Детекция терапевтического антитела у экспериментального животного

Детекция терапевтического антитела у экспериментального животного

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области терапевтических антител. Оно главным образом относится к изучению терапевтических антител у экспериментального животного. Настоящее изобретение раскрывает способ детекции терапевтического антитела в образце, полученном от экспериментального животного, включающий стадии а) получения образца, предназначенного для анализа, б) инкубирования указанного образца с антителом, связывающимся с терапевтическим антителом и не связывающимся с иммуноглобулином указанного экспериментального животного, в) необязательно инкубирования указанного образца с реагентом, подходящим для избирательной детекции суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела, и д) установления корреляции комплекса, образованного на (б) или (в) с концентрацией указанного терапевтического антитела. Оно также относится к применению антитела, которое связывается с терапевтическим антителом и не связывается с иммуноглобулином экспериментального животного, для измерения концентрации суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела в образце, полученном от экспериментального животного.

Со времени создания первых моноклональных антител Koehler и Milstein в 1974 было предпринято множество попыток к созданию антител, которые подходят для терапевтического лечения человека. Первые моноклональные антитела, которые стали доступными, были созданы у мышей и крыс.Данные антитела при использовании для лечения человека вызывали нежелательные побочные эффекты, обусловленные антителами к грызунам. Было предпринято множество попыток для уменьшения или даже устранения данных нежелательных побочных эффектов.

В последние десять лет постоянно растущее количество человеческих моноклональных антител или гуманизированных моноклональных антител вышло на рынок. Хорошо известные примеры включают, например, Herceptin® и MabThera® фирмы Hoffmann-La Roche, Базель.

Очень значительное число человеческих или гуманизированных моноклональных антител находится на стадии исследования и требует изучения на экспериментальных животных, прежде чем можно будет рассматривать введение человеку с целями начальных испытаний.

С помощью экспериментальных животных необходимо исследовать такие важные критерии, как биодоступность и клиренс антител, упоминая хотя бы два из них. Во многих из данных исследований требуется определение количества терапевтического антитела в фоновой среде собственных антител хозяина. В большинстве случаев в качестве экспериментальных животных используют млекопитающих. Токсикологию часто сначала оценивают на грызунах, например на мышах или крысах. На более поздних стадиях разработки лекарственных препаратов, особенно перед тем, как ввести лекарственный препарат человеку, в данные предклинические испытания необходимо включать даже обезьян.

В системе кровообращения млекопитающих обычно содержится от приблизительно 10 до приблизительно 30 миллиграмм иммуноглобулина/мл.

Терапевтические моноклональные антитела, как правило, следует тестировать при сывороточных уровнях, лежащих в интервале от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 100 мкг/мл. Терапевтическое антитело, таким образом, приходится определять на фоне антител хозяина, которые находятся приблизительно в 100-кратном - 10000000-кратном избытке. Детекция человеческого или гуманизированного терапевтического антитела на фоне иммуноглобулина хозяина представляет собой очень важную задачу для фармаколога. Кроме того, следует иметь в виду, что для разных терапевтических антител могут требоваться различные реагенты и форматы анализа. Детекция человеческого или гуманизированного антитела становится тем более и более трудной, чем ближе родство тест-животного с Н. sapiens.

Задачей настоящего изобретения являлось исследовать, можно ли усовершенствовать способы детекции терапевтического антитела в образце, полученном от экспериментального животного. Было также исследовано, можно ли изучать человеческое или гуманизированное терапевтическое антитело в сыворотке обезьян, особенно в сыворотке гиббоновых. Данную задачу осуществляют посредством изобретения, как описано ниже и в разделе примеров, а также как заявлено в прилагаемой формуле изобретения.

В первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу детекции терапевтического антитела в образце, полученном от экспериментального животного, включающему стадии а) получения образца для анализа, б) инкубирования указанного образца с антителом, связывающимся с терапевтическим антителом и не связывающимся с иммуноглобулином указанного экспериментального животного, в) необязательного инкубирования указанного образца с реагентом, подходящим для избирательной детекции суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела, и г) установление корреляции комплекса, сформированного на стадиях (б) или (в) с концентрацией указанного терапевтического антитела.

