Способы применения агонистов аро-2l-рецепторов и активаторов nk-клеток

Способы применения агонистов аро-2l-рецепторов и активаторов nk-клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

В соответствии с разделом 119(е), в этой заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 60/581129, поданной 18 июня 2004 г., содержание которой включено сюда в качестве ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Это изобретение относится в целом к способам усиления индукции апоптоза или цитолитической активности в клетках млекопитающих. В частности, оно относится к применению агонистов Apo-2L-рецепторов и NK-клеток (естественных киллерных) или активирующих их агентов для индукции апоптоза или цитолитической активности в клетках млекопитающих. Различные агонисты Apo-2L-рецепторов, предусмотренные изобретением, включают в себя лиганд, известный как Apo-2-лиганд, или TRAIL, а также агонистические антитела, направленные на один или более Apo-2L-рецепторов. Различные активирующие NK-клетки агенты, предусмотренные изобретением, включают в себя, без ограничения, агенты, активирующие Toll-рецепторы, IL-2, IL-12, IL-15, IFN-альфа, IFN-бета и агонистические антитела к активирующим рецепторам, таким как NKp30, NKp44, NKG2D.

Предпосылки изобретения

Считается, что регуляция количества клеток у млекопитающих частично определяется балансом между клеточной пролиферацией и гибелью клеток. Одна из форм гибели клеток, иногда именуемая некротической гибелью клеток, обычно характеризуется как патологическая форма гибели клеток в результате некоторой травмы или клеточного повреждения. Напротив, существует другая, «физиологическая» форма гибели клеток, которая обычно происходит упорядоченным или регулируемым образом. Эта упорядоченная или регулируемая гибель клеток часто именуется «апоптозом» [см., например, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller et al., Science, 267:1445-1449 (1995)]. Апоптотическая гибель клеток естественным образом происходит при многих физиологических процессах, включая эмбриональное развитие и клональный отбор в иммунной системе [Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)].

Различные молекулы, такие как фактор некроза опухоли альфа («TNF-альфа»), фактор некроза опухоли бета («TNF-бета» или «лимфотоксин-альфа»), лимфотоксин-бета («LT-бета»), лиганд CD30, лиганд CD27, лиганд CD40, лиганд OX-40, лиганд 4-1BB, лиганд Apo-1 (также именуемый Fas-лигандом или лигандом CD95), Аро-2-лиганд (также именуемый Apo2L, или TRAIL), лиганд Apo-3 (также именуемый TWEAK), APRIL, лиганд OPG (также именуемый лиганд RANK, ODF или TRANCE) и TALL-1 (также именуемый BlyS, BAFF или THANK) были идентифицированы как члены семейства факторов некроза опухоли ("TNF") цитокинов [см., например, Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633, опубликованная 16 января 1997 г; WO 97/25428, опубликованная 17 июля 1997 г; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO 98/28426, опубликованная 2 июля 1998 г; WO 98/46751, опубликованная 22 октября 1998 г.; WO 98/18921, опубликованная 7 мая 1998 г.; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)]. Сообщалось, что среди этих молекул, TNF-альфа, TNF-бета, лиганд CD30, лиганд 4-1BB, лиганд Apo-1, Аро-2-лиганд (Apo2L/TRAIL), лиганд Apo-3 (TWEAK) участвуют в апоптотической гибели клеток.

Apo2L/TRAIL был идентифицирован несколько лет назад как член семейства цитокинов TNF [см., например, Wiley et al., Immunity, 3:673-682(1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); патент США № 6284236, выданный 4 сентября 2001 г.]. Нативная последовательность полной длины человеческого полипептида Apo2L/TRAIL представляет собой трансмембранный белок типа II длиной в 281 аминокислоту. Некоторые клетки могут продуцировать природную, растворимую форму этого полипептида посредством ферментативного расщепления внеклеточной области полипептида [Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)]. Кристаллографические исследования растворимых форм Apo2L/TRAIL выявляют гомотрехмерную структуру, аналогичную структурам TNF и других родственных белков [Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)]. Однако было обнаружено, что Apo2L/TRAIL, в отличие от других членов семейства TNF, имеют необычный структурный признак в том, что 3 цистеиновых остатка (в положении 230 каждой субъединицы в гомотримере) вместе координируют атом цинка и что связывание цинка важно для трехмерной устойчивости и биологической активности [Hymowitz et al., выше, Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)].

