Твердые формы анти-egfr антител

Твердые формы анти-egfr антител

Реферат

Предпосылки изобретения

Изобретение относится к твердым формам антител против рецептора EGF (EGFR), в частности к преципитатам и кристаллам моноклональных антител против рецептора EGF, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) и Mab h425 (EMD 72000), которые приводят к получению биологически активного белка антитела при растворении или суспендировании в водной или неводной среде, получаемых с помощью осаждения антитела и/или одного из его вариантов и/или фрагментов, растворенных или суспендированных в водной среде при использовании осаждающего реагента. Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, включающим, по крайней мере, одну твердую форму упомянутых выше антител в осажденной некристаллической, осажденной кристаллической или в растворенной, или суспендированной форме, и необязательно наполнители и/или вспомогательные вещества, и/или дополнительные фармацевтические активные ингредиенты, а также к способу получения твердых форм анти- EGFRантител в соответствии с изобретением.

Успехи в области биотехнологии сделали возможным в течение последних 10 лет получение ряда белков для фармацевтического применения с помощью методик рекомбинантной ДНК. Белковые лекарственные средства, такие, как моноклональные антитела, используются, например, в терапии опухолей, например, для специфической иммунотерапии или опухолевой вакцинации. Терапевтические белки являются более крупными и более сложными, чем традиционные органические и неорганические активные ингредиенты, они имеют сложные трехмерные структуры и многочисленные функциональные группы, которые определяют биологическую активность белка или, альтернативно, могут вызывать нежелательные эффекты. В процессе получения, хранения и транспортировки белковые лекарственные средства подвергаются многочисленным экзогенным воздействиям, которые могут оказывать снижающее стабильность действие на белковый активный ингредиент. Таким образом, является необходимым досконально изучить случаи и механизмы специфических реакций разложения для того, чтобы сделать возможной стабилизацию белка, например, посредством прибавления определенных стабилизирующих вспомогательных веществ (смотри, например, Manning M.C., Patel К., и Borchardt R.T. (1989) Стабильность белковых лекарственных средств. Pharm. Res. 6, 903-918).

Литературные источники раскрывают многочисленные композиции терапевтических белков. Однако требования к композициям фармацевтических препаратов белковых активных ингредиентов могут быть весьма различными, и в общем случае не является возможным применять уже имеющиеся белковые композиции для новых белковых активных ингредиентов по причине специфических физико-химических свойств и реакций разложения различных белков. Приемлемые фармацевтические композиции и стабильные формы этих новых активных ингредиентов, таким образом, остаются основной проблемой.

Химическая нестабильность отличается ковалентными модификациями белка. Первичная структура белка изменяется при разрыве, образовании или повторном образовании химических связей. Вновь образованное вещество в общем случае полностью отличается по биологической активности от исходного природного белка. Физическая нестабильность модифицирует пространственное расположение молекулы (вторичная, третичная и четвертичная структура) при отсутствии разрушения ковалентных связей. Эта нестабильность может быть разделена на денатурацию, ассоциацию, агрегацию, осаждение или адсорбцию. Физическая нестабильность представляет собой частое явление, в частности, в случае относительно больших белков. Преципитаты представляют собой макроскопически видимый эквивалент агрегатов и образуются механистическим образом кластерами агрегатов или ассоциатов. При превышении границы растворимости и благодаря осаждению хлопья становятся видимыми, начиная от диаметра приблизительно 10 мкм, с помощью светового микроскопа и, начиная от приблизительно 50 мкм, невооруженным глазом. Агрегация белков может представлять собой обратимый или необратимый процесс (смотри, например, Cleland J.L., Powell M.F. и Shire S.J. (1993) Разработка стабильных белковых композиций: широкий взгляд на агрегацию белков, дезамидирование и окисление. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 10, 307-377).

Хотя существующая литература описывает осаждение белков с солями, полимерами и органическими растворителями в качестве стандартного способа для очистки белков (Scopes R.K. (1997) Разделение с помощью преципитации. В:

Очистка белков: Правила и практика (ред. Scopes R.K.), 2-ое изд., стр. 41-71. Springer Verlag, New York), однако использование этого способа обычно приводит, особенно в случае иммуноглобулинов, к денатурации, ассоциированному с этим снижению активности и незначительному количественному выходу, в частности, при использовании солей и органических растворителей (Phillips A.P., Martin K.L., и Horton W.H. (1984) Выбор способов для очистки иммуноглобулина IgG: Выход, чистота и активность антитела. Journal of Immunological Methods 74, 385-393). При использовании полиэтиленгликоля (ПЭГ), в противовес этому, были достигнуты лучшие результаты (A.Poison, G.M.Potgieter, J.F.Largier, и G.E.F.Joubert, F.J.Mears. Фракционирование белковых смесей при использовании линейных полимеров с высокой молекулярной массой. Biochim. Biophys. Acta 82: 463-475, 1964).

