Ингибиторы ангиопоэтинподобного белка 4, их комбинации и применение

Ингибиторы ангиопоэтинподобного белка 4, их комбинации и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка притязает на приоритет согласно статье 119(e) на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным №60/589782, поданной 20 июля 2004, описание которой включено в данную заявку в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в общем относится к лечению заболеваний и патологических состояний человека, таких как злокачественная опухоль. Изобретение относится к ингибиторам ангиопоэтинподобного белка 4 (ANGPTL4) и комбинациям ингибиторов ANGPTL4 с другими терапевтическими средствами и к способам применения таких композиций для диагностики и лечения заболеваний или патологических состояний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Злокачественная опухоль является лидирующей причиной смерти в Соединенных Штатах Америки. Для лечения злокачественной опухоли использовали различные типы терапии. Например, используют хирургические способы удаления злокачественной или отмершей ткани. В качестве терапии злокачественной опухоли использовали лучевую терапию, которая действует посредством уменьшения злокачественных опухолей, и химиотерапию, которая убивает быстро делящиеся клетки.

В 1971 году Folkman предположил, что антиангиогенез может быть эффективной противоопухолевой методикой. Folkman, N. Engl. J. Med. 285, 1182-1186 (1971). Ангиогенез представляет собой развитие новой сосудистой сети из уже существующих кровеносных сосудов и/или циркулирующих эндотелиальных стволовых клеток (см., например, Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12): 1359-1364 (1999)). Ангиогенез представляет собой каскад процессов, состоящий из 1) разрушения внеклеточного матрикса в локальном месте после высвобождения протеазы, 2) пролиферации эндотелиальных клеток капилляров и 3) миграции капиллярных трубочек по направлению к ангиогенному стимулу. Ferrara et al. Endocrine Rev. 13: 18-32 (1992).

Рост новых кровеносных сосудов во время нормальных физиологических процессов является необходимым условием эмбрионального и постнатального развития, например, эмбриогенеза, заживления ран и менструации. См., например, Folkman and Klagsbrun Science 235: 442-447 (1987). Такая пролиферация новых кровеносных сосудов из предсуществующих капилляров, кроме того, играет ключевую роль в патологическом развитии различных заболеваний, включая, без ограничения, например, злокачественные опухоли, пролиферативные ретинопатии, возрастную дегенерацию желтого пятна, псориаз, воспаление, диабет и ревматоидный артрит (RA). См., например, Ferrara, Recent Prog. Horm. Res. 55: 15-35 (2000), discussion 35-6.

Принимая во внимание исключительную важность ангиогенеза с точки зрения физиологии и патологии, много работ было посвящено выяснению факторов, способных регулировать данный процесс. Высказывалось предположение, что процесс ангиогенеза регулируется посредством баланса между про- и антиангиогенными молекулами, и его срыв происходит при различных заболеваниях, в частности при злокачественной опухоли. См., например, Carmeliet and Jain, Nature 407: 249-257 (2000).

Например, ангиогенез зависит от секретируемых факторов, подобных фактору роста эндотелиальных клеток сосудов A (VEGF, также известному как фактор проницаемости сосудов (VPF)) и фактору роста фибробластов (FGF). См., например, Ferrara and Davis-Smyth Endocrine Rev. 18: 4-25 (1997); и Ferrara J. Mol. Med. 77: 527-543 (1999). В дополнение к тому, что он является ангиогенным фактором в ангиогенезе и васкулогенезе, VEGF в качестве плейотропного фактора роста оказывает множество биологических эффектов в случае других физиологических процессов, таких как обеспечение жизнеспособности эндотелиальных клеток, проницаемость и вазодилатация сосудов, хемотаксис моноцитов и приток кальция. Ferrara and Davis-Smyth (1997), выше. Кроме того, сообщалось об исследованиях митогенного действия VEGF на некоторые типы неэндотелиальных клеток, таких как пигментированные эпителиальные клетки сетчатки глаза, клетки протока поджелудочной железы и шванновские клетки. См., например, Guerrin et al. J. Cell Physiol. 164: 385-394 (1995); Oberg-Welsh et al. Mol. Cell. Endocrinol. 126: 125-132 (1997); и Sondell et al. J. Neurosci. 19: 5731-5740 (1999).

