Мутантный вирус бычьей диареи

Мутантный вирус бычьей диареи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

Вирус бычьей вирусной диареи (вирус BVD или BVDV) представляет собой небольшой РНК-вирус рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Он является близкородственным вирусам, которые являются причинными факторами пограничной болезни овец и классической чумы свиней. Заболевание, вызываемое BVDV, является широко распространенным и может быть экономически разорительным. BVDV-инфекция может приводить к проблемам воспроизводства у крупного рогатого скота и быть причиной выкидышей или преждевременных родов. BVDV способен проникать в плаценту беременного крупного рогатого скота и может приводить к рождению хронически инфицированных (РI) телят, которые являются иммунотолерантными к вирусу и устойчиво заражены вирусом на протяжении всей их жизни (Malmquist J. Am. Vet. Med. Assoc. 152: 763-768 (1968); Ross, et at., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188: 618-619 (1986)). Инфицированный крупный рогатый скот также может демонстрировать «вирусную диарею», характеризующуюся повышенной температурой, диареей, кашлем и изъязвлением слизистой оболочки пищеварительного тракта (Olafson, et al., Come // Vet. 36: 205-213 (1946); Ramsey, et al., North Am. Vet. 34: 629-633 (1953)). Такие хронически инфицированные животные являются источником распространения вируса в стаде с последующими вспышками вирусной диареи (Liess, et al., Dtsch. Tieraertztl. Wschr. 81: 481-487 (1974)) и сильно предрасположены к инфицированию микроорганизмами, ответственными за инициацию кишечных заболеваний или пневмонии (Barber, et al., Vet. Rec. 117: 459-464 (1985)).

BVD-вирусы относят к одному из двух биотипов. Вирусы «ср» биотипа индуцируют цитопатогенный эффект в культивируемых клетках, тогда как вирусы «ncp» биотипа не индуцируют его (Gillespie, et al., Cornell Vet. 50: 73-79 (1960)). Кроме того, распознаны два основных генотипа (тип 1 и 2), оба из которых, как было показано, вызывают целый ряд клинических синдромов (Pellerin, et al., Virology 203: 260-268 (1994); Ridpath, et al., Virology 205: 66-74 (1994)). Вирионы BVD составляют 40-60 нм в диаметре. Нуклеокапсид BVDV состоит из одной молекулы РНК и капсидного белка С. Нуклеокапсид окружен липидной мембраной с двумя гликопротеинами, закрепленными в ней, Е1 и Е2. Третий гликопротеин, E^rns, свободно ассоциирован с оболочкой. Геном BVDV составляет приблизительно 12,5 кб в длину и содержит одну открытую рамку считывания, расположенную между 5'- и 3'-нетранслируемыми участками (NTRs) (Collett, et al., Virology 165: 191-199 (1988)). Полипротеин приблизительно 438 кДа транслируется с этой открытой рамки считывания и расщепляется клеточными и вирусными протеазами на по меньшей мере одиннадцать вирусных структурных и неструктурных (NS) белков (Tautz, et al., J. Virol. 71: 5415-5422 (1997); Xu, et al., J. Virol. 71: 5312-5322 (1997); Elbers, et al., J.Virol. 70: 4131-4135 (1996); и Wiskerchen, et al., Virology 184: 341-350 (1991)). Геномный порядок BVDV представляет собой p20/N^pro, р14/С, gp48/E^rns, gp25/Е1, gp53/Е2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, p58/NS5A и p75/NS5B. P20/N^pro (Stark, et al., J. Virol. 67: 7088-7093 (1993); Wiskerchen, et al., Virol. 65: 4508-4514 (1991)) является цис-активной папаиноподобной протеазой, которая сама отщепляется от остатка синтезированного полипротеина. Капсидный белок (С), также упоминаемый как р14, является основным протеином и выполняет функции компоновки геномной РНК и формирования вириона, заключенного в оболочку. Р14/С сохраняется у разных пестивирусов. Три оболочечных протеина, gp48/E^rns, gp25/Е1 и gp53/Е2, в значительной степени гликолизированы. E^rns образует гомодимеры, ковалентно связанные дисульфидами. Отсутствие гидрофобной мембранной якорной области позволяет предположить, что E^rns свободно ассоциирован с оболочкой. E^rns индуцирует высокие титры антител у инфицированного крупного рогатого скота, но антисыворотка обладает ограниченной вирус-нейтрализующей активностью. Е1 обнаружен в вирионах, ковалентно связанных с gp53/Е2 посредством дисульфидных связей. Е1 содержит две гидрофобные области, которые служат для заякоривания белка в мембране и в качестве сигнального пептида для начала транслокации. Е1 не вызывает существенного антителогенеза у инфицированного крупного рогатого скота, что позволяет предположить, что он может не экспонироваться на поверхности вирионов. Аналогично Е1, Е2 также имеет мембранную якорную область на своем С-конце. Однако в отличие от Е1, Е2 является очень антигенным, являясь одним из наиболее иммунодоминантных белков BVDV. Связывание антител с Е2 может эффективно нейтрализовать вирусную инфекцию, что позволяет предположить, что он может быть вовлечен в проникновение вирусов. Область полипротеина ниже структурных белков кодирует неструктурные белки и расщепляется двумя вирусными протеолитическими ферментами. Соединение NS2-NS3 расщепляется цинк-зависимой протеазой, кодируемой в NS2. С-концевой участок полипротеина BVDV, кодирующий NS3, NS4A, NS4B и NS5B, расщепляется сериновой протеазой, кодируемой N-концевым доменом NS3. NS3 является еще одним основным BVDV-иммуногеном, так как инфицированный крупный рогатый скот развивает сильный гуморальный ответ к нему. Наоборот, в сыворотке BVDV-инфицированного крупного рогатого скота не обнаружены антитела к другим неструктурным белкам, и можно обнаружить только слабый гуморальный иммунный ответ на NS4A.