Термин "терапевтическое антитело" относится к любому препарату антител, который предназначен для применения у человека. Предпочтительно, когда данное терапевтическое антитело будет представлять собой моноклональное антитело. Кроме того, предпочтительно, когда данное моноклональное антитело будет получено от человекообразных обезьян или будет представлять собой человеческое моноклональное антитело. Предпочтительно, когда оно будет представлять собой человеческое моноклональное антитело. Предпочтительно также, когда данное терапевтическое моноклональное антитело будет представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.

Термин "моноклональное антитело", как используют в данном контексте, относится к антителу, полученному из популяции в существенной мере гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, будучи направленными на единственный антигенный центр. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые включают разные антитела, направленные на различные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело направлено на одну детерминанту на антигене. В дополнение к своей специфичности моноклональные антитела имеют преимущество в том, что их можно синтезировать без загрязнения другими антителами. Определение "моноклональное" указывает на тип антитела как получаемого из в существенной мере гомогенной популяции антител, и его не следует ограничивать требованием того, чтобы антитело было образовано каким-либо определенным методом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для использования согласно настоящему изобретению, можно получить гибридомным методом, впервые описанным в статье Koehler G. et al., Nature 256 (1975) 495-497, или можно получить методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США No. 4816567). "Моноклональные антитела" можно также выделить из библиотек антител на фагах с использованием методов, описанных, например, в статьях Clackson Т. et al., Nature 352 (1991) 624-628 and Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597.

"Гуманизированные" формы антител нечеловека (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые включают частичные последовательности, выделенные из иммуноглобулина нечеловека и из человеческого иммуноглобулина. В основном гуманизированные антитела выделяют из человеческого иммуноглобулина (антитело-реципиент), в котором остатки из гипервариабельного участка реципиента заменяют остатками из гипервариабельного участка вида, отличного от человека (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или примат, обладающего требуемой специфичностью и аффинностью. В ряде случаев остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать дальнейшие модификации, например остатки аминокислот, которые не обнаружены в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Данные модификации приводят в результате к вариантам данных антител-реципиентов или -доноров, которые гомологичны, но не идентичны соответствующей родительской последовательности. Данные модификации делают для осуществления дальнейшей очистки антител. Как правило, гуманизированное антитело будет включать в основном все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все из гипервариабельных петель соответствуют петлям антитела-донора нечеловека и все или в основном все из FR представляют собой петли человеческого антитела-реципиента. Гуманизированное антитело необязательно также будет включать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина.

Методы гуманизации антител нечеловека описаны в области техники. Предпочтительно, когда гуманизированное антитело имеет одну или более остатков аминокислот, интродуцированных в него из источника, который отличен от человека. Данные остатки аминокислот нечеловека часто называют "импортированными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортированного" вариабельного домена. Гуманизацию в основном можно провести согласно методу, предложенному Winter и коллегами (см. статьи Jones Р.Т. et al., Nature, 321 (1986) 522-525; Riechmann L. et al., Nature, 332 (1988) 323-327; Verhoeyen M. et al., Science, 239 (1988) 1534-1536 и Presta L.G. Curr. Op.Struct. Biol., 2 (1992) 593-596)), путем замещения последовательностей гипервариабельных участков соответствующими последовательностями антитела нечеловека. Соответственно данные "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (см. патент США No. 4816567), в которых существенно меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен, замещен соответствующей последовательностью вида, отличного от человека. В действительности гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельного участка и, возможно, некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных центров антител грызунов.