VEGF относится к семейству генов, которое включает в себя плацентарный фактор роста (PlGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Указанные лиганды связываются с тирозинкиназными рецепторами, экспрессированными на эндотелиальных клетках. Например, семейство тирозинкиназных рецепторов VEGF включает Flt1 (VEGF-R1) (который связывает лиганды VEGF, VEGF-B и PlGF), Flk1/KDR (VEGF-R2) (который связывает VEGF, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E) и Flt4 (VEGF-R3) (который связывает VEGF-C и VEGF-D). См., например, Ferrara et al., Nature Medicine 9 (6): 669-676 (2003); и Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 114 (5): 853-65 (2001).

Ангиопоэтины представляют собой другую группу факторов роста эндотелия сосудов. См., например, Davis et al., Cell, 87: 1161-1169 (1996); Suri et al., Cell, 87: 1171-1180 (1996); Maisonpierre et al. Science 277: 55-60 (1997) и Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1904-1909 (1999). По-видимому, ангиопоэтины работают комплементарным и координированным с VEGF образом, при этом VEGF действует в процессе развития сосудов, тогда как ангиопоэтины, наиболее вероятно, действуют посредством модулирования ремоделирования, созревания и стабилизации сосудистой сети. См., например, Holash et al., Oncogene 18: 5356-5362 (1999). Ангиопоэтин 1, ангиопоэтин 2, ангиопоэтин 3 и ангиопоэтин 4 связываются с тирозинкиназными рецепторами Tie2 (также известными как Tek), которые являются рецепторами, встречающимися на эндотелиальных клетках. См., например, Ward & Dumont, Seminars in Cell & Developmental Biology, 13: 19-27 (2002). Также существует сиротский рецептор Tie1.

Ангиогенез зависит не только от факторов роста, но также подвержен влиянию молекул клеточной адгезии (CAM), включая интегрины, связывающиеся со своими лигандами, присутствующими во внеклеточном матриксе. См., например, Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12): 1359-1364 (1999) и Carmeliet, Nature Medicine, 6 (3): 389-395 (2000). Интегрины способствуют клеточной адгезии и миграции по белкам внеклеточного матрикса, обнаруженным в межклеточных пространствах и базальных мембранах. Интегриновое семейство белков клеточной адгезии состоит, по меньшей мере, из 18 α- и 8 β-субъединиц, которые экспрессируются, по меньшей мере, в 22 комбинациях гетеродимеров αβ. См., например, Byzova et al., Mol. Cell., 6 (4): 851-860 (2000) и Hood and Cheresh, Nature Reviews, 2: 91-99 (2002). Из них, по меньшей мере, шесть комбинаций (α_Vβ₃, α_Vβ₅, α₅β₁, α₂β₁, α_Vβ₁ и α₁β₁) вовлечены в ангиогенез (см., например, Hynes and Bader, Thromb. Haemost., 78 (1): 83-87 (1997) и Hynes et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 32 (5): 501-510 (1999)). Инактивация различных генов, кодирующих специфичные для адгезии рецепторы, или введение блокирующих антител в животных моделях оказывает сильное воздействие на ангиогенный ответ эндотелиальных клеток. См., например, Elicieri and Cheresh, Mol. Med., 4: 741-750 (1998).

Указанные молекулы были сделаны мишенями для терапии злокачественных опухолей. Например, выяснение того, что VEGF является первичным регулятором ангиогенеза при патологических состояниях, привело к многочисленным попыткам блокировать активности VEGF. Ингибирующие антитело против рецептора VEGF растворимые конструкции рецепторов, антисмысловые подходы, аптамеры РНК против VEGF и низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназного рецептора (RTK) VEGF были предложены для применения с целью препятствовать передаче сигнала VEGF. См., например, Siemeister et al. Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248 (1998). Было показано, что нейтрализующие антитела против VEGF подавляют рост различных линий опухолевых клеток человека у мышей nude (Kim et al. Nature 362: 841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgström et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996) и Melnyk et al. Cancer Res. 56: 921-924 (1996)), а также ингибируют внутриглазной ангиогенез в моделях ишемических заболеваний сетчатки глаза (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114: 66-71 (1996)). Действительно, гуманизированное анти-VEGF-антитело, бевацизумаб (Avastin®, Genentech), было одобрено FDA США в качестве терапии первой линии метастатического рака прямой и ободочной кишки. См., например, Ferrara et al., Nature Reviews Drug Discovery, 3: 391-400 (2004).