NS3 обнаружен исключительно в цитопатических изолятах BVDV, и, на основании сравнений среди подтипов BVDV и других пестивирусов, область, кодирующая белок, является одной из наиболее консервативных в геноме BVDV. С-концевой участок NS3 кодирует РНК-зависимую NTP-азу/геликазу и, на основании сравнений последовательностей высококонсервативных аминокислотных мотивов геликаз, геликазу BVDV классифицировали как геликазное надсемейство-2 (SF2). В рамки этого надсемейства входят аналогичные белки из поти-, флави- и пестивирусов, включая геликазу NS3 вируса чумы свиней (классическая чума свиней), и РНК-геликазы из других флавивирусов, таких как вирус западного Нила, вирус желтой лихорадки, вирус гепатита С (HCV) и вирус японского энцефалита. Молекулярная структура протеазных и геликазных доменов HCV NS3 была определена (Yao, et al., Nat Struct Biol. 4: 463-7 (1997); Jin and Peterson, Arch Bioxchem Biophys 323: 47-53 (1995)). Протеазный домен содержит двойную β-цилидровую складку, которая обычно встречается среди членов семейства химотрипсиновых сериновых протеаз. Геликазный домен содержит два структурно близких β-α-β субдомена и третий субдомен из семи спиралей и трех коротких β-нитей, обычно упоминаемый как геликазный α-спиральный субдомен. Нуклеозидтрифосфат (NTP) и РНК-связывающие центры, так же как геликазный активный центр, экспонированы на поверхности, в то время как протеазный активный центр не экспонирован на поверхности и ориентирован в направлении геликазного домена. Протеазные и геликазные домены ковалентно связаны короткой экспонированной на поверхности молекулярной цепочкой и взаимодействуют на большой площади поверхности . Геликазный активный сайт, однако, ориентирован в сторону от этой поверхности взаимодействия.

Среди вакцин BVDV в настоящее время доступными являются те, которые содержат химически инактивированный вирус дикого типа (McClurkin, et al., Arch. Virol. 58: 119 (1978); Fernelius, et al., Am. J. Vet. Res. 33: 1421-1431 (1972); и Kolar, et al., Am. J, Vet. Res. 33: 1415-1420 (1972)). Обычно такие вакцины требуют введения многократных доз и генерируют кратковременный иммунный ответ; они также не защищают от эмбрионального переноса вируса (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11: 615-625 (1995)). У овец субъединичная вакцина, базирующаяся на очищенном белке Е2, описана у Bruschke, et al., Vaccine 15: 1940-1945 (1997). Несмотря на то что такая вакцина осуществляет защиту плода от инфицирования, защита ограничена только гомологичным штаммом вируса и нет корреляции между титрами антител и защитой.