Выбор человеческих вариабельных доменов, обоих, легких и тяжелых, предназначенных для использования при получении гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. Согласно так называемому методу "наилучшего соответствия", проводят скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызунов в отношении целой библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Затем человеческую последовательность, наиболее близкую последовательности грызунов, принимают за человеческую каркасную область (FR) для гуманизированного антитела (см. статьи Sims M.J. et al., J. ImmunoL, 151 (1993) 2296-2308; Chothia С.et al., J. Mol. Biol., 196 (1987) 901-917). В другом методе используют определенную каркасную область, выделенную из консенсусной последовательности всех человеческих антител определенной подгруппы легких и тяжелых цепей. Один и тот же каркас может быть использован для нескольких различных гуманизированных антител (см. статьи Carter P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285-4289; Presta L.G., et al., J. Immunol., 151 (1993) 2623-2632).

Хорошо известными примерами гуманизированных терапевтических антител являются так называемые антитела анти-ErbВ2, включая huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®), как описано в таблице 3 патента США 5821337, специально включенного в данном контексте в виде ссылки, а также гуманизированное антитело 520С9 (описанное в заявке WO 93/21319) и гуманизированное антитело 2С4, как описано в PCT/US 03/21590.

Термин "вариант" относится к полипептидам, имеющим последовательности аминокислот, которые отличаются до некоторой степени от последовательности нативного полипептида. Как правило, вариант последовательности аминокислот будет обладать по меньшей мере приблизительно 80% гомологией с последовательностью соответствующего исходного антитела, и предпочтительно, когда они будут по меньшей мере приблизительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95% гомологичными последовательности соответствующего исходного антитела. Варианты последовательности аминокислот включают замены, делеции и/или инсерции в некоторых положениях внутри последовательности аминокислот нативной последовательности аминокислот.

"Гомологию" определяют как долю остатков в варианте последовательности аминокислот, которые идентичны после элайнмента последовательностей и введения гэпов при необходимости с целью достижения максимального процента гомологии. Методы и компьютерные программы для элайнмента хорошо известны в области техники. Одной из таких компьютерных программ является "Align 2", созданная фирмой Genentech, Inc., которая зарегистрирована вместе с документацией для пользователей в United States Copyright Office, Washington, DC 20559 10 декабря 1991 г.

Термин "экспериментальное животное", как используют в данном контексте, означает представителей семейств порядка приматов, включающего мармозеток и тамаринов (семейство Callitrichidae), капуцинов (семейство Cebidae), мартышек (семейство Cercopithecidae), карликовых и мышиных лемуров (семейство Cheirogaleidae), айе-айе (мадагаскарских руконожек) (семейство Daubentoniidae), различные виды галаго (семейство Galagonidae), гиббонов и других представителей гиббоновых (семейство Hylobatidae), индри (мадагаскарского лемура), сифака (хохлатого индри) и близкие виды (семейство Indridae), истинных лемуров (семейство Lemuridae), лори (семейство Loridae), тонкотелых лемуров (семейство Megaladapidae), долгопятов (семейство Tarsiidae), а также их гибриды.

Предпочтительно, когда способ, соответствующий настоящему изобретению, будут практически реализовывать на экспериментальных животных, выбранных из группы, включающей представителей семейств мармозеток и тамаринов, мартышек, карликовых и мышиных лемуров, гиббонов и других представителей гиббоновых, истинных лемуров, а также их гибридов. В данном предпочтительном варианте осуществления исключают наиболее близких человеку человекообразных обезьян, особенно группу шимпанзе, бабуинов, горилл и орангутанов.

"Образец" согласно настоящему изобретению может представлять собой образец любой ткани или жидкости, удаленный у экспериментального животного. Предпочтительно, когда образец будет представлять собой жидкий образец, такой как слюна, моча, цельная кровь, плазма или сыворотка. Предпочтительно, когда образец будет представлять собой цельную кровь, плазму или сыворотку.