Однако современные способы лечения злокачественных опухолей не всегда являются оптимальными. Часто один тип терапии не может полностью подавить патологическое состояние. Например, хирургические способы часто не могут исключить весь злокачественный рост. Другие способы лечения злокачественных опухолей, такие как химиотерапия, имеют многочисленные побочные эффекты и/или терапия становится неэффективной, например, в результате развития резистентности злокачественной опухоли к лекарственному средству или способу лечения. Ингибирование VEGF или рецептора VEGR или системы рецепторов Tie2 иногда не полностью подавляет рост опухоли. См., например, Gerber et al., Cancer Research, 60: 6253-6258 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews: Drug Discovery, 3: 391-400 (2004); Millauer et al., Nature 367, 576-579 (1994); Kim et al., Nature 362: 841-844 (1993); Millauer et al., Cancer Res. 56: 1615-1620 (1996); Goldman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8795-8800 (1998); Asano et al., Cancer Research, 55: 5296-5301 (1995); Warren et al., J. Clin. Invest., 95: 1789-1797 (1995); Pong et al., Cancer Res. 59: 99-106 (1999); Wedge et al., Cancer Res. 60: 970-975 (2000); Wood et al. Cancer Res. 60: 2178-2189 (2000); Siemeister et al., Cancer Res. 59: 3185-3191 (1999); Lin et al., J. Clin. Invest. 103: 159-165 (1999); Lin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8829-8834 (1998); and Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185-3191 (1999).

Таким образом, существует крайняя необходимость в новых и более эффективных способах терапии для борьбы со злокачественными опухолями. Изобретение относится к указанным и другим потребностям, которые будут понятны при рассмотрении следующего описания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к ингибиторам ангиопоэтинподобного белка 4 (ANGPTL4) и способам применения таких ингибиторов для лечения заболеваний и патологических состояний, например для блокирования или уменьшения роста опухоли или роста злокачественных клеток, для блокирования или уменьшения рецидивирующего опухолевого роста и т.д. Изобретение относится к комбинациям ингибиторов ANGPTL4 и противоопухолевых средств и к способам применения таких комбинаций для ингибирования опухолевого роста. Изобретение также относится к комбинациям ингибиторов ANGPTL4 и ингибиторов ангиогенеза и к способам применения таких комбинаций для ингибирования злокачественного роста и/или расстройств, в которые вовлечен ангиогенез, например неопластических (например, опухолевого роста) и не неопластических расстройств.

Предлагаются модуляторы ANGPTL4, например антагонисты или агонисты ANGPTL4. Антагонистами ANGPTL4 согласно изобретению являются молекулы, которые ингибируют или уменьшают активность ANGPTL4. Ингибитор ANGPTL4 может включать вещество с низкой молекулярной массой, полинуклеотид, антисмысловые молекулы, аптамеры РНК, рибозимы против ANGPTL4 или полипептидов его рецептора, полипептид, антагонистические варианты ANGPTL4, изолированный белок, рекомбинантный белок, антитело или его конъюгаты или слитые белки, которые ингибируют активность ANGPTL4 прямо или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист ANGPTL4 включает антитело, которое связывает ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическим анти-ANGPTL4-антителом является антитело, которое ингибирует или уменьшает активность ANGPTL4 в результате связывания со специфичной подпоследовательностью или областью белка ANGPTL4, например N-концом, N-концевым биспиральным доменом, C-концом, C-концевым фибриногенподобным доменом или аминокислотной подпоследовательностью ANGPTL4 (1-183), ANGPTL4 (23-183), ANGPTL4 (от 1 до примерно 162), ANGPTL4 (примерно 162-406), ANGPTL4 (23-406) или ANGPTL4 (184-406) человеческого ANGPTL4 и/или аминокислотной подпоследовательностью mANGPTL4 (1-183), mANGPTL4 (23-183), mANGPTL4 (от 1 до примерно 165), mANGPTL4 (от 23 до примерно 165), mANGPTL4 (23-410) или mANGPTL4 (184-410) мышиного ANGPTL4. Другие подпоследовательности также включают без ограничения, например, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 и 160-406 hANGPTL4 и, например, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 и 160-410 mANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист ANGPTL4 включает анти-α_vβ₅-антитело, например антагонистическое анти-α_vβ₅-антитело. В некоторых вариантах антитела согласно изобретению являются гуманизированными антителами. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистом ANGPTL4 является молекула миРНК. В одном варианте молекулой миРНК является молекула ANGPTL4-миРНК, при этом мишенью молекулы является последовательность ДНК (например, GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA) (SEQ ID NO: 3) нуклеиновой кислоты, кодирующей ANGPTL4.

