Новые чувствительные к антибиотикам штаммы молочнокислых бактерий

Новые чувствительные к антибиотикам штаммы молочнокислых бактерий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения новых чувствительных к антибиотикам штаммов рода Bifidobacterium из устойчивых к антибиотикам Bifidobacteriacea, обладающих кодируемым хромосомой геном устойчивости к антибиотикам, и к штаммам, получаемым этим способом. В частности, настоящее изобретение относится к новым чувствительным к антибиотикам штаммам, полученным из пробиотических устойчивых к антибиотикам штаммов, и к применению таких новых штаммов для изготовления продукта питания, или корма, или дозированной формы, содержащей живые организмы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Бактерии, которые сбраживают сахара с получением кислот, в частности, молочной кислоты, в качестве основного метаболического компонента, давно известны. Такие бактерии встречаются в молоке или в молочных продуктах, живых или разлагающихся растениях, а также в кишечнике человека и животных. Традиционно, эти бактерии называют "молочнокислыми бактериями". Молочнокислые бактерии определяют в некоторой степени гетерологичную группу грамположительных неподвижных микроаэрофильных или анаэробных бактерий, которые сбраживают сахар с образованием кислот, включающих в себя молочную кислоту, и включают в себя, например, род Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc и Pediococcus.

На протяжении веков молочнокислые бактерии использовали для изготовления продуктов питания и корма, включая большинство молочных продуктов, и в настоящее время молочнокислые бактерии необходимы для изготовления всех продуктов брожения молока, таких как йогурт, сыр и масло. Более того, молочнокислые бактерии широко используют в индустрии переработки мяса, индустрии изготовления вина, индустрии изготовлении сока, а также в ряде других индустрий.

Культуры молочнокислых бактерий также являются важными для применения в биологической консервации продуктов питания.

Публикация большого количества данных, в которых документируется, что различные молочные бактерии оказывают положительное влияние на здоровье человека и/или животных, привлекла еще больший интерес к этой группе бактерий. В частности, было обнаружено, что определенные штаммы Lactobacillus или Bifidobacterium способны колонизировать слизистую оболочку кишечника и способствовать поддержанию здоровья организма хозяина.

В EP 0768375 описаны определенные штаммы Bifidobacterium ssp, которые способны вселяться во флору кишечника и конкурентным образом не допускать адгезии патогенных бактерий к клеткам кишечника. Описано, что эти Bifidobacteria способствуют модулированию иммунной системы и, таким образом, поддержанию здоровья индивидуума. Иммуномодулирующий эффект Bifidobacteria может даже передаваться еще не родившемуся ребенку. В WO 01/97822, например, описано, что прием внутрь штамма Bifidobacterium animalis Bb-12® матерью во время беременности снижает встречаемость атопических заболеваний у детей. Также в WO 03/099037 описано, что штамм Bifidobacterium animalis Bb-12® способен положительно модифицировать иммунный ответ. В соответствии с Masco et al. (2004), штамм Bb-12® Bifidobacterium animalis правильно называть штаммом Bb-12® Bifidobacterium animalis subsp . lactis.

Пробиотические микроорганизмы определяют как "Живые микроорганизмы, которые при введении в достаточных количествах оказывают пользу для здоровья хозяина" (FAO / WHO 2002). В течение последних лет происходило накопление данных о пробиотических свойствах Bifidobacteria и других молочных бактерий. Как правило, пробиотическая активность связана с определенными штаммами. Упомянутый выше штамм Bifidobacterium animalis Bb-12®, а также штамм Bifidobacterium lactis HN019 были описаны как пробиотический (WO 01/97822, WO 03/099037, Zhou et al. (2005), US 6379663).

Во всем мире существует широко распространенное опасение, что количество устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий значительно возрастает. Все имеющиеся данные указывают на то, что вызывающее беспокойство увеличение количества устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий вызвано распространенным и очень широким применением антибиотиков у населения в целом, а также в животноводстве.

