Молекула адгезии т-клеток и антитело, направленное против молекулы

Молекула адгезии т-клеток и антитело, направленное против молекулы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

ТЕХНИЧЕСКАЯ ОБЛАСТЬ

Настоящее изобретение относится к молекуле адгезии T-клеток, которая экспрессируется на дендритных клетках, происходящих из костного мозга, и ее гену, и лиганду для молекулы адгезии (рецептору), который экспрессируется на T-клетках, и его гену. Настоящее изобретение также относится к антителам против молекулы адгезии или лиганда и их применению. Более того, настоящее изобретение также относится к способу скрининга с использованием молекулы адгезии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последние годы сообщалось, что молекула, клонированная как активатор дендритных клеток, которая экспрессируется на T-клетках, является основным цитокином для регуляции дифференцировки остеокластов (Yasuda, H., et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:3597-3602). Таким образом, стало ясно, что иммунная система тесно связана с метаболизмом костей.

Исследования регуляции метаболизма костей посредством молекул, регулирующих иммунную систему, быстро развивались и передача сигнала, связанная с регуляцией дифференцировки остеокластов, стала очевидной.

Например, в качестве молекулы, вовлеченной в дифференцировку остеокластов, стал известен Oscar (ассоциированный с остеокластами рецептор). К настоящему времени получены данные, что Oscar является иммуноглобулинподобным рецептором, который ассоциирован с цепью FcRγ и передает сигнал на фосфолипазу Cγ посредством мотива ITAM цепи FcRγ (Kim, N., et al. (2002) J Exp Med 195:201-209).

Кроме того, сообщалось о различных взаимодействиях, таких как CD80-CD28, CD40-CD40L или ICAM1-LFA1, для молекул, которые экспрессируются на дендритных клетках и связываются с T-клетками, таким образом, оказываясь вовлеченными во взаимодействие между T-клетками и дендритными клетками, связанное с иммунным ответом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения способом вычитания идентифицировали ген, который специфически экспрессируется на дендритных клетках, происходящих из костного мозга. Также авторы настоящего изобретения обнаружили, что белок, кодируемый вышеупомянутым геном, связывается с цепью FcRγ, составляющей рецептор IgE, что экспрессию вышеупомянутого белка усиливает стимуляция с помощью LPS, что дендритные клетки активируются перекрестной стимуляцией антителами к вышеупомянутому белку, что вышеупомянутый белок обладает функцией связывания с T-клетками и что антитела против вышеупомянутого белка обладают терапевтическим эффектом на модели индуцированного коллагеном артрита, которая является моделью заболевания ревматоидного артрита. Авторы настоящего изобретения далее идентифицировали ген лиганда для вышеупомянутого белка, который экспрессируется на T-клетках. Настоящее изобретение основано на этих открытиях.

Настоящее изобретение относится к мембранному или секреторному белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6 или SEQ ID № 8, или аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6 или SEQ ID № 8, которая содержит одну или несколько консервативных замен (в дальнейшем обозначенному как новый белок первого варианта осуществления согласно настоящему изобретению).

Настоящее изобретение относится к мембранному или секреторному белку, выбранному из следующего (i), (ii), (iii) и (iv) (в дальнейшем обозначенному как новый белок второго варианта осуществления согласно настоящему изобретению):

(i) мембранный или секреторный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 10;

(ii) мембранный или секреторный белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 10, в которой одна или несколько аминокислот вставлены, заменены или удалены, или одна или несколько аминокислот добавлены к одному или обоим концам, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10;

(iii) мембранный или секреторный белок, который кодируется полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, который кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID № 10 и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10; и

(iv) мембранный или секреторный белок, который содержит аминокислотную последовательность, обладающую 90% или большей идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 10, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему новые белки первого и второго вариантов осуществления согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, выбранному из следующего (v), (vi), (vii) и (viii):

(v) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID № 9;

(vi) полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID № 9, в которой один или несколько нуклеотидов вставлены, заменены или удалены, или один или несколько нуклеотидов добавлены к одному или обоим концам, и который кодирует мембранный или секреторный белок, функционально эквивалентный белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10;

(vii) полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID № 9 и который кодирует мембранный или секреторный белок, функционально эквивалентный белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10; и

(viii) полинуклеотид, который обладает 90% или большей идентичностью с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID № 9, и который кодирует мембранный или секреторный белок, функционально эквивалентный белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10.