Предлагаются способы блокирования или уменьшения опухолевого роста или роста злокачественной клетки. В некоторых вариантах способы заключаются во введении в опухоль или злокачественную клетку эффективного количества антагониста ангиопоэтинподобного белка 4 (ANGPTL4). В другом варианте антагонистом ANGPTL4 является антагонистическое анти-α_vβ₅-антитело. Эффективное количество блокирует или уменьшает опухолевый рост или рост злокачественной клетки. Также предлагаются способы ингибирования миграции опухолевых клеток. Например, способ заключается во введении эффективного количества антагониста ANGPTL4 в опухолевые клетки, таким образом блокируя их миграцию. В одном варианте осуществления изобретения введение антагониста ANGPTL4 ингибирует метастазы.

Дополнительные терапевтические средства, например одно или несколько противоопухолевых средств, множество антител к одним и тем же или разным антигенам, одно или несколько средств или ингибиторов против ангиогенеза, препаратов против боли и т.д., можно комбинировать и/или вводить вместе с антагонистом ANGPTL4. Также можно осуществлять или проводить дополнительные терапевтические процедуры, например хирургические процедуры, облучение и т.д. по отношению к опухоли и/или злокачественным клеткам, в способах или вместе с композициями согласно изобретению. Изобретение также относится к комбинированным композициям, например композиции, которая содержит противоопухолевое средство (например, средство против ангиогенеза и т.д.), антагонист ANGPTL4 и носитель (например, фармацевтически приемлемый носитель).

Противоопухолевые средства включают без ограничения, например, противоопухолевые средства, известные в данной области, и средства, описанные в данной публикации. В некоторых вариантах противоопухолевое средство включает в себя одно или несколько средств против ангиогенеза, например антагонист или ингибитор VEGF и т.д. В одном варианте антагонист VEGF содержит анти-VEGF-антитело или его активный фрагмент (например, гуманизированное A4.6.1, Avastin® и т.д.). В некоторых вариантах противоопухолевое средство содержит одно или несколько химиотерапевтических средств.

Предлагаются комбинированные способы блокирования или уменьшения опухолевого роста или роста злокачественной клетки. В некоторых вариантах способы включают в себя введение в опухоль или злокачественную клетку эффективного количества противоопухолевого средства и введение в опухоль или злокачественную клетку эффективного количества антагониста ANGPTL4. Альтернативно или дополнительно можно вводить комбинированную композицию, содержащую эффективное количество противоопухолевого средства (например, средства против ангиогенеза и т.д.) и эффективное количество антагониста ANGPTL4. Объединенные эффективные количества блокируют или уменьшают опухолевый рост или рост злокачественной клетки.

Также предлагаются способы блокирования или уменьшения рецидивирующего опухолевого роста или рецидивирующего роста злокачественных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъекта подвергали или одновременно подвергают терапии по поводу злокачественной опухоли, по меньшей мере, одним противоопухолевым средством и субъекту вводят эффективное количество антагониста ANGPTL4. Введение эффективного количества антагониста ANGPTL4 блокирует или уменьшает рецидивирующий опухолевый рост или рецидивирующий рост злокачественных клеток. В некоторых вариантах субъекта подвергали или одновременно подвергают терапии антагонистом ANGPTL4 и субъекту вводят эффективное количество противоопухолевого средства (например, средства против ангиогенеза), при этом введение эффективного количества противоопухолевого средства блокирует или уменьшает рецидивирующий опухолевый рост или рецидивирующий рост злокачественных клеток.

Обычно опухоль или злокачественная клетка находится в организме субъекта. В некоторых вариантах субъекта подвергали, одновременно подвергают или будут подвергать терапии по поводу злокачественной опухоли, по меньшей мере, одним противоопухолевым средством. Обычно субъектом является млекопитающее (например, человек). В некоторых вариантах средства согласно изобретению вводят субъекту. Стадии введения или способа могут быть осуществлены в любом порядке. В одном варианте их осуществляют последовательно. В другом варианте их осуществляют одновременно. Альтернативно или дополнительно стадии могут быть осуществлены в виде комбинации последовательных и одновременных стадий в любом порядке.

Также предлагаются наборы модуляторов ANGPTL4. В некоторых вариантах набор содержит антагонист ANGPTL4, фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель и упаковку. В одном варианте набор содержит первое количество противоопухолевого средства (например, средства против ангиогенеза и т.д.), второе количество антагониста ANGPTL4 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель и упаковку. В другом варианте набор содержит определенное количество противоопухолевого средства (например, средства против ангиогенеза и т.д.) и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель в первой единичной дозированной форме; определенное количество антагониста ANGPTL4 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель во второй единичной дозированной форме и упаковку. Также могут быть включены инструкции по их применению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 иллюстрирует последовательность нуклеиновой кислоты ANGPTL4 человека (SEQ ID №1).