Точно установлено, что множество устойчивых к антибиотикам бактерий обладают генетическими детерминантами, генами, которые придают устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Более того, хорошо известно, что такие генетические детерминанты в определенных условиях могут быть перенесены и могут передавать реципиентным бактериям устойчивый к антибиотикам фенотип. Частота переноса в значительной степени зависит от конкретного генетического окружения, в котором находятся гены устойчивости к антибиотикам. Таким образом, было показано, что гены устойчивости к антибиотикам, расположенные на плазмидах или на транспозонах, передают фенотип устойчивости к антибиотикам реципиентной бактерии с относительно высокой частотой, в то время как кодируемые хромосомой детерминанты являются в значительно меньшей степени способными к перемещению.

По этим причинам может вызывать опасение употребление также полезных непатогенных бактерий, если они содержат детерминанту устойчивости к антибиотику. Этой проблеме также уделено внимание в отчете Научного комитета по питанию животных (SCAN) ЕВРОПЕЙСКОЙ КОМИССИИ по критериям оценки безопасности микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам в клинике человека и ветеринарии, 3 июля 2001 года, пересмотренном 24 января 2003 года, в котором утверждается, что наличие известного гена устойчивости недопустимо (страница 21).

Устойчивость к тетрациклину является наиболее распространенным типом устойчивости к антибиотикам у бактерий, встречающихся в природе, а также она является наиболее широко распространенным типом устойчивости среди бактерий, выделенных из животных (Billington, 2002). Тетрациклин ингибирует синтез белка посредством связывания с единичным высокоаффинным участком на субъединице рибосомы 30S. При наличии тетрациклина в этом положении предотвращается связывание аминоацил-тРНК с A-участком и, таким образом, блокируется синтез белка.

Устойчивость к тетрациклину может быть опосредована либо активным выведением тетрациклина из клетки, либо посредством защиты рибосом одним или несколькими растворимыми белками, так называемыми белками защиты рибосом (RPP), либо посредством ферментативной инактивации тетрациклина.

Недавно в изолятах рубца Butyrivibrio fibrisolvens и ряда других бактерий рубца был выявлен новый ген устойчивости к тетрациклину (Tet^r) по типу защиты рибосом, tetW (Barbosa, 1999).

Несмотря на то, что детерминанта tetW широко распространена среди устойчивых к тетрациклину изолятов патогенов животных (Billington, 2002), для авторов настоящей заявки было удивительным обнаружить, что все известные пробиотические штаммы Bifidobacterium animalis subs. lactis, включая два широко известных штамма Bifidobacterium Bb-12® и DR10™, обладают функциональной детерминантой tetW и являются устойчивыми к тетрациклину; особенно потому, что в недавнем отчете сообщалось, что штамм DR10™, а также штамм Bb-12® являются чувствительными к тетрациклину (Zhou et al. 2005).

Даже несмотря на то, что обширные эксперименты показали, что детерминанта tetW штамма Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® не способна к перемещению в природных условиях, проблема устойчивых к антибиотикам детерминант в продуктах питания все еще остается. Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли несколько подходов для осуществления инактивации или удаления гена tetW в Bifidobacterium animalis подвида lactis Bb-12® посредством классического мутагенеза, вовлекающего различные мутагены, а также посредством прямых генетических манипуляций. Однако до настоящего времени все попытки были безуспешными. Полагают, что важной причиной многих безуспешных попыток является тот факт, что tetW расположен на хромосоме пробиотических штаммов Bifidobacterium animalis subs. lactis.