Настоящее изобретение также относится к антителам против мембранного или секреторного белка, выбранного из следующего (ix), (x), (xi) и (xii) (в дальнейшем иногда обозначенного как белок TARM (взаимодействующий с T-клетками активирующий рецептор на миелоидных клетках)), и их функциональному фрагменту (в дальнейшем обозначенным как антитела первого варианта осуществления согласно настоящему изобретению):

(ix) мембранный или секреторный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12;

(x) мембранный или секреторный белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, в которой одна или несколько аминокислот вставлены, заменены или удалены, или одна или несколько аминокислот добавлены к одному или обоим концам, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12;

(xi) мембранный или секреторный белок, который кодируется полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, который кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12; и

(xii) мембранный или секреторный белок, который содержит аминокислотную последовательность, обладающую 70% или большей идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12.

Настоящее изобретение относится к новому белковому лиганду, который является лигандом для нового белка согласно настоящему изобретению, который выбран из следующего (xiii), (xiv), (xv) и (xvi) (в дальнейшем иногда обозначается как новый белковый лиганд согласно настоящему изобретению или белок TARM-L (лиганд TARM)):

(xiii) белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16;

(xiv) белок, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, в которой одна или несколько аминокислот вставлены, заменены или удалены, или одна или несколько аминокислот добавлены к одному или обоим концам, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16;

(xv) белок, который кодируется полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, который кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16; и

(xvi) белок, который содержит аминокислотную последовательность, обладающую 70% или большей идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, и который функционально эквивалентен белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему новый белковый лиганд согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, выбранному из следующего (xvii), (xviii), (xix) и (xx):

(xvii) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15;

(xviii) полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15, в которой один или несколько нуклеотидов вставлены, заменены или удалены, или один или несколько нуклеотидов добавлены к одному или обоим концам, и который кодирует белок, функционально эквивалентный белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16;

(xix) полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15, и который кодирует белок, функционально эквивалентный белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16; и

(xx) полинуклеотид, который обладает 70% или большей идентичностью с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15, и который кодирует белок, функционально эквивалентный белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16.

Настоящее изобретение относится к антителам против нового белкового лиганда согласно настоящему изобретению и их функциональному фрагменту (в дальнейшем обозначенным как антитела второго варианта осуществления согласно настоящему изобретению).

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству при аутоиммунных заболеваниях и средству для ингибирования адгезии T-клеток, содержащему в качестве активных ингредиентов антитела первого и второго вариантов осуществления согласно настоящему изобретению (в дальнейшем оба вида антител можно обозначить как «антитела согласно настоящему изобретению»), или их функциональные фрагменты.

Настоящее изобретение относится к следующим способам скрининга.

Согласно способу скрининга по первому варианту осуществления согласно настоящему изобретению предложен способ скрининга вещества или его соли, или его сольвата, которое ингибирует адгезию T-клетки к белку TARM, который включает стадии:

(a) контактирование T-клетки с белком TARM в присутствии или в отсутствие тестируемого вещества; и

(b) измерение активности связывания T-клетки с указанным белком TARM.

Согласно способу скрининга по второму варианту осуществления согласно настоящему изобретению предложен способ скрининга вещества или его соли, или его сольвата, которое ингибирует активацию дендритной клетки, который включает стадии:

(d) контактирование антител или их функционального фрагмента согласно настоящему изобретению с дендритной клеткой в присутствии или в отсутствие тестируемого вещества; и

(e) измерение уровня активации указанной дендритной клетки.

Согласно способу скрининга по третьему варианту осуществления согласно настоящему изобретению предложен способ скрининга вещества или его соли, или его сольвата, которое ингибирует образование комплекса между белком TARM и цепью FcRγ, который включает стадии:

(g) контактирование антител или их функционального фрагмента согласно настоящему изобретению с дендритной клеткой в присутствии или в отсутствие тестируемого вещества; и

(h) измерение уровня экспрессии цепи FcRγ в указанной дендритной клетке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлены аминокислотные последовательности генов TARM мыши (m1-m4 и s1), в которых подчеркивание указывает на область структуры петли иммуноглобулина (IG), и жирный шрифт указывает на трансмембранную область.