"Антитело, связывающееся с терапевтическим антителом и не связывающееся с иммуноглобулином экспериментального животного", будет связываться с терапевтическим антителом с константой диссоциации (=KDiss.) по меньшей мере 10^-9 моль/л, более предпочтительно с KDiss. по меньшей мере 10^-10 моль/л. В то же самое время свойство не связываться с иммуноглобулином экспериментального животного обеспечивается KDiss. 10^-8 моль/л или меньше. Также предпочтительно, когда антитело, связывающееся с терапевтическим антителом и не связывающееся с иммуноглобулином экспериментального животного, будет иметь разницу KDiss.-гэп по меньшей мере в 100 раз между реактивностью в отношении IgG экспериментального животного и в отношении IgG человека соответственно.

Предпочтительно, когда свойства связывания антитело, особенно KDiss., оценивают с помощью инструмента Biacore®. В данном методе свойства связывания оценивают по изменениям поверхностного плазменного резонанса (SPR). Удобно, когда исследуемое антитело связывают с твердой фазой (называемой чипом) и оценивают связывание моноклонального антитела, поликлонального антитела или даже сыворотки, содержащей IgG, с данным чипом с покрытием.

Антитело, связывающееся с терапевтическим антителом и не связывающееся с иммуноглобулином исследуемого экспериментального животного, может представлять собой поликлональное антитело, моноклональное антитело, фрагменты данных антител, а также генетические конструкции, включающие домен связывания данного антитела. Можно использовать любой фрагмент антитела, сохраняющий вышеуказанные критерии связывания с терапевтическим антителом и несвязывания с иммуноглобулином указанного экспериментального животного. Антитела, а также фрагменты антител генерируют согласно положениям методов, представленных в уровне техники, например, как описано в работе Tijssen (см. Tijssen P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11 (1990), вся монография, особенно стр.43-78, Elsevier, Amsterdam).

Кроме того, как указано выше, различные аспекты, связанные с применением терапевтического антитела у экспериментального животного, можно было бы оценивать во время предклинических испытаний. В некоторых условиях может быть существенным проанализировать общее количество присутствующего терапевтического антитела или может быть важным провести анализ ряда фрагментов терапевтического антитела, некоторых модификаций терапевтического антитела, концентрации терапевтического антитела, связанного с антигеном или фракции терапевтического антитела, еще способного связываться с антигеном. Предпочтительно, когда способ, представленный в настоящем изобретении, используют для детекции суммарного активного или антигенсвязанного терапевтического антитела соответственно.

Термин "суммарное" терапевтическое антитело относится к любому антителу, определяемому независимо от того, является ли антитело активным (т.е. еще реагирующим со своим антигеном), неактивным и/или антиген-связанным.

Термин "активное" терапевтическое антитело относится к терапевтическому антителу, присутствующему в организме экспериментального животного, которое еще способно к связыванию со своим антигеном. Данные антитела, например, не связаны со своим антигеном или какой-либо другой молекулой в своем антигенсвязывающем центре.

Термин "антигенсвязанное" терапевтическое антитело используют, чтобы указать на терапевтическое антитело, как оно присутствует в кровотоке экспериментального животного, которое связано со своим антигеном.

Суммарное, активное или антигенсвязанное терапевтическое антитело, как определено выше, можно непосредственно определить в способе, представленном в настоящем изобретении.

Кроме того, возможно также косвенным образом оценить любое "неактивное" терапевтическое антитело. Данное неактивное терапевтическое антитело может, например, представлять собой терапевтическое антитело, связанное со своим антигеном, терапевтическое антитело, связанное с перекрестно реактивным антигеном, или терапевтическое антитело, блокированное аутоантителом к терапевтическому антителу. Как будет иметь в виду компетентный специалист, с помощью настоящего описания возможно оценить фракцию неактивного антитела. В случае количеств суммарного антитела, превышающих сумму активного антитела и антигенсвязанного антитела, будет присутствовать дополнительная фракция антитела, включающая неактивное антитело, не связанное с соответствующим ему антигеном.

Имеются различные системы для анализа, например, суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела.

Суммарное антитело, например, можно определить в системе так называемого конкурентного иммуноанализа или в системе так называемого анализа сэндвичевого типа.

Данный анализ можно провести без стадий промывания (гомогенный иммуноанализ) или со стадиями промывания (гетерогенный иммуноанализ).