Таким образом, создание способа инактивации гена устойчивости tetW в пробиотических Bifidobacteriacea обеспечило бы значительное преимущество. Более того, такой способ может помочь в решении проблемы получения чувствительных к антибиотикам вариантов представляющих коммерческий интерес пробиотических устойчивых к тетрациклину Bifidobacteriacea, которые могут удовлетворять требованию отсутствия функциональных генов устойчивости к антибиотикам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Указанная выше проблема была решена посредством предоставления способа выделения чувствительного к тетрациклину штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea) из устойчивого к тетрациклину бактериального штамма-предшественника, где причиной устойчивого к антибиотику фенотипа является экспрессия функционального tetW, который стабильно интегрирован в хромосому, где указанный способ включает в себя воздействие на клетки как химического мутагена, так и физического мутагена. Предпочтительно, химический мутаген содержит бромид этидия (EtBr), а физическим мутагеном является УФ-излучение.

Этот способ является, главным образом, применимым в отношении устойчивых к тетрациклину Bifidobacterium sp. с функциональным tetW, стабильно встроенным в их хромосому, поскольку в каждом из двух экспериментов по мутагенезу, которые авторы настоящего изобретения проводили с помощью этого способа, можно было выделить чувствительные к тетрациклину варианты двух штаммов Bifidobacterium: Bb-12® и HN019 (DR10™).

Таким образом, следующими важными аспектами этого изобретения является предоставление штаммов Bifidobacterium sp., содержащих мутантный кодируемый хромосомой tetW, обеспечивающий чувствительность штамма к тетрациклинам, которые получают указанным выше способом, и применение таких штаммов Bifidobacterium для получения материала для употребления внутрь или лекарственного средства.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceae), где указанный способ включает в себя оказание воздействия химического мутагена и физического мутагена на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения клетки Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW, где указанный способ включает в себя стадии:

a) инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp., содержащей функциональный ген tetW, посредством воздействия на клетку химического мутагена и физического мутагена,

b) выделения мутантной клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), которая обладает инактивированным геном tetW.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения чувствительной к тетрациклину клетки Bifidobacterium sp., где указанный способ включает в себя стадии:

a) воздействия на клетку Bifidobacterium sp. химического мутагена и физического мутагена, где клетка Bifidobacterium sp. обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 4 микрограмма тетрациклина/мл или более,

b) выделения мутантной клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), где указанная мутантная форма обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., которая обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp., содержащей мутантный кодируемый хромосомой tetW, придающий клетке чувствительность к тетрациклинам, получаемой способом по настоящему изобретению.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium, которая является чувствительной к тетрациклинам вследствие мутации в tetW, где указанная клетка Bifidobacterium получена из клетки-предшественника, которая является устойчивой к тетрациклинам вследствие наличия гена tetW, расположенного на хромосоме.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению клетки Bifidobacterium в соответствии с настоящим изобретением для получения материала для употребления внутрь или бактериальной культуры.

В девятом аспекте настоящее изобретение относится к продукту питания или корму, содержащему бактериальную клетку по настоящему изобретению.

В десятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве пробиотической клетки.

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, включающему в себя введение клетки Bifidobacterium sp. в соответствии с настоящим изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceae), где указанный способ включает в себя воздействие химического мутагена и физического мутагена на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения клетки Bifidobacterium sp., содержащей инактивированный ген tetW, где указанный способ включает в себя стадии:

a) инактивации гена tetW в клетке Bifidobacterium sp., содержащей функциональный ген tetW, посредством воздействия на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW, химического мутагена и физического мутагена,

b) выделения мутантной формы клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), которая обладает инактивированным геном tetW.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу получения чувствительной к тетрациклину клетки Bifidobacterium sp., где указанный способ включает в себя стадии:

a) воздействия на клетку Bifidobacterium sp. химического мутагена и физического мутагена, где клетка Bifidobacterium sp. обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 4 микрограмма тетрациклина/мл или более,

b) выделения мутантной формы клетки Bifidobacterium sp., полученной на стадии a), где указанная мутантная форма обладает минимальной ингибирующей концентрацией, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

Причина возможных сложностей при внесении мутации в ген tetW в клетке Bifidobacterium sp. может заключаться в том, что ген расположен на хромосоме клеток.