На фиг.2 представлены результаты, полученные анализом экспрессии мРНК TARM в тканях мыши с помощью PCR в реальном времени с использованием набора праймеров 1.

На фиг.3 представлены результаты, полученные анализом экспрессии мРНК TARM в различных типах клеток с помощью PCR в реальном времени с использованием набора праймеров 1.

На фиг.4A представлены структура и номера аминокислот внеклеточной области, используемой при получении антител анти-TARM. На фиг.4B представлены результаты, полученные при изучении специфичности вышеупомянутых антител к белку TARM.

На фиг.5 представлены результаты, полученные анализом экспрессии белков мыши на дендритных клетках, происходящих из костного мозга.

На фиг.6 представлены результаты, полученные анализом экспрессии белков мыши на клетках, происходящих из нормальных иммунных тканей мыши.

На фиг.7 представлены результаты, полученные анализом экспрессии белка мыши на c-kit-положительных перитонеальных тучных клетках.

На фиг.8 представлены результаты, полученные анализом экспрессии белка TARM мыши в клетках лимфатических узлов мыши при помощи воспалительной стимуляции посредством LPS, где стрелки указывают на экспрессию белка TARM мыши.

На фиг.9A представлена индукция продукции IL-6 зрелыми дендритными клетками из костного мозга при помощи стимуляции антителами анти-TARM. На фиг.9B представлена индукция продукции MCP-1 незрелыми дендритными клетками из костного мозга при помощи стимуляции антителами анти-TARM.

На фиг.10 представлены увеличения количества цепи FcRγ, связанные с возрастаниями экспрессии белка TARM мыши на поверхности клеток.

На фиг.11 представлены результаты, полученные анализом образования комплекса между белком TARM мыши и цепью FcRγ с помощью способа иммунопреципитации.

На фиг.12 представлены результаты, полученные анализом экспрессии молекул, связывающихся с белком TARM мыши, на активированных T-клетках.

На фиг.13 представлена способность активированных T-клеток связываться с белком TARM мыши.

На фиг.14 представлено ингибирование адгезии клеток Th2 к белку TARM мыши с помощью антител к TARM мыши.

На фиг.15 представлены внешние показатели и изменения в массе тела с течением времени у модельного животного для индуцированного коллагеном артрита, которому вводили антитела TARM мыши.

На фиг.16 представлен эффект введения антител к TARM мыши модельному животному для индуцированного коллагеном артрита на концентрации сывороточного амилоида A в его плазме.

На фиг.17 представлен эффект введения антител к TARM мыши модельному животному для индуцированного коллагеном артрита на титры антител к коллагену в его плазме.

На фиг.18 представлены результаты, полученные анализом экспрессии мРНК белка TARM в тканях человека с помощью PCR в реальном времени.

На фиг.19 представлены аминокислотные последовательности белка TARM человека, где подчеркивание указывает на область структуры петли иммуноглобулина (Ig), жирный шрифт указывает на трансмембранную область и обведенная часть указывает на последовательности, отличающиеся между hTARM и LOC441864.

На фиг.20 представлена способность активированных T-клеток связываться с белком TARM человека и ингибирование адгезии T-клеток к белку TARM человека с помощью антител к TARM человека.

На фиг.21A представлены результаты, полученные анализом экспрессии молекул, связывающихся с белком TARM мыши в линиях клеток мыши. На фиг.21B представлены результаты, полученные анализом экспрессии мРНК ENSMUSG00000035095, молекулы-кандидата для mTARM-L в линиях клеток мыши с помощью PCR в реальном времени.

На фиг.22A представлено специфическое связывание химерного белка TARM-AP мыши с клетками B300.19, экспрессирующими mTARM-L. На фиг.22B представлена специфическая клеточная адгезия клеток B300.19, экспрессирующих mTARM-L, к химерному белку TARM-AP мыши.

На фиг.23 представлены результаты, полученные анализом гомологии между белками TARM-L человека и мыши.