Предпочтительно, когда терапевтическое антитело определяют в иммуноанализе сэндвичевого типа, в котором антитело, которое связывается с терапевтическим антителом и не связывается с иммуноглобулином экспериментального животного, используют с обеих сторон данного сэндвичевого анализа. Антитело, используемое на одной стороне данного сэндвича, связано или способно связываться с твердой фазой (часто называемое захватывающим антителом), тогда как антитело с другой стороны данного сэндвича помечено таким образом, чтобы способствовать прямой или опосредованной детекции (так называемое детекционное антитело). Количество детекционного антитела, связанного в данном методе сэндвичевого анализа, прямо коррелирует с количеством терапевтического антитела в исследуемом образце.

В области техники (см., например, US 2003/0068664) известны системы анализа, которые дают возможность детекции активных терапевтических антител. Данные системы требуют связывания антигена с твердой фазой, связывания терапевтического антитела с данным связанным антигеном и детекции терапевтического антитела, связанного посредством антигена с твердой фазой.

Детекцию активного терапевтического антитела в образце можно осуществить удобным образом с помощью методов, соответствующих уровню техники. Однако детекция суммарного терапевтического антитела или фракции терапевтического антитела, связанной со своим антигеном, является крайне сложной и требует совсем другой постановки анализа и, в частности, требует нестандартных реагентов для каждого из различных анализов. С помощью представленного в настоящем изобретении антитела, которое связывается с терапевтическим антителом и не связывается с иммуноглобулином экспериментального животного, возможно оценить фракцию активного терапевтического антитела, суммарного терапевтического антитела или антигенсвязанного терапевтического антитела в тест-системах, которые аналогичны друг другу. По своей природе данный тип сравнительной оценки суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела должен иметь большие преимущества, когда проводят количественные сравнения данных различных фракций терапевтического антитела.

Предпочтительно, когда (также) разрабатывают формат анализа сэндвичевого типа для детекции активного терапевтического антитела. Предпочтительно, когда антитело, которое связывается с терапевтическим антителом и не связывается с иммуноглобулином экспериментального животного, используют в качестве захватывающего антитела, и с детекционной стороны данного сэндвичевого анализа либо используют антиген в меченой форме, либо после связывания антигена используют второе антитело, не связывающееся или конкурирующее с эпитопом, распознаваемым терапевтическим антителом, причем указанное второе антитело специфически определяется и/или помечено так, чтобы облегчить прямую или опосредованную детекцию.

Предпочтительно, когда антигенсвязанное терапевтическое антитело определяют в формате анализа сэндвичевого типа, снова предпочтительно, когда при этом используют антитело, связывающееся с терапевтическим антителом и не связывающееся с иммуноглобулином экспериментального животного, в качестве захватывающего реагента. При детекции предпочтительно, когда используют второе антитело, связывающееся с антигеном в эпитопе, который не конкурирует с эпитопом терапевтического антитела. Указанное второе антитело предпочтительно метят таким образом, чтобы облегчить прямую или опосредованную детекцию.

Для прямой детекции метящая группа может быть выбрана из любых известных определяемых маркерных групп, таких как красители, люминесцентные метящие группы, такие как хемолюминесцентные группы, например сложные акридиновые эфиры или диоксетаны, либо флуоресцентные красители, например флуоресцеин, кумарин, родамин, оксацин, резофурин, цианин или их производные. Другие примеры метящих групп представляют собой люминесцентные комплексы металлов, такие как комплексы рутения или европия, ферменты, например, как используют для ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или для CEDIA (имуноанализ с донорным клонированным ферментом, например ЕР-А-0 061 888), и радиоизотопы.