Таким образом, в способе по настоящему изобретению функциональный ген tetW может быть расположен на хромосоме клетки Bifidobacterium sp.

Таким образом, в способе по настоящему изобретению инактивированный ген tetW может быть расположен на хромосоме клетки Bifidobacterium sp.

Термин "инактивированный ген tetW" в контексте настоящего изобретения относится к гену tetW, который, при наличии в клетке, не способен выполнять его нормальную функцию.

В частности, инактивированный ген tetW представляет собой ген, который, по сравнению с функциональным геном tetW, содержит мутацию в открытой рамке считывания (ORF) гена, где указанная мутация может представлять собой мутацию со сдвигом рамки считывания, внесение стоп-кодона или мутацию, которая приводит к неконсервативной аминокислотной замене. Неконсервативную аминокислотную замену определяют как замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком со сходными химическими свойствами (например, размером, зарядом или полярностью), которая, в целом, не изменяет функциональных свойств белка.

В частности, инактивированный ген tetW представляет собой ген tetW, который, если находится в клетке, придает указанной клетке чувствительность к тетрациклину.

Термин "функциональный ген tetW" в контексте настоящего изобретения относится к гену tetW, который, если находится в клетке, придает клетке устойчивость к тетрациклину. В частности, функциональный ген tetW может представлять собой ген, содержащий открытую рамку считывания (ORF), которая обладает последовательностью, соответствующей положению 1318-3234 в SEQ ID NO:22, или последовательностью, которая обладает 30%, как, например, 40%, или 50%, или 60%, или 70%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 99% гомологией последовательности, соответствующей положению 1318-3234 в SEQ ID NO:22.

Для целей настоящего изобретения можно проводить выравнивание последовательностей и вычисление показателей гомологии с использованием полного выравнивания Смита-Ватермана, пригодного для выравнивания как белков, так и ДНК. Стандартные оценочные матрицы BLOSUM50 и матрицу идентичности использовали для выравнивания белков и ДНК соответственно. Штраф за делецию первого остатка составляет 12 для белков и 16 для ДНК, а штраф за дополнительные остатки в области делеции составляет 2 для белков и 4 для ДНК. Выравнивание можно проводить с помощью программного обеспечения FASTA версии v20u6 (W.R.Pearson and D.J.Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, и W.R.Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183: в направлении 3' или N-конец -> C-конец нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, соответственно.

Результатом настоящего изобретения является то, что автор изобретения может предоставить, в целом, пригодный способ выделения штамма Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea), который содержит мутантный tetW на хромосоме, который придает штамму чувствительность к тетрациклинам и который выделен из устойчивого к тетрациклину бактериального штамма-предшественника, где устойчивый к антибиотику фенотип вызван экспрессией tetW, стабильно интегрированного в хромосому.

Указание на "штамм-предшествинник" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как указание на клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW, устойчивую к тетрациклину клетку Bifidobacterium sp. или клетку Bifidobacterium sp., которая обладает значением MIC, составляющим 4 микрограмма тетрациклина/мл или более.

Указание на "чувствительный к антибиотику штамм" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как указание на клетку Bifidobacterium sp., содержащую инактивированный ген tetW, чувствительную к тетрациклину клетку Bifidobacterium sp. или клетку Bifidobacterium sp., которая обладает значением MIC, составляющим 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка Bifidobacterium может представлять собой штамм.

В следующем варианте осуществления способы по настоящему изобретению могут после стадии a) дополнительно включать в себя стадии:

i) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналога пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и

ii) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде, в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствии пенициллина или аналога пенициллина, такого как ампициллин.

Термин "оказывающий отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки" в контексте настоящего изобретения относится к соединениям, способным снижать скорость экспоненциального роста клеток.

Термин "переносимый" в контексте настоящего изобретения относится к соединениям, которые оказывают критическое воздействие на бактерии.