На фиг.24 представлены результаты, полученные анализом гомологии между белком TARM человека и белком TARM мыши (m3).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет подробно описано ниже. Следующие описания даны только в качестве примеров для объяснения настоящего изобретения, и, таким образом, такие примеры не предназначены для ограничения настоящего изобретения только вариантами осуществления настоящего изобретения. Все технологические термины, научные термины и технические термины, используемые в настоящем описании, обладают едиными значениями с теми, которые обычно используют специалисты в данной технической области, для которых предназначено настоящее изобретение. Такие термины используют только с целью объяснения конкретных вариантов осуществления, и, таким образом, они не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно осуществлять в различных вариантах осуществления, если только оно не отклоняется от своей сущности. Все ссылки на предшествующий уровень техники и патентная документация, такая как патентные заявки или патентные публикации, цитированные здесь, приведены здесь в качестве ссылки в полном объеме, и их можно использовать для осуществления настоящего изобретения.

[Новые белки и полинуклеотиды]

Среди генов, которые идентифицировали в настоящем изобретении, которые специфически экспрессируются в дендритных клетках, происходящих из костного мозга, ген мышиного происхождения обладает 5 типами изоформ. Такие изоформы гена мышиного происхождения включают m1, m2, m3 и m4, которые являются генами мембраносвязанных белков (мембранных белков), и s1, который является геном белка секреторного типа (секреторного белка). Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности таких изоформ соответствуют последовательностям следующих номеров:

m1 SEQ ID № 11 и 12

m2 SEQ ID № 1 и 2

m3 SEQ ID № 3 и 4

m4 SEQ ID № 5 и 6

s1 SEQ ID № 7 и 8

Среди генов, которые идентифицировали в настоящем изобретении, которые специфически экспрессируются в происходящих из костного мозга дендритных клетках, один тип гена мембранного белка можно упомянуть в качестве гена человеческого происхождения. Нуклеотидная последовательность этого гена и аминокислотная последовательность белка, кодируемого геном, соответствуют представленным на SEQ ID № 9 и 10 соответственно.

Так как нуклеотидная последовательность гена, идентифицированного в настоящем изобретении, кодирует сигнальный пептид, белок, кодируемый вышеупомянутым геном, образует мембранный белок или секреторный белок. C-конец мембранного белка согласно настоящему изобретению модифицирован (например, удалением трансмембранной части) для того, чтобы получить секреторный белок. C-конец секреторного белка согласно настоящему изобретению модифицирован (например, добавлением к нему трансмембранной части) для того, чтобы получить мембранный белок.

В настоящем описании выражения «одна или несколько аминокислот вставлены, заменены или удалены или добавлены к одному или обоим концам» и «один или несколько нуклеотидов вставлены, заменены или удалены, или один или несколько нуклеотидов добавлены к одному или обоим концам» означают, что модификацию осуществляли согласно хорошо известным техническим способам, таким как сайт-специфический мутагенез, или заменой нескольких аминокислот или нуклеотидов до такой степени, чтобы получать их естественным образом. Количество аминокислот или нуклеотидов, которые следует модифицировать, может составлять, например, от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5, и особенно предпочтительно 1 или 2.

Модифицированная аминокислотная последовательность может предпочтительно являться аминокислотной последовательностью, обладающей одной или несколькими (предпочтительно одной или несколькими, или 1, 2, 3 или 4) консервативными заменами в аминокислотной последовательности.

Модифицированная нуклеотидная последовательность может предпочтительно являться нуклеотидной последовательностью, обладающей одной или несколькими (например, от одной до нескольких, или 1, 2, 3 или 4) мутациями, которые не нарушают функции белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID № 10.