Модифицированный живой вирус (MLV) вакцин BVDV получали, используя вирус, ослабленный повторным пассированием в бычьих или свиных клетках (Coggins, et al., Cornell Vet. 51: 539 (1961); и Philips, et al., Am. J. Vet. Res. 36: 135 (1975)), или химически индуцированными мутациями, что придает вирусу температурочувствительный фенотип (Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 45: 2498 (1984); и Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 47: 557-561 (1986)). Доказано, что однократная доза вакцины MLV BVDV является достаточной для обеспечения защиты от инфекции, и длительность иммунитета у вакцинированного крупного рогатого скота может распространяться на многие годы (Coria, et al., Can. J.Con. Med. 42: 239 (1978)). Кроме того, описана перекрестная защита при использовании вакцин MLV (Martin, et al., In "Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases", 75: 183 (1994)). Однако соображения безопасности - включая перенос вакцинного штамма в плод - представляют собой главный вопрос при использовании таких модифицированных живых вирусных вакцин (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11: 615-625 (1995)).

На основании вышеизложенного становится понятно, что существует необходимость в новых и более эффективных вакцинах для контроля распространения вируса BVDV. Такая вакцина могла бы стать неоценимой в будущих национальных и региональных программах уничтожения вируса BVDV, a также ее можно было бы комбинировать с другими маркированными вакцинами, что представляло бы значительное улучшение в животноводстве. Одной из таких вакцин является «маркированная» вакцина. В такой вакцине отсутствует антигенная детерминанта, присутствующая в вирусе дикого типа. Животные, инфицированные вирусом дикого типа, генерируют иммунный ответ к «маркированной» иммуногенной детерминанте, в то время как неинфицированные, вакцинированные животные не генерируют его из-за отсутствия детерминанты в маркированной вакцине. Используя иммунологический анализ, направленный на маркированную детерминанту, инфицированных животных можно отделить от вакцинированных, неинфицированных животных. Путем выбраковки инфицированных животных стадо может со временем стать безвирусным в отношении вируса BVDV. Сертификация стада безвирусного в отношении BVDV, в дополнение к выгоде от исключения угрозы заболевания BVD, имеет прямые привилегии в плане торгово-экономических преимуществ.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено на вирус бычьей вирусной диареи, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где мутация в домене NS3 приводит к утрате распознавания моноклональным антителом, генерированным на NS3 дикого типа, но где сохраняются репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

Настоящее изобретение также направлено на новую маркированную вакцину против бычьей вирусной диареи, содержащую вирус бычьей вирусной диареи, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где NS3 не распознается стандартным моноклональным антителом к NS3, таким как, например, 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8, но где сохраняются репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

Настоящее изобретение также относится к анализу определения того, вакцинировано ли животное, или оно невакцинировано или инфицировано вирусом BVDV.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен вирус бычьей вирусной диареи, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где мутация в геликазном домене приводит к утрате способности распознавания моноклональным антителом, генерированным против NS3 из вируса бычьей вирусной диареи дикого типа, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен вирус бычьей вирусной диареи, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где NS3 не распознается моноклональным антителом к NS3 и где антитело к NS3 выбрано из группы, состоящей из 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

В еще одном воплощении изобретения вирусная вакцина содержит одну аминокислотную мутацию геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирусная вакцина содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке 1841.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке 1843.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке 1845.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР в аминокислотном остатке 1867.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР в аминокислотном остатке 1868.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР в аминокислотном остатке 1869.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли SES.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотном остатке 1939.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотном остатке 1942.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две, три или четыре аминокислотные мутации геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две мутации геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи включает две мутации геликазного домена в пределах петли IGR.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две мутации геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотных остатках 1843 и 1845.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две мутации геликазного домена в пределах петли SES.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи включает две мутации геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотных остатках 1939 и 1942.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит три мутации геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит три мутации геликазного домена в пределах петли IGR.