В одном варианте осуществления способы по настоящему изобретению могут включать в себя стадии:

i) культивирования клеток-предшественников или клетки Bifidobacterium sp., содержащей функциональный ген tetW или обладающей минимальной ингибирующей концентрацией 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, с получением культуры экспоненциально растущих клеток,

ii) переноса аликвоты клеток, полученной на стадии i), в свежую среду, содержащую химический мутаген,

iii) переноса культуры, полученной на стадии ii), в один или несколько контейнеров для образования слоя культуры толщиной 0,5-10 мм,

iv) воздействия на культуру(ы) стадии iii) физического мутагена,

v) культивирования мутантных клеток, полученных на стадии iv), с получением культуры экспоненциально растущих клеток,

vi) переноса аликвоты бактерий стадии v) в одну или несколько чашек Петри, содержащих пригодную среду для роста на основе агара, где аликвота бактерий выбрана для получения единичных колоний,

vii) идентификации тех колоний стадии vi), которые обладают приобретенной чувствительностью к антибиотику, посредством копирования посевов на чашках Петри с антибиотиком и без него и

viii) выделения и выращивания клеток, полученных на стадии vii).

Химический и физический мутаген может представлять собой мутаген, как описано в разделе, описывающем химические и физические мутагены, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению. Может быть предпочтительным поддержание и сохранение чувствительных к антибиотикам колоний, полученных на стадии viii).

Этот процесс также можно описать следующим образом: 1) культивирование клеток-предшественников с получением культуры экспоненциально растущих клеток, 2) перенос аликвоты клеток в свежую среду, содержащую бромид этидия (EtBr), 3) перенос культуры в один или несколько контейнеров для образования слоя культуры толщиной 0,5-10 мм, 4) обработка культуры УФ-излучением, 5) культивирование мутантных клеток с получением культуры экспоненциально растущих клеток, 6) перенос аликвоты бактерий в одну или несколько чашек Петри с получением единичных колоний, 7) идентификация тех колоний, которые обладают приобретенной чувствительностью к антибиотику, посредством копирования посевов на чашках Петри с антибиотиком и без него и 8) выделение, выращивание и хранение тех чувствительных к антибиотикам колоний, которые идентифицированы как новый чувствительный к антибиотику штамм.

В следующем варианте осуществления культуру полученную на стадии iv) или 4), можно подвергать стадии накопления мутаций, включающей в себя стадии:

iva) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналогов пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и

ivb) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствие пенициллина или аналога пенициллина, такого как ампициллин.

В данной области для определения минимальной ингибиторной концентрации (MIC)

противомикробных средств используют тесты с разведениями, и они представляют собой стандартные способы для тестирования чувствительности к антибиотикам. В тестах с разведениями микроорганизмы тестируют на их способность проявлять видимый рост в пригодной среде и наименьшую концентрацию противомикробного средства, которая ингибирует рост микроорганизма, определяют как MIC. Термины минимальная ингибиторная концентрация, минимальная ингибирующая концентрация и MIC в контексте настоящего изобретения могут использоваться взаимозаменяемо. MIC (минимальную ингибиторную концентрацию) можно рассматривать как наименьшую концентрацию конкретного соединения, которая приводит к ингибированию видимого роста, или как минимальную концентрацию антибактериального средства в данной культуральной среде, ниже которой ингибирования бактериального роста не происходит.

Для определения значения MIC конкретного соединения существуют различные способы анализа. В контексте настоящего изобретения значение MIC, в частности, можно определять в соответствии со способом скрининга чувствительности Etest, описанным Danielsen and Wind (2003). Способ скрининга чувствительности Etest включает в себя стадии:

a) погружения стерильного хлопкового тампона в культуру чувствительного к тетрациклину подлежащего тестированию штамма, который выращивали в течение ночи,

b) проведения штрихового посева на всей поверхности чашки с агаром MRS (диаметр: 8,5 см) равномерно по трем направлениям с помощью хлопкового тампона стадии a),

c) нанесения полоски E-test на поверхность агара с помощью ручного аппликатора со шкалой MIC, обращенной кверху, после высыхания посевной культуры, нанесенной на стадии b),

d) засевания чашки с агаром в анаэробных или микроаэробных условиях в перевернутом положении при 37°C в течение ночи,

e) определения значения MIC посредством определения пересечения краем эллипса ингибирования полоски.