Системы опосредованной детекции включают, например, то, что реагент для детекции, например антитело для детекции, метят первым партнером пары биоаффинного связывания. Примерами подходящих пар связывания являются гаптен или антиген/антитело, биотин или аналоги биотина, такие как аминобиотин, иминобиотин или дезтиобиотин/авидин или срептавидин, сахар/лектин, нуклеиновая кислота или аналог нуклеиновой кислоты/комплементарная нуклеиновая кислота и рецептор/лиганд, например рецептор стероидного гормона/стероидный гормон. Предпочтительно, когда первые члены пары связывания включают гаптен, антиген или гормон. Особенно предпочтительными являются гаптены, подобные дигоксину и биотину и их аналогам. Второй партнер данной пары связывания, например, антитело, стрептавидин и т.п., обычно метят, чтобы обеспечить возможность прямой детекции, например, метками, как упомянуто выше.

Иммуноанализы хорошо известны компетентному специалисту. Методы проведения данных анализов, а также практическое применение и процедуры суммированы в соответствующих руководствах. Примерами соответствующих руководств являются статья Tijssen P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates (в монографии "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990), стр.221-278, под ред. R.H. Burdon и v. Р.И. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam) и различные тома монографии "Methods in Enzymology" (под ред. S.P. Colowick, N.O. Caplan, Academic Press), имеющие отношение к иммунологическим методам детекции, особенно тт.70, 73, 74, 84, 92 и 121.

Во всех вышеописанных иммунологических методах детекции выбирают условия для реагентов, которые обеспечивают связывание используемых реагентов, например связывание антитела с соответствующим ему антигеном. Компетентный специалист ссылается на результат данного события связывания, используя термин комплекс. Комплекс, сформированный в способе анализа, представленном в настоящем изобретении, коррелирует согласно положению процедур уровня техники с соответствующей концентрацией указанного терапевтического антитела. В зависимости от используемого реагента для детекции данная стадия установления корреляции будет в результате давать концентрацию суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела.

Как будет иметь в виду компетентный специалист, способы, представленные в настоящем изобретении, не только будут показывать концентрации суммарного, антигенсвязанного, активного и даже неактивного терапевтического антитела. Вследствие предпочтительного использования одного и того же реагента, антитела, связывающегося с терапевтическим антителом и не связывающегося с иммуноглобулином указанного экспериментального животного, в различных анализах, полученные значения можно легко сравнить друг с другом и даже оценить их уровни. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соотношению активного и суммарного терапевтического антитела. Данное соотношение действительно может служить показателем эффективности терапевтического антитела.

В ходе экспериментов, ведущих к настоящему изобретению, обнаружено, что определенный эпитоп, который присутствует на всех видах человеческого иммуноглобулина класса G, по-видимому, отсутствует на иммуноглобулине любого экспериментального животного за исключением IgG шимпанзе. Данный эпитоп характеризуется тем, что связывается с MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9, обозначаемым также MAB<h-Fcγ>M-R10Z8E9 или кратко МАВ M-R10Z8E9. В предпочтительном варианте осуществления, соответствующем настоящему изобретению, антитело, связывающееся с терапевтическим антителом и не связывающееся с иммуноглобулином экспериментального животного, характеризуется, кроме того, тем, что указанное антитело представляет собой антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что МАВ M-R10Z8E9. МАВ М-R10Z8E9 депонировано в DSMZ (Немецком банке микроорганизмов) 22 декабря 2004 г.как DSM ACC2708.

Предпочтительно, когда настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое связывается с терапевтическим антителом, причем данное моноклональное антитело имеет антигенсвязывающий центр, который конкурентно ингибирует связывание моноклонального антитела МАВ M-R10Z8E9, продуцируемого данной гибридомой, депонированной в DSMZ. Термин "конкурентно ингибирует" означает способно распознавать и связывать эпитоп, который распознается моноклональным антителом M-R10Z8E9. Данное связывание легко оценить с помощью принятых перекрестных конкурентных анализов с использованием антител.