В литературе сообщалось, что Apo2L/TRAIL может играть роль в модуляции иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит [см., например, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

Сообщалось также, что растворимые формы Apo2L/TRAIL вызывают апоптоз в разнообразных раковых клетках in vitro, включая опухоли толстой кишки, легких, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почек, яичников и мозга, а также меланому, лейкоз и множественную миелому [см., например, Wiley et al., выше; Pitti et al., выше; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)]. Исследования in vivo на мышиных моделях опухолей, кроме того, свидетельствуют о том, что Apo2L/TRAIL, отдельно или в комбинации с химиотерапией или лучевой терапией, может оказывать существенные противоопухолевые эффекты [см., например, Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., выше; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)]. В отличие от многих типов раковых клеток оказывается, что большинство нормальных типов человеческих клеток устойчивы к индукции апоптоза определенными рекомбинантными формами Apo2L/TRAIL [Ashkenazi et al., выше; Walzcak et al., выше]. Jo et al. сообщили, что меченная полигистидином растворимая форма Apo2L/TRAIL вызывала апоптоз in vitro в нормальных изолированных гепатоцитах человека в отличие от нечеловеческих гепатоцитов [Jo et al., Nature Med., 6: 564-567 (2000); см. также Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)]. Считается, что определенные препараты рекомбинантного Apo2L/TRAIL могут варьировать с точки зрения биохимических свойств и биологической активности в отношении пораженных патологией клеток, в сравнении со здоровыми клетками, в зависимости, например, от присутствия или отсутствия молекулы метки, содержания цинка и % содержания тримера [см., Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)].

Считается, что индукция различных клеточных реакций, опосредованных цитокинами семейства TNF, инициируется их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Были идентифицированы 2 различных рецептора TNF приблизительно в 55 кДа (TNFR1) и 75 кДа (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417563, опубликована 20 марта 1991 г.] и были выделены и охарактеризованы человеческие и мышиные кДНК, соответствующие обоим типам рецепторов [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Обширный полиморфизм был связан с генами обоих рецепторов TNF [см., например, Takao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)]. Оба TNFR имеют типичную структуру рецепторов клеточной поверхности, включая внеклеточную, трансмембранную и внутриклеточную области. Внеклеточные части обоих рецепторов естественно обнаруживаются, также как растворимые белки, связывающие TNF [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); и Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87:8331 (1990)]. О клонировании рекомбинантных растворимых рецепторов TNF сообщалось ранее Hale et al. [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)].

Внеклеточная часть TNFR типа 1 и типа 2 (TNFR1 и TNFR2) содержит повторяющийся тип аминокислотной последовательности четырех богатых цистеином доменов (CRD), обозначенных с 1 по 4, начиная с NH₂-конца. Каждый CRD имеет длину примерно в 40 аминокислот и содержит 4-6 цистеиновых остатков в положениях, которые являются весьма консервативными [Schall et al., выше; Loetscher et al., выше; Smith et al., выше; Nophar et al., выше, Kohno et al., выше]. В TNFR1 приблизительные границы четырех CRD следующие: CRD1 - аминокислоты от 14 до примерно 53; CRD2 - аминокислоты примерно от 54 до примерно 97; CRD3 - аминокислоты примерно от 98 до примерно 138; CRD4 - аминокислоты примерно от 139 до примерно 167. В TNFR2 CRD1 включает аминокислоты с 17 до примерно 54; CRD2 - аминокислоты примерно от 55 до примерно 97; CRD3 - аминокислоты примерно от 98 до примерно 140 и CRD4 - аминокислоты примерно от 141 до примерно 179 [Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)]. Возможная роль CRD в связывании лиганда также описана Banner et al., выше.

Аналогичный повторяющийся тип CRD существует в нескольких других белках клеточной поверхности, включая рецептор фактора роста нервов (NGFR) р.75 [Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)], антиген CD 40 В-клеток [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)], антиген ОХ40 Т-клеток [Mallet et al., EMBO J., 9:1063 (1990)] и Fas-антиген [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169:1747-1756 (1989) и Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)]. CRD также обнаруживаются в растворимых, подобных TNFR (sTNRF) белках поксвирусов Shope и миксомы [Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al., Virology, 184:370 (1991)]. Оптимальное выравнивание этих последовательностей указывает на то, что положения цистеиновых остатков весьма консервативны. Эти рецепторы иногда совместно именуются членами суперсемейства рецепторов TNF/NGF. Недавно проведенные исследования на p75NGFR показали, что делеция CRD1 [Welcher, A.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159-163 (1991)] или инсерция 5-аминокислоты в этот домен [Yan, H. and Chao, M.V., J. Biol. Chem., 266:12099-12104 (1991)] оказывают небольшой или не оказывают эффекта на связывание NGF [Yan, H. and Chao, M.V., см. выше]. p75 NGFR содержит богатый пролином фрагмент секвенирования примерно из 60 аминокислот, между его CRD4 и трансмембранной областью, которая не участвует в связывании NGF [Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988); Seckinger, P. et al., J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989); Yan, H. and Chao, M.V., выше]. Аналогичная богатая пролином область обнаруживается в TNFR2, но не в TNFR1.