В настоящем описании термин «консервативная замена» означает, что один или несколько аминокислотных остатков заменены другими химически сходными аминокислотными остатками так, что функции белка, по существу, не модифицированы. Примеры таких консервативных замен включают случай, где гидрофобный остаток заменен другим гидрофобным остатком, и случай, где определенный полярный остаток заменен другим полярным остатком, обладающим таким же электрическим зарядом. Для каждого типа аминокислот в настоящей технической области известны функционально сходные аминокислоты, которые можно заменить таким образом. Примеры неполярных (гидрофобных) аминокислот включают аланин, валин, изолейцин, лейцин, пролин, триптофан, фенилаланин и метионин. Примеры полярных (нейтральных) аминокислот включают глицин, серин, треонин, тирозин, глутамин, аспарагин и цистеин. Примеры положительно заряженных (основных) аминокислот включают аргинин, гистидин и лизин. Примеры отрицательно заряженных (кислых) аминокислот включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

В настоящем описании термин «гибридизировать» означает гибридизацию с целевым полинуклеотидом в жестких условиях. Конкретно, можно привести в качестве примера полинуклеотид, обладающий, по меньшей мере, 70% или большей, предпочтительно, 80% или большей, более предпочтительно, 85% или большей, более предпочтительно, 90% или большей, более предпочтительно, 95% или большей, особенно предпочтительно, 98% или большей, и, наиболее предпочтительно, 99% или большей идентичностью с целевой нуклеотидной последовательностью, если такую идентичность вычисляют с использованием параметра по умолчанию (инициализации) посредством программного обеспечения для поиска гомологии, такого как FASTA, BLAST или Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)]. Кроме того, термин «в жестких условиях» означает условия, в которых реакцию осуществляют в гибридизационном буфере, который обычно могут использовать специалисты в данной области при температуре от 40°C до 70°C, и, предпочтительно, от 60°C до 65°C, и продукт реакции затем отмывают отмывочным раствором, обладающим концентрацией соли от 15 до 300 ммоль/л и, предпочтительно, от 15 до 60 ммоль/л. Такую температуру и концентрацию соли можно соответствующим образом подобрать в зависимости от длины используемого зонда. Более того, условия для отмывки продукта, полученного гибридизацией, могут представлять собой 0,2 или 2·SSC, 0,1% SDS, и температуру от 20°C до 68°C. Возможно определить жесткие условия (высокая жесткость) или мягкие условия (низкая жесткость) с помощью создания разных условий посредством концентрации соли или температуры, используемых в ходе отмывки. Если такое различие в условиях гибридизации получают посредством концентрации соли, то 0,2·SSC, 0,1% SDS можно использовать в качестве буфера для жесткой отмывки (буфер для отмывки в условиях высокой жесткости), и 2·SSC, 0,1% SDS можно использовать в качестве буфера для мягкой отмывки (буфер для отмывки в условиях низкой жесткости). С другой стороны, если такое различие получают при помощи температуры, то температуру 68°C используют в случае высокой жесткости, температуру 42°C используют в случае умеренной жесткости и комнатную температуру (от 20°C до 25°C) используют в случае низкой жесткости. Во всех трех вышеописанных случаях реакцию можно осуществлять в 0,2·SSC, 0,1% SDS.

Как правило, предгибридизацию осуществляют в тех же условиях, что и гибридизацию. Однако гибридизацию и предварительную отмывку не всегда осуществляют в одинаковых условиях.

Гибридизацию можно осуществлять согласно известному способу. В случае использования коммерчески доступной библиотеки гибридизацию можно осуществлять согласно способу, описанному в прилагаемых инструкциях.

В настоящем описании термин «идентичность» (иногда обозначаемый как «гомология») по отношению к аминокислотным последовательностям и нуклеотидным последовательностям означает степень совпадения между сравниваемыми последовательностями в терминах аминокислотных остатков или нуклеотидных остатков, которые составляют такие последовательности. В то же время принимают во внимание наличие пропуска и свойства аминокислот (Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983)). Для вычисления гомологии можно использовать коммерчески доступные программные продукты для поиска гомологии, такие как BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)), FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69 (1990)) или Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)].

Количественное значение такой «идентичности» можно вычислить с использованием программы поиска гомологии, известной специалистам в данной области. Например, такое количественное значение, как идентичность, можно вычислить с использованием параметра по умолчанию (инициализации) в алгоритме для поиска гомологии BLAST ((инструмент для базового поиска локального выравнивания) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), National Center for Biotechnology Information (NCBI).

В новом белке по второму варианту осуществления согласно настоящему изобретению аминокислотная последовательность, обладающая 90% или большей идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 10, может являться аминокислотной последовательностью, обладающей предпочтительно 95% или большей, особенно предпочтительно 98% или большей и наиболее предпочтительно 99% или большей идентичностью с вышеупомянутой аминокислотной последовательностью.