В еще одном воплощении по настоящему изобретению вирус бычьей вирусной диареи содержит три мутации геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотных остатках 1867, 1868 и 1869.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи включает три мутации геликазного домена в пределах петель IGR и SES в аминокислотных остатках 1845, 1868 и 1939.

В одном особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложена маркированная вирусная вакцина против бычьей вирусной диареи, содержащая вирус бычьей вирусной диареи, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена, где мутация геликазного домена NS3 приводит к утрате распознавания моноклональным антителом, генерируемым против NS3 вируса бычьей вирусной диареи дикого типа, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен способ дифференциации животного, инфицированного вирусом бычьей вирусной диареи, от животного, вакцинированного вирусной вакциной против бычьей вирусной диареи. В этом воплощении вакцина против бычьей вирусной диареи представляет маркированную вакцину, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена, и способ включает:

получение тестируемого образца от тестируемого животного;

обнаружение вируса бычьей диареи в тестируемом образце; и

определение, содержит ли вирус бычьей вирусной диареи мутацию.

В еще одном воплощении настоящего изобретения способ обнаружения вируса бычьей вирусной диареи включает применение по меньшей мере одного моноклонального антитела.

Предпочтительный способ включает аминокислотную мутацию геликазного домена маркированной вакцины в геликазном домене NS3.

Например, воплощение такого дифференциального анализа может включать следующие стадии:

добавление меченого антитела, способного обнаружить вирус бычьей вирусной диареи дикого типа или способного обнаружить мутантный вирус бычьей вирусной диареи в тестируемом образце, где тестируемый образец содержит биологическую жидкость от тестируемого животного; и

измерение аффинности связывания меченого антитела с вирусом бычьей вирусной диареи дикого типа или с мутантным вирусом бычьей вирусной диареи путем приведения в контакт по меньшей мере одного моноклонального антитела с вирусом бычьей вирусной диареи дикого типа или с мутантным вирусом бычьей вирусной диареи; и

определение статуса вакцинации тестируемого животного путем сравнения аффинности связывания посредством применения моноклонального антитела, направленного на вирус BVDV дикого типа по сравнению с вирусом BVDV с мутантным NS3.

Предпочтительный способ включает добавление меченого первого антитела, направленного на домен, отличный от мутантного NS3; и

добавление меченого второго антитела, направленного на мутантный участок NS3.

В одном воплощении этого способа первое антитело направлено на вирус дикого типа.

В еще одном воплощении этого способа второе антитело направлено на мутантный участок NS3.

В еще одном воплощении этого способа второе антитело направлено против NS3 и выбрано из группы, состоящей из 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8.

В еще одном воплощении данного способа второе антитело направлено по меньшей мере на один мутантный участок NS3, выбранный из группы, состоящей из петли IGR, петли КНР и петли SES.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке, выбранном из группы, состоящей из 1841, 1843 и 1845.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли KHP в аминокислотном остатке, выбранном из группы, состоящей из 1867, 1868 и 1869.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотном остатке, выбранном из группы, состоящей из 1939 и 1942.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли IGR и петли SES в аминокислотных остатках 1845, 1868 и 1939.

Краткое описание графических материалов

Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения проиллюстрированы посредством следующего описания, прилагаемой формулы изобретения и сопровождающих графических материалов.

На Фиг.1 изображены домены NS3.

На Фиг.2 показано выравнивание последовательностей геликазных доменов вирусов BVD и HCV.

На Фиг.3 показано изображение молекулярной модели геликазы BVDV.

На Фиг.4 показана локализация сканируемых мутантов.

На Фиг.5 показана карта домена полного полноразмерного предшественника BVDV и структура субвирусного репликона BVDV.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO.1 представляет полноразмерную пептидную последовательность, не обработанную полипротеином из вируса бычьей вирусной диареи. Нумерация остатков в данной последовательности соответствует описанным здесь мутациям. Например, мутация, описанная как «К1845А», означает, что остаток лизина в положении 1845 последовательности SEQ ID NO.1 был замещен остатком аланина.