Этот способ и полоска Etest также описаны в EP 157071, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Другой способ определения минимальной ингибиторной концентрации описан в FR-A-2264089, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Выражение "устойчивый к тетрациклину" относится к бактерии, которая обладает минимальной ингибиторной концентрацией (MIC) тетрациклина по меньшей мере более чем 4 мкг/мл (EFSA, 2005), например, по меньшей мере 5 микрограмм/мл, как, например, по меньшей мере 8 микрограмм/мл, включая по меньшей мере 10 микрограмм/мл или также по меньшей мере 15 микрограмм тетрациклина/мл. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют посредством способа скрининга чувствительности Etest, как описано Danielsen and Wind (2003).

Таким образом, клетка Bifidobacterium sp., содержащая функциональный ген tetW, в частности, может обладать минимальной ингибирующей концентрацией, как описано выше.

В контексте настоящего изобретения выражение "чувствительный к тетрациклинам" относится к бактерии, которая обладает MIC, составляющей 1,5 микрограмм/мл или менее, как, например, 1 микрограмм/мл или также менее чем 0,75 микрограмм/мл конкретного тетрациклина из группы тетрациклинов. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют способом скрининга чувствительности Etest.

Конкретно, выражение "чувствительный к тетрациклину" относится к бактерии, которая обладает MIC, составляющей 1,5 микрограмма тетрациклина/мл или менее, как, например, 1 микрограмм/мл или также менее чем 0,75 микрограмма тетрациклина/мл. Значение MIC, в частности, может представлять собой значение, как определяют способом скрининга чувствительности Etest.

Таким образом, клетка Bifidobacterium sp., содержащая инактивированный ген tetW, в частности, может обладать минимальной ингибирующей концентрацией, как описано выше.

Как показано в примере 12, до настоящего момента все мутации, которые характеризуются определенной посредством Etest минимальной ингибирующей концентрацией (MIC), которая является равной или составляет менее 1,5 мкг tet/мл, содержали мутантный tetW. Это позволяет проводить процесс селекции, который приводит к селекции чувствительных к тетрациклину штаммов Bifidobacteria, которые с высокой вероятностью содержат инактивированный ген tetW. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя селекцию чувствительных к тетрациклину мутантных форм, которые, наиболее вероятно, содержат мутантный ген tetW. Этот способ селекции может включать в себя представленные ниже стадии, таким образом, стадия b) в способе по настоящему изобретению, описанная выше, может, в частности, дополнительно включать в себя стадии:

i) определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) бактерий посредством способа скрининга чувствительности Etest,

ii) разделения бактерий на два класса, исходя из результата скрининга чувствительности Etest:

Класс 1: бактерии с MIC, составляющей 1,5 мкг/мл или менее в соответствии с Etest, и

Класс 2: бактерии с MIC более 1,5 мкг/мл в соответствии с Etest; и

iii) идентификации и выращивания чувствительных к антибиотикам бактерий, выявленных в ii), с MIC, составляющей 1,5 мкг/мл или менее (Класс 1).

Кроме того, может быть предпочтительным хранение чувствительных к антибиотикам бактерий, полученных на стадии iii).