В полинуклеотиде, кодирующем новый белок по второму варианту осуществления согласно настоящему изобретению, нуклеотидная последовательность, обладающая 90% или большей идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ ID № 9, может являться нуклеотидной последовательностью, обладающей предпочтительно 95% или большей, особенно предпочтительно, 98% или большей, и, наиболее предпочтительно, 99% или большей идентичностью с вышеупомянутой нуклеотидной последовательностью.

В антителах по первому варианту осуществления согласно настоящему изобретению аминокислотная последовательность, обладающая 70% или большей идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, может являться аминокислотной последовательностью, обладающей предпочтительно 80% или большей, более предпочтительно, 85% или большей, более предпочтительно, 90% или большей, более предпочтительно, 95% или большей, особенно предпочтительно, 98% или большей, и, наиболее предпочтительно, 99% или большей идентичностью с вышеупомянутой аминокислотной последовательностью.

В настоящем изобретении, если дана аминокислотная последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, то можно легко определить кодирующую ее нуклеотидную последовательность. Таким образом, можно выбрать различные нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12.

Соответственно полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, содержит не только полную последовательность ДНК SEQ ID № 1, SEQ ID № 3, SEQ ID № 5, SEQ ID № 7, SEQ ID № 9 или SEQ ID № 11, или ее часть, но также последовательность ДНК, кодирующую те же аминокислоты, которая содержит кодон, находящийся с полинуклеотидом в отношении вырожденности в качестве последовательности ДНК. Настоящее изобретение дополнительно включает последовательность РНК, соответствующую такой последовательности ДНК.

Предпочтительный пример полинуклеотида, кодирующего белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID № 1, SEQ ID № 3, SEQ ID № 5, SEQ ID № 7, SEQ ID № 9 или SEQ ID № 11.

В настоящем описании тот факт, функционально эквивалентен или нет конкретный белок белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, можно определить оценкой биологического признака или функций, связанных с экспрессией белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12. Например, это можно определить, обеспечивая экспрессию конкретного белка генно-инженерным способом и затем, оценивая, функционирует или нет вышеупомянутый белок в качестве рецептора, активирующего дендритные клетки. Белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 2, SEQ ID № 4, SEQ ID № 6, SEQ ID № 8, SEQ ID № 10 или SEQ ID № 12, взаимодействует с T-клетками и обладает функцией активации дендритных клеток. Таким образом, для вышеупомянутой оценки можно использовать следующие функции в качестве индикатора:

Функция посредника при адгезии T-клеток (примеры 5, 6, 10 и 11);

Функция активации дендритных клеток перекрестной стимуляцией антителами (пример 3);

Функция образования комплекса с цепью FcRγ (пример 4); или

Совместное использование нескольких или всех вышеупомянутых функций.

[Новый белковый лиганд и полинуклеотид]

Среди генов, которые идентифицировали в настоящем изобретении, которые специфически экспрессируются в активированных T-клетках в виде лигандов для белков TARM, один тип гена мембранного белка можно упомянуть в качестве гена мышиного происхождения. Нуклеотидная последовательность этого гена и аминокислотная последовательность белка, кодируемого геном, являются такими, как представлено на SEQ ID № 13 и 14 соответственно. Кроме того, среди генов, которые специфически экспрессируются на активированных T-клетках в виде лигандов для белков TARM, один тип гена мембранного белка можно упомянуть в качестве гена человеческого происхождения. Нуклеотидная последовательность этого гена и аминокислотная последовательность белка, кодируемого геном, являются такими, как представлено на SEQ ID № 15 и 16 соответственно.

В новом белковом лиганде согласно настоящему изобретению аминокислотная последовательность, обладающая 70% или большей идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, может являться аминокислотной последовательностью, обладающей предпочтительно 80% или большей, более предпочтительно, 85% или большей, более предпочтительно, 90% или большей, более предпочтительно, 95% или большей, особенно предпочтительно, 98% или большей, и, наиболее предпочтительно, 99% или большей идентичностью с вышеупомянутой аминокислотной последовательностью.