SEQ ID NO.2 представляет собой фрагмент последовательности ДНК плазмиды, которая фланкирует 5'-конец сайта клонирования p15aDI для генерирования типичных мутантов.

SEQ ID NO.3 представляет собой последовательность фрагмента ДНК плазмиды, которая фланкирует 3'-конец сайта клонирования p15aDI для генерирования типичных мутантов.

SEQ ID NO.4 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации I1841А.

SEQ ID NO.5 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации I1841А.

SEQ ID NO.6 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1843A.

SEQ ID NO.7 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1843A.

SEQ ID NO.8 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1845А.

SEQ ID NO.9 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1845А.

SEQ ID NO.10 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1867А.

SEQ ID NO.11 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1867А.

SEQ ID NO.12 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Н1868А.

SEQ ID NO.13 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Н1868А.

SEQ ID NO.14 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Р1869А.

SEQ ID NO.15 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения мутации описанной здесь Р1869А.

SEQ ID NO.16 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Е1939А.

SEQ ID NO.17 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Е1939А.

SEQ ID NO.18 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1942A.

SEQ ID NO.19 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1942A.

SEQ ID NO.20 представляет собой пептидную последовательность доменов 1 (геликаза) и 2 (NTPaзa) области NS3 транслированного BVDV.

SEQ ID NO.21 представляет собой пептидную последовательность доменов 1 (геликаза) и 2 (NTPaзa) области NS3 транслированного вируса гепатита С (HCV).

Определения

Следующие определения могут быть применены к терминам, используемым в описании воплощений по изобретению. Следующие определения заменяют любые противоречивые определения, содержащиеся в каждой индивидуальной ссылке, включенной в данное описание изобретения посредством ссылки.

Научные и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, если они не определены здесь иначе, будут иметь значения, которые, как правило, являются понятными обычным специалистам в данной области техники. Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе будут включать в себя множественное число, и термины во множественном числе будут включать в себя единственное число.

Термин «аминокислота», при использовании здесь, относится к аминокислотам, к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые действуют аналогично природным аминокислотам. Природными аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые затем модифицированы, например гидроксипролин, карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Стереоизомеры (например, D-аминокислот) двадцати обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α и α-двухзамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие необычные аминокислоты, также могут быть пригодными компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры необычных аминокислот включают: 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглютамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, то есть углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и R-группу. Типичные аминокислотные аналоги включают, например, гомосерин, норлейцин, метионина сульфоксид и метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же самую основную химическую структуру, что и природная аминокислота. Аминокислотные миметики относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично природной аминокислоте.

Аминокислоты могут упоминаться здесь либо посредством хорошо известных трехбуквенных символов, либо посредством однобуквенных символов, рекомендованных Биохимической номенклатурной комиссией IUPAC-IUB.

Аминокислоты - Однобуквенные коды: Трехбуквенные коды: Полные названия

G:	Gly:	глицин
V:	Val:	валин
L:	Leu:	лейцин
А:	Ala:	аланин
I:	lie:	изолейцин
S:	Ser:	серин
D:	Asp:	аспарагиновая кислота
К:	Lys:	лизин
R:	Arg:	аргинин
H:	His:	гистидин
F:	Phe:	фенилаланин
Y:	Туr:	тирозин
Т:	Thr:	треонин
C:	Cys:	цистеин
M:	Met:	метионин
Е:	Glu:	глутаминовая кислота
W:	Trp:	триптофан
Р:	Pro:	пролин
N:	Asn:	аспарагин
Q:	Gln:	глутамин
X:	Xaa:	точно не
	установленная аминокислота

Подразумевается, что термин «животные объекты», при использовании здесь, включает любое животное, которое является восприимчивым к BVDV-инфекциям, такое как крупный рогатый скот, овца и свинья. Под «лечением» или «вакцинацией» подразумевается предупреждение или уменьшение риска инфицирования вирулентным штаммом BVDV, облегчение симптомов BVDV-инфекции или ускорение выздоровления от BVDV-инфекции.