Кристаллы белков являются известными для процессов очистки (технология производства и выделения целевого продукта), предпочтительно ферментов, и для определения третичной структуры белков с помощью рентгеноструктурного анализа (R.К.Scopes. Анализ на чистоту: кристаллизация. В: Очистка белков: правила и практика. Под ред. R.К.Scopes, New York: Springer Verlag, 1997, p. 284-301). При этом происходит образование по-новому упорядоченных внутримолекулярных связей между белками. Это является медленным процессом с пониженной мобильностью. Во время этого процесса понижается концентрация белка в растворе.

Несмотря на то, что литературные источники описывают кристаллизацию белков с солями, полимерами и органическими растворителями в качестве стандартного способа определения структуры иммуноглобулинов (Harris L.J., Skaletsky Е., и McPherson A. (1995) Кристаллизация интактных моноклональных антител. Белки: структура, функция и генетика. 23, 285-289; Harris L.J., Skaletsky Е., и McPherson A. (1998) Кристаллографическая структура интактного IgG1 моноклонального антитела. Journal of Molecular Biology 275, 861-872; Edmundson А.В., Guddat L.W., и Andersen K.N. (1993) Кристаллическая структура интактных IgG антител. ImmunoMethods 3, 197-210), кристаллизация интактных, например, гликозилированных антител, однако является крайне сложной, так как размер белка, различные модели гликозилирования индивидуальных молекул антитела, а также ассоциированная с этим микрогетерогенность и структурная гибкость иммуноглобулина делают упорядоченное встраивание в кристаллическую решетку более сложным или даже препятствуют ему (McPherson A. (1999) Кристаллизация биологических макромолекул, 1-ое изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Кроме того, молекулы антитела демонстрируют тенденцию к агрегации, что, вероятно, вызывает большие трудности при кристаллизации (McPherson A. (1999) Кристаллизация биологических макромолекул, 1-ое изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). В дополнение, риск денатурации антител во время процессов кристаллизации делает кристаллизацию терапевтических антител непривлекательной для квалифицированного специалиста в данной области. Таким образом, до настоящего времени только несколько интактных антител были кристаллизованы для изучения структуры, и всего лишь три антитела были до сих пор подвергнуты кристаллизации в препаративных масштабах. Таким образом, иммуноглобулины, приведенные в базе данных кристаллизации биологических макромолекул (Gilliland, G.L., Tung, M., Blakeslee, D.M. и Ladner, J. 1994., База данных кристаллизации биологических макромолекул. Редакция 3.0: Новые характеристики, данные и архив NASA для данных относительно выращивания кристаллов белков. Acta Crystallogr. D50 408-413), которые уже были кристаллизованы, в основном представляют собой Fab и Fc фрагменты.

WO 02072636 описывает кристаллы антитела, которые, однако, были получены при использовании сложного процесса внесения и использования детергентов, которых следует избегать, по мере возможности, в фармацевтических композициях, и вспомогательных веществ, некоторые из которых являются токсикологически неприемлемыми. Кроме того, в описанном процессе нельзя контролировать размер частиц. В контрольном эксперименте (смотри Пример 8) оказалось возможным продемонстрировать факт, что описанные кристаллы игольчатой формы получают как из раствора белка, так и из негативного контроля (при отсутствии белка), используя процесс, описанный в WO 02072636. Из этого факта понятно, что эти кристаллы, по-видимому, в лучшем случае представляют собой белковые включения в кристаллах осаждающего реагента.

По упомянутым выше причинам является понятным, что кристаллизация антител является крайне сложной для специалиста в данной области, и способы кристаллизации, раскрытые в литературе, не могут быть применены ко всем известным антителам по причине значительной гетерогенности различных известных антител в отношении первичной, вторичной и третичной структуры, их гликозилирования и структурной гибкости. Более того, для квалифицированного специалиста в данной области является неприемлемым по указанным выше причинам получать преципитаты терапевтических антител, поскольку, в частности, можно ожидать необратимую денатурацию.

Задача настоящего изобретения, таким образом, заключалась в том, чтобы отыскать стабильные формы, например, преципитатов или кристаллов для терапевтических белков, в частности, антител, так, чтобы их эффективность сохранялась в процессе получения, хранения, транспортировки и применения. Поскольку, как было упомянуто выше, уже существующие композиции белка в общем случае не могут быть использованы для новых белковых активных ингредиентов, дополнительной задачей настоящего изобретения являлось отыскание новых стабильных композиций для моноклональных антител против рецептора EGF, например, Mab C225 (цетуксимаба) и Mab h425 (EMD 72000). Несмотря на то, что композиции, включающие Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), описываются в WO 03053465 и WO 03/007988, композиции, раскрытые в WO 03053465 имеют, однако, относительно низкую концентрацию белка и не являются стабильными в течение длительного периода хранения при комнатной температуре, а композиции, раскрытые в WO 03007988, также имеют низкую концентрацию белка и препарата (лиофилизата), который должен восстанавливаться перед употреблением. Следовательно, дополнительная задача настоящего изобретения заключалась в отыскании стабильного фармацевтического препарата, который имеет высокую концентрацию упомянутых выше антител.