Вкратце, в эксперименте по перекрестной конкуренции исследуют, ингибируют ли два (или более) специфических связывающих агента связывание друг друга с одним и тем де антигеном или эпитопом. Можно сказать, что антитела А и В исследуют на связывание с одним и тем же эпитопом. Оба из данных антител будут конкурировать за связывание, если они связываются с одним и тем же эпитопом. Связывание с одним и тем же эпитопом имеет место, если антитело А в эквимолярной концентрации снижает уровень связывания В по меньшей мере на 20% и наоборот.

Как будет иметь в виду компетентный специалист, конкуренцию можно оценивать при различных форматах анализа.

Предпочтительно, когда используют систему Biacore®, см. выше. Связывание исследуемого антитела с тем же эпитопом, с которым связывается МАВ M-R10Z8E9, происходит, если исследуемое антитело в эквимолярной концентрации снижает уровень связывания МАВ M-R10Z8E9 с человеческим IgG на 20% или более и если МАВ M-R10Z8E9 снижает уровень связывания данного антитела с человеческим IgG на 20% или более.

В еще одном следующем предпочтительном варианте осуществления МАВ M-R10Z8E9 используют как антитело, связывающееся с терапевтическим антителом и не связывающееся с иммуноглобулином экспериментального животного, в способе, представленном в настоящем изобретении.

Как отмечено выше, терапевтическое антитело, определяемое в способе, представленном в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело. Предпочтительно, когда терапевтическое антитело, используемое в способе, представленном в настоящем изобретении, включает эпитоп, который связывается МАВ M-R10Z8E9.

В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела, которое связывается с терапевтическим антителом и не связывается с иммуноглобулином экспериментального животного, для измерения концентрации суммарного, активного или антигенсвязанного терапевтического антитела в образце, полученном от экспериментального животного. Предпочтительно, когда антитело, используемое в данном способе, представляет собой антитело, связывающееся с эпитопом, который распознается МАВ M-R10Z8E9.

Следующие примеры, ссылки и фигуры приведены для того, чтобы помочь в понимании настоящего изобретения, истинный объем которого представлен в прилагаемой формуле изобретения. Следует иметь в виду, что могут быть сделаны модификации в представленных способах, не выходящие из сущности изобретения.

Описание фигур

Фигура 1: Детекция суммарного терапевтического антитела Биотинилированное моноклональное антитело (MAB<H-Fcγ pan>-M-R10Z8E9-Bi) связывают с планшетом для микротитрования, покрытым стрептавидином (SA-MTP). Терапевтическое антитело MAB<IGF-1R>связывают и опосредованно определяют с помощью меченного дигоксигенином MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9-DIG и конъюгата антидигоксигениновое лошадиное антитело-пероксидаза хрена (PAB<DIG>HRP).

Фигура 2: Детекция суммарного терапевтического антитела, разведенного в буфере Оптические плотности (OD) приводят для различных концентраций терапевтического антитела, разведенного в PBS (забуференный фосфатом солевой раствор)-Т, 0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин) (масс./об.).

Фигура 3: Детекция суммарного терапевтического антитела, разведенного в буфере, но также включающего 5% сыворотку (об./об.) макака-крабоеда.

Оптические плотности (OD) приведены для различных концентраций терапевтического антитела, разведенного в PBS-T, 0,5% BSA с 5% (об./об.) сывороткой макака-крабоеда.

Фигура 4: Детекция активного терапевтического антитела с помощью антигена на твердой фазе.

На данном рисунке показаны реагенты, используемые при детекции активного терапевтического антитела с помощью связанного с твердой фазой антигена. В специальном приведенном примере биотинилированный растворимый рецептор интерлейкина 1 (s-HJI-1R-Bi) связан с лунками планшета для микротитрования, покрытого стрептавидином (SA-MTP). Активное терапевтическое антитело связывается с антигеном, и его опосредованно определяют с помощью дигоксигенилированного античеловеческого антитела (MAB<H-Fcγ pan>M-R10Z8E9-DIG) и анти-DIG-HRP (PAB<DIG>HRP).

Фигура 5: Детекция активного терапевтического антитела, разведенного в буфере.

Оптические плотности (OD) приводят для различных концентраций терапевтического антитела, разведенного в PBS-T, 0,5% BSA.