Фиг.2 иллюстрирует аминокислотную последовательность ANGPTL4 человека (SEQ ID №2).

На фиг.3 панель A иллюстрирует очищенный рекомбинантный мышиный ANGPTL4 (23-410) после разделения с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) (4-20%) в присутствии (10 мМ) или в отсутствие дитиотреитола (DTT). На фиг.3 панель B иллюстрирует hANGPTL4 дикого типа (дорожка 1) и вариант hANGPTL4 (дорожка 2) после разделения в SDS-геле и регистрации с использованием Вестерн-блоттинга, при этом вариант hANGPTL4 имеет замену R162G и R164E.

На фиг.4 панели A, B и C схематично показывают, что ANGPTL4 стимулирует пролиферацию опухолевых клеток A673 (панель A и B) и опухолевых клеток U87MG (панель B) при трансдукции опухолевых клеток конструкцией, экспрессирующей ANGPTL4, и под действием кондиционированных сред от клеток COS (C), трансдуцированных конструкцией, экспрессирующей ANGPTL4 (2) (панель C). На панели B опухолевые клетки трансдуцированы конструкцией либо (1), которая является контрольной конструкцией, экспрессирующей AdLacZ, либо (2), которая является конструкцией, экспрессирующей Ad-ANGPTL4, либо (3), которая является конструкцией Ad-миРНК ANGPTL4. На панели C пролиферация опухолевых клеток A673 осуществляется под влиянием кондиционированных сред от клеток Hepa (A), HMVEC (B) или COS (C), трансдуцированных либо (1) конструкцией, экспрессирующей LacZ, либо (2) конструкцией, экспрессирующей ANGPTL4, либо (3) конструкцией, экспрессирующей ANGPTL3.

Фиг.5 схематично показывает, что mANGPTL4 стимулирует пролиферацию A673 в случае покрытия им чашек для культивирования.

На фиг.6 панели A и B схематично иллюстрируют различные формы (панель A) связывания ANGPTL4 с опухолевыми клетками A673 и связывание в разных условиях (панель B).

На фиг.7 панели A и B схематично иллюстрируют пролиферацию A673 под влиянием сред, содержащих ANGPTL4, при выращивании в течение 7 дней (панель A) или 4 дней (панель B). На панели A (1) означает контрольную конструкцию, экспрессирующую AdLacZ, (2) означает конструкцию, экспрессирующую Ad-hANGPTL4, и (3) означает конструкцию, экспрессирующую AdLacZ и rmANGPTL4. На панели B (1) означает отсутствие добавок, (2) означает контрольный буфер, (3) mANGPTL4 (2,5 мкг/мл), (4) hANGPTL4 (2,5 мкг/мл), (5) hIgG-hANGPTL4 (2,5 мкг/мл) и (6) hIgG-mANGPTL4 (2,5 мкг/мл).

На фиг.8 панели A, B и C схематично иллюстрируют, что ANGPTL4 стимулирует опухолевый рост in vivo (панель A и панель B) и его действие имеет тенденцию уходить от противоопухолевого лечения, например, анти-VEGF-антителом (Avastin® (Genentech, South San Francisco)) в опухолях, в которые вводили конструкции аденовирус-Angptl4 (панель C). Панели A и C иллюстрируют размер опухолей в см³ по дням после имплантации опухоли. Панель B иллюстрирует массу ксенотрансплантированных опухолей A673 через 20 дней после имплантации.

На фиг.9 показано, что ANGPTL4 индуцирует клеточную миграцию опухолевых клеток A673 и 4T-1, где (1) означает отсутствие добавления сыворотки, (2) означает 10% фетальную сыворотку теленка (FCS), (3) означает PDGF-BB и (4) означает ANGPTL4.

На фиг.10, панели A и B, показано, что анти-hANGPTL4-антитела ингибируют рост опухолевых клеток, например, на панели A (клетки HeLa-S3 и Caki) и на панели B (клетки U87MG, 293 и A673), где (1) означает анти-hANGPTL4-антитела, (2) означает контрольное антитело против белка критической для синдрома Дауна области 1 (Dscr) и (3) означает отсутствие добавок, при этом числа под гистограммой показывают концентрацию антител в (мкг/мл).

Фиг.11 иллюстрирует адгезию клеток 293-1953 (α_vβ₅) к планшету, покрытому либо ANGPTL4, либо витронектином в концентрации, указанной снизу в (мкг/мл), где БСА используют в качестве контроля.