Лиганды семейства TNF, идентифицированные к настоящему времени, за исключением лимфотоксина-α, представляют собой трансмембранные белки II типа, чей С-конец является внеклеточным. Напротив, большинство рецепторов в семействе рецепторов TNF (TNFR), идентифицированных к настоящему времени, представляют собой трансмембранные белки I типа. Однако в обоих семействах лигандов и рецепторов гомология, идентифицированная между членами семейств, главным образом обнаруживалась во внеклеточном домене ("ECD"). Несколько цитокинов семейства TNF, включая TNF-α, лиганд Apo-1 и лиганд CD40, протеолитически расщепляются на клеточной поверхности; полученный белок в каждом случае обычно образует гомотримерную молекулу, которая функционирует в качестве растворимого цитокина. Белки семейства рецепторов TNF также обычно протеолитически расщепляются с высвобождением растворимых рецепторов ECD, которые могут функционировать в качестве ингибиторов родственных цитокинов.

Недавно были идентифицированы другие члены семейства TNFR. Такие вновь идентифицированные члены семейства TNFR включают CAR1, HVEM и остеопротегерин (OPG) [Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al., Cell, 87:427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997); Simonet et. al., Cell, 89:309-319 (1997)]. В отличие от других известных молекул, подобных TNFR, Simonet et al. (см. выше) сообщают, что OPG не содержит гидрофобной трансмембранной последовательности. Считают, что OPG действует в качестве рецептора-приманки, как описано ниже.

Pan et al. раскрыли другой член семейства рецепторов TNF, именуемого "DR4" [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]. Сообщалось, что DR4 содержит домен цитоплазматической гибели, способный запускать аппарат клеточного суицида. У Pan et al. раскрыто, что CD4 считается рецептором для лиганда, известного как Аро-2-лиганд, или TRAIL.

В публикациях Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) и Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) описана другая молекула, которая, как считают, представляет собой рецептор для Apo-2L/TRAIL [см. также WO 98/51793, опубликованную 19 ноября, 1998 г.; WO 98/41629, опубликованную 24 сентября 1998 г.]. Эта молекула именуется DR5 [она также альтернативно именовалась Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER [Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованная 20 августа 1998 г.; ЕР 870827, опубликованная 14 октября 1998 г.; WO 98/46643, опубликованная 22 октября 1998 г.; WO 99/02653, опубликованная 21 января 1999 г.; WO 99/09165, опубликованная 25 февраля 1999 г.; WO 99/11791, опубликованная 11 марта 1999 г.]. Сообщается, что, аналогично DR4, DR5 содержит домен цитоплазматической гибели и способен передавать сигналы апоптоза. Кристаллическая структура комплекса, сформированного между Apo-2L/TRAIL и DR5, описана в публикации Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

Еще одна группа недавно идентифицированных членов семейства TNFR именуется «рецепторами-приманками», которые, как считается, функционируют в качестве ингибиторов, а не передатчиков сигнализации.. Эта группа включает DCR1 [также именуемые TRID, LIT или TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997) и Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)] и DCR2 (также называемые TRUNDD или TRAIL-R4) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], обе молекулы клеточной поверхности, а также OPG [Simonet et al., см. выше] и DCR3 [Pitti et al., Nature, 396:699-703 (1998)], обе из которых представляют собой секретируемые, растворимые белки. Сообщалось, что Apo-2L/TRAIL связывает те рецепторы, которые именуются DcR1, DcR2 и OPG.