Фигура 6: Детекция активного терапевтического антитела, разведенного в буфере, дополнительно включающего 5% сыворотку макака-крабоеда.

Оптические плотности (OD) приведены для различных концентраций терапевтического антитела, разведенного в PBS-T, 0,5% BSA с 5% сывороткой макака-крабоеда.

Фигура 7: Детекция активного терапевтического антитела с формате сэндвичевого анализа.

Биотинилированное моноклональное антитело (MAB<H-Fcγ pan>-M-R10Z8E9-Bi) связывают с планшетом для микротитрования, покрытым стрептавидином (SA-MTP). Детекция представляет собой опосредованное использование меченного дигоксигенином антигена (s-IL-1R-DIG) и конъюгата антидигоксигениновое лошадиное антитело-пероксидаза хрена (PAB<DIG>HRP).

Фигура 8: Детекция активного терапевтического антитела, разведенного в буфере, посредством сэндвичевого анализа.

Оптические плотности (OD) приведены для различных концентраций терапевтического антитела, разведенного в PBS-T, 0,5% BSA.

Фигура 9: Детекция активного терапевтического антитела, разведенного в буфере, дополнительно включающего 5% сыворотку макака-крабоеда, посредством сэндвичевого анализа.

Оптические плотности (OD) приведены для различных концентраций терапевтического антитела, разведенного в PBS-T, 0,5% BSA с 5% сывороткой макака-крабоеда. Сокращения

ABTS	2,2'-азино-ди- [3-этилбензтиазолинсульфонат (6)] соль диаммония
BSA	бычий сывороточный альбумин
ELISA	твердофазный иммуноферментный анализ
Fey	=Fcy=Fcg=Рсгамма=Fc гамма-фрагмент
	иммуноглобулина
POD (=HRP)	лошадиное антитело-пероксидаза хрена
IgG	иммуноглобулин G
DIG (Dig)	дигоксигенин
MTP	планшет для микротитрования
OD	оптическая плотность
PBS	забуференный фосфатом солевой раствор
SDS	додецилсульфат натрия
МАК (=Mab)	моноклональное антитело
РАК (=Pab)	поликлональное антитело
KT	комнатная температура
SA	стрептавидин
Т	Tween®20
<человеческий IgG>	антитело к человеческому IgG

Пример 1

Оценка специфичности

а) Использование различных антител к человеческому IgG в MTP-ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ на планшетах для микротитрования)

Планшет для микротитрования (МТР) (Maxisorb®, Nunc) покрывают сывороткой обезьяны (например, макака-крабоеда) и человека, разведенной до 20% в карбонатном буфере (рН 9,6) при комнатной температуре (КТ) в течение 1 часа соответственно. После трехкратного промывания PBS-Tween®20 все лунки МТР блокируют PBS/3% BSA при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем лунки МТР инкубируют (1 час, КТ) с различными антителами к человеческому IgG (неконъюгированными или конъюгатами антитело к человеческому IgG - пероксидаза хрена (POD) (см. табл.1)). Используют различные античеловеческие антитела согласно рекомендациям соответствующего изготовителя.

Лунки трижды промывают, как описано выше. Лунки, инкубированные с конъюгатами POD, непосредственно обрабатывают для ферментной реакции/детекции связанного античеловеческого иммуноглобулина. Другие лунки инкубируют (1 час.; КТ) соответствующим образом с конъюгатами анти-Dig-, анти-мышиный IgG- или стрептавидин-POD (все реагенты фирмы Roche Diagnostics, Германия) с последующей стадией промывания. POD, включенный в конъюгаты POD, катализирует цветную реакцию субстрата ABTS. Сигнал измеряют с помощью ридера для ELISA при длине волны 405 нм (эталонная длина волны: 490 нм). Для каждого антитела к человеческому IgG рассчитывают соотношение сигнала в отношении человеческих антител и сигнала сыворотки макака-крабоеда. Данные значения используют для оценки специфичности анти