В полинуклеотиде, кодирующем новый белковый лиганд согласно настоящему изобретению, нуклеотидная последовательность, обладающая 70% или большей идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15, может являться нуклеотидной последовательностью, обладающей, предпочтительно, 80% или большей, более предпочтительно, 85% или большей, более предпочтительно, 90% или большей, более предпочтительно, 95% или большей, особенно предпочтительно, 98% или большей, и, наиболее предпочтительно, 99% или большей идентичностью с вышеупомянутой нуклеотидной последовательностью.

В настоящем изобретении, если дана аминокислотная последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, то можно легко определить кодирующую ее нуклеотидную последовательность. Таким образом, можно выбрать различные нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16.

Соответственно полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, содержит не только полную последовательность ДНК SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15 или ее часть, но также последовательность ДНК, кодирующую те же аминокислоты, которая содержит кодон, находящийся с полинуклеотидом в отношении вырожденности в качестве последовательности ДНК. Настоящее изобретение дополнительно включает последовательность РНК, соответствующую такой последовательности ДНК.

Предпочтительным примером полинуклеотида, кодирующего белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, является полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID № 13 или SEQ ID № 15.

В настоящем описании тот факт, функционально эквивалентен или нет конкретный белок белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, можно определить оценкой биологического признака или функций, связанных с экспрессией белка, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16. Например, это можно определить, обеспечивая экспрессию конкретного белка генно-инженерным способом и затем оценивая, функционирует или нет вышеупомянутый белок в качестве лиганда на T-клетках для рецептора, активирующего дендритные клетки. Белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 14 или SEQ ID № 16, связывается с белком TARM. Таким образом, для вышеупомянутой оценки функцию связывания с таким белком TARM (пример 12) можно использовать в качестве индикатора.

Новый белковый лиганд согласно настоящему изобретению содержит единственную трансмембранную область, и он экспрессируется на поверхности клеток в том направлении, в котором его N-концевая часть может располагаться во внеклеточном пространстве. Соответственно можно получить антитела против вышеупомянутого белка с использованием вышеупомянутого белка.

Настоящее изобретение относится к белку, содержащему полипептид, состоящий из, по меньшей мере, 6 аминокислотных остатков или всей аминокислотной последовательности из аминокислот с 1 по 159 для SEQ ID № 14 или аминокислот с 1 по 158 для SEQ ID № 16. Вышеупомянутый белок содержит часть, соответствующую внеклеточной области аминокислотной последовательности белка TARM-L, и, таким образом, его можно использовать в качестве антигена для получения антител против вышеупомянутого белка.

Настоящее изобретение относится к применению нового белкового лиганда по настоящему изобретению для получения антител против вышеупомянутого нового белкового лиганда по настоящему изобретению.

[Антитела]

Антитела согласно настоящему изобретению могут специфически узнавать белок TARM или белок TARM-L. Соответственно предпочтительно, чтобы белок TARM или белок TARM-L, используемый для получения антител согласно настоящему изобретению, обладал антигенностью TARM или TARM-L. Такой белок TARM или белок TARM-L включает белок, обладающий аминокислотной последовательностью белка TARM или белка TARM-L, в котором удалены, вставлены, заменены или добавлены один или несколько аминокислотных остатков. Известно, что такой белок сохраняет ту же биологическую активность, как и исходный белок (Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-500; Wang et al. (1984) Science 224:1431-3; Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409-13). Известен способ получения конкретного белка удалением, вставкой, замещением или добавлением одной или нескольких аминокислот по сравнению с исходным белком при сохранении антигенности исходного белка. Например, полинуклеотид, кодирующий мутантный белок, получают сайт-специфическим мутагенезом и затем обеспечивают соответствующим образом экспрессию белка (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2^nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987-1997), Section 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol 154:350-67; Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85:2763-6).

Антитела согласно настоящему изобретению также включают антитела, специфические для части белка TARM или белка TARM-L.

Таким образом, такой белок TARM или белок TARM-L, применяемый для получения антител согласно настоящему изобретению, включает не только полипептид, обладающий полноразмерной аминокислотной последовательностью белка TARM или белка TARM-L, но также полипептидный фрагмент, обладающи