Считается, что Apo-2L/TRAIL действует через «рецепторы гибели» клеточной поверхности DR4 и DR5 для активации каспаз, или ферментов, которые выносят внутриклеточную программу гибели клетки [см., например, Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)]. После связывания лиганда и DR4, и DR5 могут независимо запускать апоптоз вовлечением и активацией инициатора апоптоза, каспазы-8, посредством содержащей домен гибели адапторной молекулы, именуемой FADD/Mort1 [Kischkel et al., Immunity, 12:611-620(2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]. В отличие от DR4 и DR5 рецепторы DcR1 и DcR2 не передают сигналы апоптоза.

Обзор семейства цитокинов TNF и их рецепторов можно найти в публикациях см., Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Gruss and Dower, выше, и Nagata, Cell, 88:355-365 (1997); Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Wallach, "TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families", Cytokine Research, Academic Press, pages 377-411 (2000).

Ряд молекул в семействе рецепторов Toll (TLR) были идентифицированы у человека, из них TLR 2, 4, 5 и 9, как считают, активируются высококонсервативными микробными продуктами, такими как соответственно липопротеины, LPS (липополисахариды), флагеллин и неметилированная ДНК CpG. TLR3 может активироваться двунитевой РНК, часто продуцируемой во время репликации вирусов, в то время как TLR7 может активироваться низкомолекулярными соединениями, такими как противовирусные имидазохинолины: имихимод и R-848. Человеческий TLR8 может также активироваться R-848, и последние сообщения демонстрируют, что однонитевая РНК представляет физиологический лиганд для TLR8.

TLR широко экспрессированы на клетках, которые важны для врожденных реакций на патогены. На представляющих антиген клетках ("APC") активация различных TLR приводит к разнообразным реакциям, включая продукцию цитокинов и ко-стимуляторные молекулы, которые инициируют и направляют адаптивную реакцию на определенные патогены. NK-клетки также экспрессируют члены семейства TLR. Очищенные NK-клетки экспрессируют TLR3, и их цитолитическая активность в отношении определенных опухолевых клеток может быть активирована под действием поли(I:C).

NK-клетки используют ряд активирующих и ингибиторных рецепторов для идентификации и устранения клеток-мишеней. Один класс активирующих рецепторов, которые запускают цитотоксичность NK, именуются NCR (рецепторами естественной цитотоксичности), которые включают в себя члены семейства иммуноглобулинов NKp46, NKp30 и NKp44 и лектин С-типа, NKG2D. Активности NCR противодействует сигнализация от ингибиторных рецепторов, специфичных для классических молекул класса I MHC (главного комплекса гистосовместимости), которые конститутивно экспрессируются нормальными клетками. Зависимый от перфорина путь экзоцитоза цитотоксических гранул представляет собой хорошо охарактеризованный механизм, посредством которого NK-клетки уничтожают клетки-мишени. Цитотоксические гранулы представляют собой специализированные секреторные лизосомы, которые содержат образующий поры белок перфорин, и семейство сериновых протеаз, известных как гранзимы, которые запускают быстрый апоптоз в клетках-мишенях. NK-клетки также используют «перфориннезависимые» механизмы клеточной поверхности для индукции цитотоксичности в клетках-мишенях.

Краткое описание сущности изобретения

Авторы изобретения обнаружили, что Аро-2-лиганд или другие агонисты рецепторов Apo-2L и NK-клетки или активирующие их агенты можно эффективно использовать в комбинации для индукции апоптоза или цитолитической активности в клетках млекопитающих, в частности, в пораженных клетках млекопитающих.

Изобретение предоставляет разнообразные способы для применения Аро-2-лиганда и NK-клеток или активирующего NK-клетки агента(ов) для усиления апоптоза или цитолитической активности в клетках млекопитающих. Например, изобретение предоставляет способы индукции апоптоза, включающие в себя приведение клетки млекопитающего, такой как раковая клетка или клетка, инфицированная вирусом или бактерией, в контакт с NK-клетками или активирующим NK-клетки агентом(ами) и одним или более агонистами рецепторов Аро-2-лиганда.

Клетки могут находиться в клеточной культуре или у млекопитающего, например, млекопитающего, страдающего раком или состоянием, при котором желательна индукция апоптоза в клетках. Таким образом, изобретение включает в себя способы лечения млекопитающего, страдающего расстройством, таким как рак или вирусная инфекция, включающие в себя введение эффективного количества Аро-2-лиганда и NK-клеток или активирующего NK-клетки агента(ов), как описано здесь.