На фиг.12 показано, что анти-α_vβ₅-антитела и анти-hANGPTL4-антитела отменяют активность ANGPTL4 в клеточной адгезии, где (1) означает БСА, (2) означает витронектин и (3) означает ANGPTL4.

Фиг.13, панели A, B и C, иллюстрирует связывание ANGPTL4 с интегрином α_vβ₅. Панель A иллюстрирует связывание белка (mANGPTL4, hANGPTL4-N_конец или hANGPTL4-C_конец) с использованием указанного количества с планшетами, покрытыми α_vβ₅. Панель B иллюстрирует ингибирование связывания белка (mANGPTL4, hANGPTL4-N_конец или hANGPTL4-C_конец) с планшетами, покрытыми α_vβ₅, анти-hANGPTL4-антителами. Панель C иллюстрирует связывание ANGPTL4 и α_vβ₅, где (1) означает планшет, покрытый hANGPTL4-C_конец, (2) означает планшет, покрытый hANGPTL4-C_конец и инкубированный с анти-hANGPTL4, (3) означает планшет, покрытый hANGPTL4-C_конец и инкубированный с анти-Dscr, (4) означает планшет, покрытый витронектином, и (5) означает планшет, покрытый БСА перед добавлением α_vβ₅.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Перед подробным описанием изобретения следует понять, что данное изобретение не ограничено конкретными композициями или биологическими системами, которые, конечно, могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном описании, предназначена только для целей описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения. В используемом в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают множественные объекты, если содержание ясно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на "молекулу" необязательно включает комбинацию двух или более таких молекул, и тому подобное. Если не оговорено особо, подразумевается, что все научные и технические термины имеют такое же значение, которое обычно используют в области, к которой они относятся. В целях изобретения ниже определены следующие термины.

Термин "ANGPTL4" или "Angptl4" относится к ангиопоэтинподобному полипептиду или белку 4 вместе с его встречающимися в природе аллельными, секретируемыми и процессированными формами. Например, ANGPTL4 человека является белком из 406 аминокислот, тогда как мышиный ANGPTL4 является белком, состоящим из 410 аминокислот. Термин "ANGPTL4" также используют для указания фрагментов (например, подпоследовательностей, укороченных форм и т.д.) полипептида, содержащих, например, N-концевой фрагмент, биспиральный домен, C-концевой фрагмент, фибриногенподобный домен, аминокислоты 1-183, 23-183, от 1 до примерно 162, от 23 до примерно 162, 23-406, 184-406, примерно 162-406 или 23-184 ангиопоэтинподобного белка 4 человека и аминокислоты 1-183, 23-183, от 1 до примерно 165, от 23 до примерно 165, 23-410 или 184-410 мышиного ангиопоэтинподобного белка 4. Другие фрагменты включают без ограничения, например, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 и 160-406 hANGPTL4 и, например, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 и 160-410 mANGPTL4. Ссылка на любые такие формы ANGPTL4 также может быть указана в заявке, например, в виде "ANGPTL4 (23-406)", "ANGPTL4 (184-406)", "ANGPTL4 (23-183)", "mANGPTL4 (23-410)", "mANGPTL4 (184-410)" и т.д., где m указывает мышиную последовательность. Положения аминокислот для фрагмента нативного ANGPTL4 пронумерованы, как указано в нативной последовательности ANGPTL4. Например, положение аминокислоты 22(Ser) во фрагменте ANGPTL4 также является положением 22(Ser) в нативном ANGPTL4 человека, например, см. фиг.2. Как правило, фрагмент нативного ANGPTL4 обладает биологической активностью.