"Тетрациклины" или "группа тетрациклиновых антибиотиков" относятся к группе бактериостатических антибиотиков, продуцируемых видами Streptomyces, и к сходным с ними полусинтетическим производным. Тетрациклины ингибируют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, а также риккетсии. Они характеризуются способом действия, который предполагает обратимое связывание антибиотика с рибосомой 30S и ингибирует связывание аминоацил-тРНК с акцепторным участком на рибосоме 70S. В дополнение непосредственно к тетрациклину членами группы тетрациклинов считают террамицин, демеклоциклин, меклоциклин, доксициклин/доксициклин, лимециклин, метациклин, миноциклин, окситетрациклин, ролитетрациклин, ауреомицин, а также другие хлортетрациклины. Таким образом, вариантом осуществления настоящего изобретения также является способ, где тетрациклины представляют собой антибиотики, выбранные из группы, состоящей, но не ограничивающейся ими, тетрациклина, террамицина, демеклоциклина, меклоциклина, доксициклина/доксициклина, лимециклина, метациклина, миноциклина, окситетрациклина, ролитетрациклина, ауреомицина и других хлортетрациклинов.

Предпочтительным типом тетрациклинов является тетрациклин.

Как упоминалось, перед тем как способ был разработан, потребовалось несколько попыток. Полагают, что именно совместное действие как химического, так и физического мутагена, например, бромида этидия и ультрафиолетового излучения, повышает вероятность успешной мутации гена tetW.

Для дальнейшего повышения вероятности успеха культуру или клетку Bifidobacterium sp., содержащую функциональный ген tetW или обладающую значением MIC 4 микрограмма тетрациклина/мл или более, можно после стадии мутации, т.е. стадии воздействия на указанную культуру или клетку химического и физического мутагена, подвергать стадии накопления мутаций, включающей в себя стадии: a) переноса аликвоты обработанной УФ-излучением культуры в свежую среду, содержащую дозу аналога пенициллина, которая оказывает отрицательное воздействие на экспоненциально растущие клетки, но к которой устойчивы нерастущие клетки, и b) культивирования клеток в указанной содержащей аналог пенициллина среде в условиях, которые обеспечивают экспоненциальный рост в отсутствие аналога пенициллина.

Поскольку такой "процесс селекции с ампициллином" широко распространен и его часто использовали для грамотрицательных бактерий с 1972 года (Miller 1972), удивительно, что "процесс селекции с ампициллином", насколько известно авторам настоящего изобретения, ранее не применяли в протоколе мутаций, направленном против грамположительных Bifidobacteriaceae. Несмотря на то, что некоторые Bifidobacteriacea могут расти в аэробных условиях, считают предпочтительным, чтобы культуру выращивали при пониженном давлении кислорода, например, посредством дополнения среды для выращивания гидрохлоридом цистеина, как описано в примере 1.

В общем, полагают, что подход двойного мутагенеза по настоящему изобретению является более эффективным, чем когда мутагены используют по отдельности.

Химический мутаген по существу может представлять собой любое химическое соединение, способное приводить к мутациям в нуклеиновых кислотах, в частности, в ДНК. В частности, химический мутаген может представлять собой интеркалирующий поглощающий УФ-излучение мутаген, т.е. химическое соединение, способное как интеркалировать в нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, так и поглощать УФ-излучение. Без связи с какой-либо теорией автор настоящего изобретения полагает, что посредством сочетания интеркалирующих поглощающих УФ-излучение соединений в качестве химических мутагенов и УФ-излучения в качестве физического мутагена можно достичь определенной степени специфичности последовательности в отношении мутации последовательности нуклеиновой кислоты, такой как ДНК. Например, бромид этидия (EtBr), который представляет собой интеркалирующее поглощающее УФ-излучение соединение, обычно не случайным образом интеркалирует в ДНК. Как правило, количество EtBr, который интеркалирует в ДНК, зависит от степени сверхспирализации ДНК. Поскольку степень сверхспирализации ДНК, по меньшей мере в эукариотах, коррелирует с уровнем экспрессии конкретного гена, полагают, что это может привести к определенной степени специфичности последовательности в отношении области, в которой EtBr интеркалирует в ДНК. Наличие интеркалированного в последовательность ДНК EtBr, как правило, приводит к мутации(ям) последовательности ДНК в той области, где интеркалирует EtBr, при воздействии на указанную последовательность УФ-излучения. Более того, EtBr, как правило, интеркалирует в областях участка поли-dA - поли-dT последовательностей ДНК, или по меньшей мере степень интеркаляции EtBr в таких последовательностях является низкой по отношению к другим последовательностям.