Необязательно в способах может использоваться агонистическое антитело(антитела) против рецептора Аро-2-лиганда. Таким образом, изобретение предоставляет различные способы применения антитела(антител) против рецептора Аро-2-лиганда и NK-клеток или активирующего NK-клетки агента(агентов) для индукции апоптоза в клетках млекопитающих. В предпочтительном варианте осуществления агонистическое антитело должно включать в себя антитело против рецепторов DR4 или DR5.

В необязательных вариантах осуществления предоставляются способы усиления апоптоза в раковых клетках млекопитающих, включающие в себя приведение раковых клеток млекопитающих в контакт с эффективным количеством NK-клеток или активирующего NK-клетки агента(агентов) и агониста рецепторов Аро-2-лиганда, где указанные раковые клетки млекопитающих контактируют с NK-клетками или активирующим NK-клетки агентом(агентами) перед контактом с указанным агонистом рецепторов Аро-2-лиганда. Агонист рецепторов Аро-2-лиганда необязательно включает в себя полипептид Apo-2L или антитело против рецептора DR4 или антитело против рецептора DR5.

Изобретение также связано с композициями, которые включают в себя Аро-2-лиганд или агонистическое антитело против рецептора Apo-2L и/или NK-клетки или активирующий NK-клетки агент(агенты). Необязательно, композиции согласно изобретению включают в себя фармацевтически приемлемые носители или разбавители. Предпочтительно композиции включают в себя Аро-2-лиганд или агонистическое антитело и/или NK-клетки или активирующий NK-клетки агент(агенты) в количестве, которое эффективно для синергической индукции апоптоза в клетках млекопитающих.

Изобретение также предоставляет изготовляемые изделия и наборы, которые включают в себя Аро-2-лиганд или агонистическое антитело против рецептора Apo-2L и/или NK-клетки или активирующий NK-клетки агент(агенты).

Другие необязательные варианты осуществления иллюстрируются следующими способами:

1. Способ усиления апоптоза или цитотоксичности в клетках млекопитающих, включающий в себя приведение клеток млекопитающих в контакт с эффективным количеством агониста рецепторов Аро-2-лиганда и NK-клеток или активирующего NK-клетки агента(агентов).

2. Способ по п.1, где указанный агонист рецепторов Аро-2-лиганда включает в себя полипептид Apo-2-лиганда.

3. Способ по п.1, где указанные клетки млекопитающих представляют собой раковые клетки.

4. Способ по п.1, где указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки, инфицированные вирусами или инфицированные бактериями.

5. Способ по п.2, где указанный полипептид Apo-2-лиганда включает в себя [последовательность] аминокислот с 39 по 281 на фиг.4 или ее биологически активный фрагмент.

6. Способ по п.5, где указанный полипептид Apo-2-лиганда включает в себя аминокислоты с 114 по 281 на фиг.4.

7. Способ по п.5, где указанный полипептид Apo-2-лиганда связан с одной или более молекулами полиэтиленгликоля (PEG).

8. Способ по п.1, где указанный агонист рецепторов Аро-2-лиганда представляет собой агонистическое антитело против рецептора Аро-2-лиганда.

9. Способ по п.8, где указанное агонистическое антитело включает в себя антитело против DR4.

10. Способ по п.8, где указанное агонистическое антитело включает в себя антитело против DR5.

11. Способ по п.9, где указанное антитело против DR4 представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

12. Способ по п.10, где указанное антитело против DR5 представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

13. Способ по п.1, где указанные NK-клетки представляют собой очищенные NK-клетки от млекопитающего донора.

14. Способ по п.1, где указанный агент, активирующий NK-клетки, выбран из группы, состоящей из агентов, активирующих Toll-рецепторы, IL-2, IL-12, IL-15, IFN-альфа и IFN-бета.

15. Способ по п.1, где указанный агент, активирующий NK-клетки, выбран из группы, состоящей из агонистических антител к активирующим рецепторам, таким как NKp30, NKp44, NKG2D.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны эффекты различных активаторов TLR на активность человеческих NK-клеток, по данным анализа высвобождения ⁵¹Cr.