Термин "модулятор ANGPTL4" относится к молекуле, которая может активировать ANGPTL4 или его экспрессию, например к агонисту, или которая может ингибировать активность ANGPTL4 или его экспрессию, например к антагонисту (или ингибитору). Агонисты ANGPTL4 включают антитела и активные фрагменты. Антагонист ANGPTL4 относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, уменьшать или служить препятствием для активностей ANGPTL4, например пролиферации или роста клеток, миграции, адгезии или модулирования метаболизма, например, липидов, или его экспрессии, включая его связывание с рецептором ANGPTL4, например α_Vβ₅. Антагонисты ANGPTL4 включают, например, анти-ANGPTL4-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, молекулы рецепторов и производные, которые специфично связываются с ANGPTL4, таким образом предотвращая его связывание с одним или несколькими рецепторами, антитела против рецептора ANGPTL4 и антагонисты рецептора ANGPTL4, такие как низкомолекулярные ингибиторы рецептора. Другие антагонисты ANGPTL4 также включают варианты антагонистов ANGPTL4, антисмысловые молекулы (например, ANGPTL4-миРНК), РНК-аптамеры и рибозимы против ANGPTL4 или его рецептора. В некоторых вариантах антагонистическими ANGPTL4-антителами являются антитела, которые ингибируют или уменьшают активность ANGPTL4 посредством связывания со специфичной подпоследовательностью или областью ANGPTL4, например N-концевым фрагментом, биспиральным доменом, C-концевым фрагментом, фибриногенподобным доменом, аминокислотами 1-183, 23-183, от 1 до примерно 162, от 23 до примерно 162, 23-406, 184-406, или 23-184 ангиопоэтинподобного белка 4 человека и аминокислотами 1-183, 23-183, от 1 до примерно 165, от 23 до примерно 165, 23-410 или 184-410 ангиопоэтинподобного белка 4 мыши. Другие фрагменты включают, без ограничения, например, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-406, 60-406, 80-406, 100-406, 120-406, 140-406 и 160-406 hANGPTL4 и, например, 40-183, 60-183, 80-183, 100-183, 120-183, 140-183, 40-410, 60-410, 80-410, 100-410, 120-410, 140-410 и 160-410 mANGPTL4.

Термин "анти-ANGPTL4-антитело" означает антитело, которое связывается с ANGPTL4 с достаточной аффинностью и специфичностью. Анти-ANGPTL4-антитело согласно изобретению можно применять в качестве терапевтического средства для целенаправленного воздействия и вмешательства в заболевания или состояния, в которые вовлечена активность ANGPTL4. В общем анти-ANGPTL4-антитело, как правило, не будет связываться с другими гомологами ANGPTL4, например ANGPTL3.

Термины "VEGF" и "VEGF-A" используют взаимозаменяемо по отношению к состоящему из 165 аминокислот фактору роста эндотелиальных клеток сосудов и родственным, состоящим из 121, 145, 183, 189 и 206 аминокислот фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, которые описаны Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991) и Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144 (5): 853-865 (2001), вместе с их встречающимися в природе аллельными и процессированными формами. Термин "VEGF" также используют по отношению к фрагментам полипептида, например, содержащим аминокислоты 8-109 или 1-109 165-аминокислотного фактора роста эндотелиальных клеток сосудов. Ссылка на любую из таких форм VEGF может быть указана в настоящей заявке, например, в виде "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" или "VEGF165". Положения аминокислот для "фрагмента" нативного VEGF пронумерованы, как указано в нативной последовательности VEGF. Например, положение аминокислоты 17 (метионин) в нативном фрагменте VEGF также является положением 17 (метионин) в нативном VEGF. Фрагмент нативного VEGF может обладать аффинностью связывания по отношению к рецепторам KDR и/или Flt-1, сравнимой с нативным VEGF.

"Анти-VEGF-антитело" означает антитело, которое связывается с VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Анти-VEGF-антитело согласно изобретению можно применять в качестве терапевтического средства для целенаправленного воздействия и вмешательства в заболевания или состояния, в которые вовлечена активность VEGF. Анти-VEGF-антитело, как правило, не будет связываться ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как PlGF, PDGF или bFGF. См., например, патенты США 6582959, 6703020; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; заявки на выдачу патента США 2003/0206899, 2003/0190317, 2003/0203409 и 2005/0112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004) и документ с номером в реестре поверенного P2072R1. Анти-VEGF-антитело "бевацизумаб" (BV)", также известное как "rhuMAb VEGF" или "Avastin^TM", является рекомбинантным гуманизированным моноклональным анти-VEGF-антителом, получаемым согласно Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997). Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антигенсвязывающие определяющие комплементарность области из мышиного моноклонального анти-hVEGF-антитела A.4.6.1, которое блокирует связывание VEGF человека с его рецепторами. Примерно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, получают из IgG1 человека и примерно 7% последовательности получают из мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу примерно 149000 Дальтон и является гликозилированным. Бевацизумаб и другие гуманизированные анти-VEGF-антитела дополнительно описаны в патенте США №6884879, опубликованном 26 февраля 2005.

