновой кислоты геномного клона FATB-1.

SEQ ID NO:29-35 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно интронов I, II, III, IV, V, VI и VII FATB-1.

SEQ ID NO:36 и 37 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно 3'-UTR и 5'-UTR FATB-1.

SEQ ID NO:38 является последовательностью нуклеиновой кислоты гена KAS I Cuphea pulcherrima.

SEQ ID NO:39 является последовательностью нуклеиновой кислоты гена KAS IV Cuphea pulcherrima.

SEQ ID NO:40 и 41 являются последовательностями нуклеиновой кислоты генов дельта-9-десатуразы соответственно Ricinus communis и Simmondsia chinensis.

SEQ ID NO:42 является последовательностью нуклеиновой кислоты кДНК FATB-2.

SEQ ID NO:43 является последовательностью нуклеиновой кислоты геномного клона FATB-2.

SEQ ID NO:44-47 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно интронов I, II, III и IV FATB-2.

SEQ ID NO:48-60 являются последовательностями нуклеиновой кислоты праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР).

SEQ ID NO:61 и 62 являются последовательностями нуклеиновой кислоты соответственно 3'-UTR и 5'-UTR FAD3-1 сои.

Определения терминов

“АСР” означает ацилпереносящий белок. “Измененный состав масла из семян” означает состав масла из семян трансгенного или трансформированного растения по настоящему изобретению с измененными или модифицированными уровнями жирных кисло