BVD «вирусы», «вирусные изоляты» или «вирусные штаммы», при использовании здесь, относятся к вирусам BVD, которые состоят из вирусного генома, ассоциированных белков и других химических составляющих (таких как липиды). Обычно вирус BVD имеет геном в форме РНК. РНК может быть обратно-транскрибирована в ДНК для использования в клонировании. Таким образом, ссылки, сделанные здесь на нуклеиновую кислоту и вирусные последовательности BVD, охватывают как последовательности вирусной РНК, так и последовательности ДНК, полученные от последовательностей вирусной РНК. Для удобства геномные последовательности BVD, как показано в ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ниже, относятся к полипептидной последовательности и праймерным последовательностям ДНК, применяемым в создании типичных мутаций. Соответствующая последовательность РНК для каждой из них является совершенно очевидной для специалистов в данной области техники.

Целый ряд вирусов BVD 1 типа и 2 типа известны специалистам в данной области техники и доступными благодаря, например, Американской типовой коллекции культур.

Термин «консервативные аминокислотные замещения», применяемый здесь, означает то, что обычно имеет место в семействе аминокислот, что относится к их боковым цепям. В частности, как оно используется здесь, консервативное аминокислотное замещение представляет собой замещение, которое не оказывает влияние на распознавание антителом данного пептида по сравнению с пептидом, полученным от дикого типа. Генетически кодированные аминокислоты, как правило, подразделяют на четыре группы: (1) кислотные: аспартат, глутамат; (2) основные: лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные: глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин также одновременно классифицируются как ароматические аминокислоты.

Соответственно, применяемый здесь термин «неконсервативные аминокислотные замещения» означают, что они, вероятно, имеют другие свойства, особенно в отношении распознавания антителами. Таким образом, неконсервативное аминокислотное замещение будет инициировать отличительный иммунный ответ, такой как, например, утрата распознавания антителом, генерированным против пептида, полученного от дикого типа.

Термин «иммуногенный», используемый здесь, означает способность вируса BVD, мутантного или дикого типа, вызывать иммунный ответ у животного против вирусов BVD 1 типа или 2 типа или против обоих вирусов BVD и 1 типа, и 2 типа. Иммунный ответ может быть клеточным иммунным ответом, опосредованным главным образом цитотоксическими Т-клетками, или гуморальным иммунным ответом, опосредованным главным образом хелперными Т-клетками, которые в свою очередь активируют В-клетки, что приводит к продуцированию антител.

Применяемый здесь термин «голая ДНК» относится к плазмиде, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие агент по данному изобретению вместе с коротким промоторным участком для контроля за его продуцированием. Она называется «голой ДНК», потому что плазмиды не переносятся в каком-либо носителе для доставки. Когда такая ДНК-плазмида попадает в клетку-хозяина, такую как эукариотическая клетка, в клетке транскрибируются и транслируются белки, которые она кодирует.

Применяемый здесь термин «плазмида» относится к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей экспрессируемый ген, и включает линейные или кольцевые нуклеиновые кислоты и нуклеиновые кислоты с двойной или одинарной нитью. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК, и может включать модифицированные нуклеотиды или рибонуклеотиды, и может быть химически модифицированной такими способами, как метилирование или включение защитных групп или кэп- или хвостовых структур.

Термин «вакцина», применяемый здесь, относится к композиции, которая предупреждает или уменьшает риск инфекции или которая облегчает симптомы инфекции. Защитные эффекты вакцинной композиции в отношении патогена обычно достигаются посредством индуцирования у субъекта иммунного ответа, либо клеточно-опосредованного, либо гуморального иммунного ответа или комбинации их обоих. Вообще говоря, аннулирование или уменьшенный процент BVDV-инфекции, облегчение симптомов или ускоренное удаление вирусов из инфицированного субъекта являются показателями защитных эффектов вакцинной композиции. Вакцинные композиции по данному изобретению обеспечивают защитные эффекты против инфекций, вызываемых вирусами BVD.