"Антагонист VEGF" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, уменьшать или служить препятствием для активностей VEGF, включая его связывание с одним или несколькими рецепторами VEGF. Антагонисты VEGF включают анти-VEGF-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, молекулы рецепторов и производные, которые специфично связываются с VEGF, таким образом предотвращая его связывание с одним или несколькими рецепторами, антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы VEGFR-тирозинкиназ, и слитые белки, например VEGF-Trap (регенерон), VEGF₁₂₁-гелонин (перегин). Антагонисты VEGF также включают антагонистические варианты VEGF, антисмысловые молекулы, направленные к VEGF, аптамеры РНК и рибозимы против VEGF или рецепторов VEGF.

Полипептид с "нативной последовательностью" включает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и полипептид, полученный из природного источника. Таким образом, полипептид с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность встречающегося в природе полипептида любого млекопитающего. Такой полипептид с нативной последовательностью можно выделить из природного источника и можно получить способами рекомбинации или синтеза. Термин полипептид с "нативной последовательностью" специально охватывает встречающиеся в природе укороченные или секретируемые формы полипептида (например, последовательность внеклеточного домена), встречающиеся в природе вариантные формы (например, альтернативно сплайсируемые формы) и встречающиеся в природе аллельные варианты полипептида.

"Полипептидная цепь" означает полипептид, в котором каждый из его доменов связан с другим доменом(ами) пептидной связью (связями), в отличие от нековалентных взаимодействий или дисульфидных связей.

"Вариант" полипептида означает биологически активный полипептид, имеющий, по меньшей мере, примерно 80% идентичность аминокислотной последовательности с соответствующим полипептидом с нативной последовательностью. Такие варианты включают, например, полипептиды, в которых один или несколько остатков аминокислот (встречающихся в природе аминокислот и/или не встречающихся в природе аминокислот) добавлены или делетированы на N- и/или C-конце полипептида. Обычно вариант будет обладать, по меньшей мере, примерно 80% идентичностью аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, примерно 90% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, примерно 95% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с полипептидом с нативной последовательностью. Варианты также включают полипептидные фрагменты (например, подпоследовательности, укороченные формы и т.д.) нативной последовательности, обычно биологически активные.

"Идентичность аминокислотных последовательностей в процентах (%)" в данном описании определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в выбранной последовательности после выравнивания последовательностей и введения при необходимости пробелов, чтобы достичь максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения идентичности аминокислотных последовательностей в процентах можно осуществить различными способами, которые возможны в данной области, например, используя общедоступную компьютерную программу, такую как компьютерная программа BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей. Однако в целях данного изобретения значения идентичности аминокислотных последовательностей в % получают, как описано ниже, с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана Genentech, Inc. и подана с документацией для пользователей в Бюро регистрации авторских прав США, Washington D.C., 20559, где зарегистрирована с регистрационным № авторского права США TXU510087, и общедоступна из Genentech, Inc., South San Francisco, California. Программа ALIGN-2 должна быть компилирована для применения с операционной системой UNIX, например цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются.

В целях данного изобретения идентичность аминокислотной последовательности в % для данной аминокислотной последовательности A по сравнению или по отношению к данной аминокислотной последовательности B (что альтернативно может быть выражено как данная аминокислотная последовательность A, которая имеет или содержит определенную идентичность аминокислотных последовательностей в % по сравнению или по отношению к данной аминокислотной последовательности B) рассчитывают следующим образом:

100 × дробь X/Y

где X означает количество аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании указанной программой A и B, и где Y означает общее количество аминокислотных остатков в B. Будет понятно, что в том случае, когда длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, идентичность аминокислотной последовательности A по сравнению с B в % не будет равна идентичности аминокислотной последовательности B по сравнению с A в %.

Термин "вариант ANGPTL4" в используемом в данном описании смысле относится к варианту, который описан выше, и/или ANGPTL4, который содержит одну или несколько аминокислотных мутаций в нативной последовательности ANGPTL4. Необязательно, одна или несколько аминокислотных мутаций включают аминокислотную замену(ы). ANGPTL4 и его варианты для применения в изобретении могут быть получены множеством способов, хорошо известных в данной области. Варианты аминокислотной последовательности ANGPTL4 могут быть получены в результате мутаций в ДНК ANGPTL4. Такие варианты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в аминокислотной последовательности ANGPTL4, например в аминокислотной последовательности человека, кодируемой нуклеиновой кислотой, депонированной в ATCC под номером депозита 209284 или показанной на фиг.2. Может быть осуществлена любая комбинация делеции, инсерции и замены, чтобы добиться конечной конструкции, обладающей требуемой активностью. Мутации, которые будут получены в ДНК, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и предпочтительно не будут создавать комплементарные област