Фиг.2А-С иллюстрируют индукцию Apo2L/TRAIL на человеческих NK-клетках. (А) NK-клетки были обработаны поли(I:C), R-848 или человеческим интерфероном-альфа в присутствии или в отсутствие циклогексамида и Apo2L/TRAIL, передача сигналов измерялась в экстрагированной РНК. (В) Покоящиеся и стимулированные поли(I:C) лизаты NK-клеток или надосадочные жидкости культур оценивали для выявления присутствия белка Apo2L/TRAIL методом количественной ВЭЖХ. (С) Окрашивание для выявления Apo2L/TRAIL клеточной поверхности на очищенных NK-клетках, обработанных агентом, указанным в соответствующей панели. Жирная линия соответствует изотипическому контролю, а более тонкая линия - окрашиванию Apo2L/TRAIL. Результаты, показанные на все трех панелях, представляют собой репрезентативного донора (из трех или более доноров).

Фиг.3А-С иллюстрируют результаты анализа, показывающего роль Apo2L/TRAIL в активности активированных NK-клеток. (А) % лизиса, полученного при соотношении Е:Т 50:1. (В) Очищенные NK-клетки, обработанные поли(I:C) или R-848 и инкубированные с клетками B16BL10 в указанных соотношениях.. (С) Очищенные NK-клетки, стимулированные R-848, инкубировали с клетками-мишенями НСТ116 в указанных соотношениях. Роль Apo2L/TRAIL в анализах лизиса на панелях В и С определяли предварительной инкубацией с нейтрализующими и ненейтрализующими антителами против Apo2L/TRAIL. Данные были подтверждены NK-клетками по меньшей мере от 3 доноров, и наблюдалось SD (стандартное отклонение) менее чем 5%.

На фиг.4 показана нуклеотидная последовательность кДНК человеческого Аро-2-лиганда (SEQ ID NO:1) и происходящей из нее аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2). Нуклеотид "N" в положении 447 используется для указания, что нуклеотидное основание может представлять собой "T" или "G".

На фиг.5А и 5В показана нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO:3) для человеческого DR4 полной длины и происходящей из нее аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:4). Соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности для человеческого DR4 описаны в публикации Pan et al., Science, 276:111 (1997).

На фиг.6 показана последовательность из 411 аминокислот человеческого DR5 (SEQ ID NO:5), как опубликовано в WO 98/51793 19 ноября 1998 г.

На фиг.7 показан транскрипционный вариант сплайсинга человеческого DR5. Этот вариант сплайсинга DR5 кодирует последовательность из 440 аминокислот человеческого DR5 (SEQ ID NO:6), как опубликовано в WO 98/35986 20 августа 1998 г.

Фиг.8А иллюстрирует эффекты указанных агентов на клетки меланомы В16 и свидетельствует о том, что клетки были лизированы активированными NK-клетками зависимым от Apo2L/TRAIL образом. На фиг.8В показаны результаты анализа, где клетки В16 метили ⁵¹Cr и культивировали с очищенными покоящимися или стимулированными NK-клетками в указанных соотношениях. Роль Apo2L/TRAIL оценивали, предварительно инкубируя NK-клетки или с нейтрализующим (5C2), или с не нейтрализующим (1D1) mAb. % Лизиса наносили на график, и результаты являются репрезентативными для 3 экспериментов (SD составляет менее 5%). Как показано на фиг.8В, указанные линии клеток и дендритные клетки (DC), полученные из первичных моноцитов, меченных ⁵¹Cr и инкубированных с варьируемыми концентрациями растворенного белка Apo2L/TRAIL (указанными как "sApo2L") в течение 4 ч. Затем надосадочные жидкости оценивали на предмет высвобождения Cr. Аналогичные результаты цитолиза были получены по меньшей мере в 3 экспериментах.

Фиг.9А представляет собой диаграмму по результатам количественного анализа, свидетельствующую о том, что цитотоксические гранулы активированных NK-клеток могут быть существенными для лизиса 4Т1-клеток. Цитолитическую активность покоящихся и активированных NK-клеток оценивали против клеток-мишеней 4Т1. Активированные NK-клетки обрабатывали ингибиторами созревания перфорина (конканамицином А), GraB (Z-AAD-FMK), PI3K (вортманнин), киназой МЕК1 (PD98059), киназой S6 (рапамицином) и JNK (SP) для оценки роли цитотоксических гранул. Отношение E/T составило 25 к 1, и показанные результаты получены от одного репрезентативного донора (из трех доноров). Фиг.9В иллюстрирует результаты количественного анализа, свидетельствующие о том, что активированные NK-клетки способны индуцировать активацию каспазы-3 в клетках 4Т1. Клетки-мишени 4Т1 обрабатывали белком Apo2L/TRAIL (100 нг/мл) или активированными NK-клетками ("Act NK") в течение 30 мин, 1 ч или 4 ч. Отношение E/T составило 10:1. Экстракты клеток 4Т1 анализировали SDS-PAGE (электрофорезом на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и анализом иммуноблоттинга для выявления про-каспазы-3, расщепленной каспазы-3 и расщепленной PARP (полимеразы поли(АДФ-рибозы)).