Термин «вектор», применяемый здесь, означает средство, которое обеспечивает или облегчает перенос нуклеиновой кислоты из одной среды в другую. Согласно настоящему изобретению и в качестве примера некоторые векторы, используемые в рекомбинантных ДНК-технологиях, позволяют переместить нуклеиновые кислоты, такие как участок ДНК (например, участок гетерологичной ДНК, например участок гетерологичной цДНК), в хозяина или клетку-мишень с целью репликации нуклеиновых кислот и/или экспрессирования белков, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Примеры векторов, применяемых в рекомбинантных ДНК-технологиях, включают, без ограничения ими, плазмиды, хромосомы, искусственные хромосомы и вирусы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее подробное описание изобретения представлено, чтобы помочь специалистам в данной области техники в осуществлении данного изобретения. Даже с учетом этого, данное подробное описание нельзя истолковывать как чрезмерно ограничивающее данное изобретение, так как модификации и вариации воплощений, обсуждаемых здесь, могут быть осуществлены специалистами средней квалификации в области техники без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения.

Содержание каждой указанной здесь ссылки, включая содержание ссылок, указанных в этих первичных ссылках, включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Для размножения и очистки плазмид, пригодных в данном изобретении, можно использовать стандартные методы. Предпочтительной прокариотической клеткой-хозяином для плазмидного размножения является клеточная линия E. coli GM2163, но также можно использовать некоторые другие типы клеток. РНК, транскрибируемая из плазмиды, может быть введена путем трансфекции в эукариотические клетки-хозяева, способные поддерживать продуцирование вируса, такие как клетки MDBK (клетки почек крупного рогатого скота). Вирус можно продуцировать в таких клетках-хозяевах и выделять оттуда в высокоочищенной форме, применяя известные методики разделения, такие как центрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

В одном воплощении настоящего изобретения предложены иммуногенные композиции, в которые включен один или более из описанных выше мутантных вирусов BVD.

Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к изолированным геномным нуклеиновым молекулам мутантных вирусов BVD, как описано выше. Молекулы нуклеиновых кислот при использовании здесь включают как РНК, так и ДНК.

В данном воплощении изолированная геномная нуклеиновая молекула вируса BVD содержит геномную последовательность вируса 1 типа, где по меньшей мере участок домена NS3 мутирован в геликазном домене.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложены векторы, в которые включена геномная нуклеиновокислотная последовательность вируса BVD, как описано выше. Такие векторы могут быть введены в подходящие клетки-хозяева либо для продуцирования больших количеств геномных нуклеиновокислотных молекул, либо для продуцирования потомства мутантных вирусов BVD. Векторы могут содержать элементы другой последовательности для облегчения размножения, выделения и субклонирования вектора, например селектируемые маркерные гены и точки начала репликации, которые обеспечивают возможность размножения и селекции в бактериях и в клетках-хозяевах. Особенно предпочтительным вектором по данному изобретению является p15aDI (смотри Фиг.5).

Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые введена молекула геномной нуклеиновой кислоты мутантного вируса BVD по настоящему изобретению. При использовании здесь, «клетки-хозяева» включают любые прокариотические клетки, трансформированные молекулой геномной нуклеиновой кислоты мутантного вируса BVD, предварительно обеспеченной подходящим вектором. При использовании здесь, «клетки-хозяева» также включают любые эукариотические клетки, инфицированные мутантным вирусом BVD или иным способом несущие молекулу геномной нуклеиновой кислоты мутантного вируса BVD. Предпочтительной прокариотической хозяйской клеткой для плазмидного размножения является клеточная линия Е. coli GM2163, но также могут быть использованы другие клеточные типы. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, такие как MDBK клетки (АТСС CCL 22). Однако также могут быть использованы другие культивируемые клетки. Кроме того, изобретение включает потомство вируса, продуцируемое в таких клетках.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирусы могут быть ослаблены химической инактивацией или серийным пассированием в клеточной культуре, прежде чем использовать их в иммуногенной композиции. Методы ослабления хорошо известны специалистам в данной области техники.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению также могут включать дополнительные активные ингредиенты, например другие иммуногенные композиции против BVDV, например которые описаны в одновременно находящейся на рассмотрении патентной заявке US 08/107908, патенте US 6060457, патенте US 6015795, патенте US 6001613 и патенте US 5593873, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте.

Кроме того, иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут включать один или более чем один ветеринарно приемлемый носитель. При использовании здесь, «ветеринарно приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсную среду, оболочки, адъюван