Примеры пригодных интеркалирующих поглощающих УФ-излучение соединений включают в себя, но не ограничиваются ими, бромид этидия (EtBr), этидий, профлавин, дауномицин, адриамицин, актиномицин, эллиптицин, тилорон, m-AMSA, митрамицин, нетропсин, иредиамин A, антрамицин, стрептонигрин, блеомицин, дитеркалиний, триостин и эхиномицин. Другие примеры таких пригодных соединений приведены в US 5391723, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Физический мутаген по настоящему изобретению в конкретном варианте осуществления может представлять собой неионизирующее излучение с длиной волны короче 800 нм. Примером такого физического мутагена является УФ-излучение.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения химический мутаген представляет собой интеркалирующее поглощающее УФ-излучение соединение, такое как любое из упомянутых выше примеров, и физический мутаген представляет собой неионизирующее излучение с длиной волны короче 800 нм, такое как УФ-излучение. В следующем варианте осуществления химический мутаген представляет собой EtBr и физический мутаген представляет собой УФ-излучение.

Как показано в примере 1, комбинированное воздействие EtBr и УФ-излучения значительно снижает жизнеспособность клеток после обработок EtBr-УФ. Полагают, что такой эффективный двойной подход позволяет сделать вывод, что можно достичь эффективной инактивации гена tetW в Bifidobacteriacae. Таким образом, в одном важном варианте осуществления настоящего изобретения обработку УФ-излучением подбирают таким образом, чтобы вызвать снижение количества живых клеток, как измеряют с помощью колониеобразующих единиц (CFU), до менее чем 20%, как, например, менее чем 15% или даже менее чем 10% относительно количества CFU в культуре непосредственно перед обработкой УФ-излучением. В одном варианте осуществления этот подбор обработки УФ-излучением можно проводить на стадии iv) способа.

В предпочтительном варианте осуществления концентрацию EtBr доводят до концентрации между 10 и 30 микрограмм/мл. В следующих вариантах осуществления аналог пенициллина, используемый в "процессе накопления с ампициллином" представляет собой ампициллин, который, в частности, можно использовать в дозе 50-300 микрограмм/мл в среде, в частности, эту дозу ампициллина можно использовать совместно с концентрацией EtBr 10-30 микрограмм/мл.

Устойчивость к тетрациклину и окситетрациклину была выявлена в штаммах Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis и их подвидов (Yazid (2000), Lim (1983), Scott (2000), это исследование). TetW был выявлен в устойчивых к тетрациклину штаммах Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis (Scott et al. 2000, Moubareck et al. 2005). Однако устойчивость к тетрациклину не является свойственной пробиотическим штаммам Bifidobacterium. Moubareck (2005) описывает, что пробиотические Bifidobacteria, как правило, оказываются более чувствительными к антибиотикам, и было описано, что два хорошо известных пробиотических штамма Bifidobacteria, Bifidobacterium animalis supsp. lactis Bb-12® и DR10™ являются чувствительными к тетрациклину (Zhou et al. 2005). Также Moubareck (2005) не выявил tetW в Bifidobacterium animalis. Однако удивительно, в настоящем исследовании описано, что также пробиотические штаммы Bifidobacterium, включая пробиотические штаммы Bifidobacterium animalis, такие как штамм Bifidobacterium animalis supsp. lactis Bb-12® и DR10™, содержат функциональный tetW, придающий бактерии устойчивость к тетрациклину.

Таким образом, в предпочтительных в настоящем описании вариантах осуществления бактериальные виды выбраны из группы, состоящей из Bifidobacteriacea,