На фиг.10 показаны результаты количественного анализа расщепления PARP. Клетки 4Т1 обрабатывали Apo2L/TRAIL, покоящимися NK-клетками ("NK") или активированными NK-клетками ("Act NK"), отдельно или в комбинации. Лизаты анализировали для выявления расщепления PARP, показатель активации каспазы-3. Использовали NK-клетки от множественных доноров, и показаны результаты от одного репрезентативного донора.

Подробное описание изобретения

I. Определения

Термины «апоптоз» и «апоптотическая активность» используются в широком смысле и относятся к упорядоченной или регулируемой форме гибели клеток у млекопитающих, которая обычно сопровождается одним или более характерными изменениями клеток, включая конденсацию цитоплазмы, потерю микроворсинок плазматической мембраны, сегментацию ядра, расщепление хромосомной ДНК или потерю функции митохондрий. Эту активность можно определить и измерить, используя методики, известные в данной области, например, анализами жизнеспособности клеток, FACS-анализом (с использованием сортера клеток по интенсивности флюоресценции) или электрофорезом ДНК, а конкретнее связыванием аннексина V, фрагментацией ДНК, расщеплением PARP, сморщиванием клеток, расширением эндоплазматической сети, фрагментацией клеток и/или формированием мембранных пузырьков (называемых апоптотическими телами). Эти методики и количественные анализы описаны в данной области, например, в WO 97/25428 и WO 97/01633.

Используемый здесь термин «синергия», или «синергизм», или «синергически» относится к взаимодействию двух или более агентов, при котором их комбинированный эффект больше, чем сумма эффектов, которые возникают в результате такой же обработки с использованием соответствующих агентов раздельно.

Термины «Apo-2-лиганд», «Apo-2L» или "TRAIL" используются здесь для обозначения полипептида, который включает в себя аминокислотные остатки 95-281 включительно, 114-281 включительно, остатки 91-281 включительно, остатки 92-281 включительно, остатки 41-281 включительно, остатки 15-281 включительно, или остатки 1-281 включительно, аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1А публикации Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) (представленной здесь на фиг.4), а также биологически активные (например, имеющие апоптотическую активность) фрагменты, делеционные, инсерционные или заместительные варианты указанных выше последовательностей. В одном варианте осуществления полипептидная последовательность включает в себя остатки 114-281 на фиг.4. Необязательно полипептидная последовательность имеет по меньшей мере остатки 91-281 или остатки 92-281. В другом предпочтительном варианте осуществления биологически активные фрагменты или варианты имеют степень идентичности аминокислотных последовательностей, составляющую по меньшей мере примерно 80%, предпочтительнее, по меньшей мере 90%, а еще предпочтительнее, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, с одной из последовательностей, представленных выше. Это определение охватывает заместительные варианты Аро-2-лиганда, включающие в себя аминокислоты 91-281 на фиг.1А в публикации Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) (представленной здесь на фиг.4), в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 203, 218 или 269 (пользуясь нумерацией последовательности, представленной на фиг.4) замещены аланиновым остатком. Это определение охватывает Аро-2-лиганд, выделенный из источника Аро-2-лиганда, такого как из типов тканей человека, или из другого источника, или полученный рекомбинантными или синтетическими способами. Аро-2-лиганд может, например, представлять собой растворимый полипептид или быть экспрессирован на клеточной поверхности клеток млекопитающих. Термин Аро-2-лиганд также относится к полипептидам, описанным в приведенных выше документах WO 97/25428 и WO 97/01633. Предусматривается, что полипептид Аро-2-лиганда может быть связан с одной или более молекул полимера, такого как полиэтиленгликоль.

«Степень (%) идентичности аминокислотной последовательности» в отношении идентифицированной здесь полипептидной последовательностей Apo-2L определяется как процентная доля аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности Apo-2L после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимальной процентной идентичности, при этом не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения степени идентичности аминокислотной последовательности можно достичь различными путями, которые входят в объем навыков в данной области, например, общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Необязательно, величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 была утверждена Genentech, Inc., и код источника был подан с документацией пользователя в US Copyright Office, Washington, D.C., 20559) Агентство США по Авторским Правам, где он зарегистрирован под № US Copyright Registration No TXU510087 (регистрационным номером авторского права). Программа ALIGN-2 общедоступна через компанию Genentech, Inc., South San Francisco, California. Программу ALIGN-2 следует составить для использования на операционной системе UNIX, предпочтительной, цифровой UNIX V4.OD. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не изменяются. Однако % идентичность аминокислотных последовательностей можно также определить, используя программу сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Программу сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 можно загрузить с сайта Интернета http://www.ncbi.nlm.nih.gov. В NCBI-BLAST2 используются несколько параметров поиска, где все из этих параметров поиска установлены на величины по умолчанию, включая, например, раскрыть = да, нити = все, ожидаемые частоты встречаемости = 10, минимальная длина низкой сложности = 15/5, е - величина множественного прохождения = 0,01, константа множественного прохождения = 25, выпадение для конечного выравнивания с гэпами = 25 и матрица балльной оценки = BLOSUM62.

Термин «антитело» при использовании в отношении «агонистического антитела против рецептора Apo-2-лиганда» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, пока они связывают один или более рецепторов Apo-2-лиганда и/или способны активировать путь передачи сигналов апоптоза клетки млекопитающего, экспрессирующие один или более рецепторов Apo-2-лиганда или имитировать (например, иметь сравнимую или по меньшей мере равную) апоптотическую активность Apo-2-лиганда или иметь большую апоптотическую активность, чем активность Apo-2-лиганда.

«Рецептор Apo-2-лиганда» включает в себя рецепторы, именуемые в данной области "DR4" "и DR5". Pan et al. описали член семейства рецепторов TNF, именуемый "DR4" [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); см. также документ WO 98/32856, опубликованный 30 июля 1998 г]. Сообщалось, что рецептор DR4 содержит домен цитоплазматической гибели, способный приводить в действие аппарат клеточного суицида. Pan et al. раскрывают, что DR4 считают рецептором для лиганда, известного как Apo2L/TRAIL. Аминокислотная последовательность рецептора DR4 полной длины представлена здесь в виде фиг.5. Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) и Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) описали другой рецептор для Apo2L/TRAIL [см. также WO 98/51793, опубликованный 19 ноября 1998 г.; WO 98/41629, опубликованный 24 сентября 1998 г.]. Этот рецептор именуется DR5 (этот рецептор также альтернативно именовался Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 или KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986, опубликованный 20 августа 1998 г. (соответствующий выданному патенту США № 6072047); ЕР 870827, опубликованный 14 октября 1998 г.; WO 98/46643, опубликованный 22 октября 1998 г.; WO 99/02653, опубликованный 21 января 1999 г.; WO 99/09165, опубликованный 25 февраля 1999 г.; WO 99/11791, опубликованный 11 марта 1999 г.]. Сообщается, что DR5, как и DR4, содержит домен цитоплазматической гибели и способен передавать сигналы апоптоза. В WO 98/35986 (соответствующем патенту США № 6072047) сообщается, что последовательность полной длины рецептора DR5 представляет собой полипептид из 440 аминокислот и что эта аминокислотная последовательность представлена на фиг.7. В WO 98/51793 сообщается, что последовательность полной длины рецептора DR5 представляет собой полипептид из 411 аминокислот и что эта аминокислотная последовательность представлена на фиг.6. Как описано выше, другие рецепторы для Apo-2L включают в себя DcR1, DcR2 и OPG [см. Sheridan et al., выше Marsters et al., выше; и Simonet et al., выше]. При использовании здесь термин «рецептор Apo-2L» охватывает рецептор нативной последовательности и варианты рецептора. Эти термины охватывают рецептор Apo-2L, экспрессированный у разнообразных млекопитающих, включая людей. Рецептор Apo-2L может быть эндогенно экспрессирован, как естественно происходит в разнообразных линиях дифференцировки человеческих тканей, или может быть экспрессирован рекомбинантными или синтетическими способами. «Рецептор Apo-2L с нативной последовательностью» включает в себя полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и природный рецептор Apo-2L. Таким образом, рецептор Apo-2L с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность природно встречающегося рецептора Apo-2L из любого животного. Такой рецептор Apo-2L с нативной последовательностью можно выделить в природе или получить рекомбинантными или синтетическими средствами. Термин «рецепто