Процесс лиофилизации для стабилизации композиций белка раскрыт, например, в WO 9300807 и WO 9822136, но существенные недостатки лиофилизированных препаратов заключаются в том, что пользователь должен восстанавливать лиофилизат перед употреблением, что представляет собой значительный источник ошибки при получении его перед применением. Поскольку по сравнению с жидкими композициями прибавляется дополнительный процесс получения, этот процесс является нецелесообразным в отношении осуществления дополнительной работы для проведения процесса (подтверждение стабильности в процессе лиофилизации), приготовления (цены препарата и длительности) и, например, его аттестации.

Задача настоящего изобретения, таким образом, заключалась в отыскании жидких форм и композиций для указанных выше антител, которые имеют повышенную стабильность к стрессовым условиям, таким, как повышенная температура, атмосферная влажность и/или сдвиговые силы, и не содержат никаких токсикологически неприемлемых вспомогательных веществ.

Короткое изложение сути изобретения

Неожиданное было обнаружено, что твердые формы и композиции, приготовленные из них, не имеют недостатков, упомянутых в характеристике уровня техники. Твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, описанные ниже, и/или композиции, приготовленные из них, неожиданным образом отличаются одним или более преимуществами, выбранными из: высокой стабильности, контролируемого размера частиц, возможности получения нативного и биологически активного белка после повторного растворения или суспендирования, высокой чистоты, отсутствия фармацевтически неприемлемых агентов и, таким образом, высокой безопасности, хорошей переносимости и возможности непосредственного применения, низкой тенденции к агрегации и, таким образом, возможности получения высококонцентрированных композиций, а также низкой вязкости как композиции, так и белковой суспензии, по сравнению с раствором. Процесс получения в соответствии с изобретением, описанный ниже, неожиданным образом отличается одним или более преимуществами, выбранными из: простоты, сохранения времени и средств, применения фармацевтически приемлемых агентов, высокого выхода. Процесс в соответствии с изобретением может, таким образом, предпочтительно осуществляться с помощью значительно способа, который является более легким, сохраняет время и эффективен в отношении затрачиваемых средств, по сравнению с методами, описанными в литературе, поскольку только прибавление одного осаждающего реагента является необходимым.

В дополнение, осаждающий реагент прибавляется к раствору антитела в приемлемой буферной системе, то есть стабилизация реакционных растворов с помощью дополнительных вспомогательных веществ, таких, как, например, детергенты, не является необходимой. Применения детергентов в препаратах для парентерального введения следовало бы, как правило, избегать или минимизировать, поскольку они имеют значительный токсический и иммуногенный потенциал (Sweetana S. и Akers M.J. (1996) Принципы растворимости и практика для разработки парентеральных дозированных форм лекарственных средств. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50, 330-342), они также могут приводить к изменению во вторичной структуре белков (Vermeer A.W.P. и Norde W. (2000) Влияние связывания сурфактантов с низким молекулярным весом на термальную стабильность и вторичную структуру IgG. Коллоиды и поверхности А: Физико-химический и инженерный аспекты 161, 139-150). Таким образом, полученные твердые формы анти-EGFR антител могут непосредственно использоваться в лекарственных средствах, и дополнительная очистка для удаления фармакологически неприемлемых агентов не является необходимой. В противовес этому, кристаллы, полученные в WO 02072636, должны быть освобождены от фармакологически неприемлемых агентов, например, CHES, имидазола, Трис, хлорида марганца (II), хлорида цинка (II), сульфата меди (II), 2-пропанола, 2-метоил-2,4-пентандиола, HEPES, сульфата лития, этоксиэтанола или детергентов, таких, как полисорбат 80 или 20, при использовании сложного процесса, иногда бывает даже невозможно полностью удалить упомянутые выше неприемлемые агенты.

Неожиданно было обнаружено, что предпочтительно стабильные твердые формы получают в случае, если антитела против рецептора EGF (анти-EGFR антитела), предпочтительно моноклональные анти-EGFR антитела, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), инкубируют при приемлемом значении рН и приемлемой температуре в присутствии приемлемого буфера при использовании определенных осаждающих реагентов, выбранных из полимеров, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), солей, предпочтительно, сульфата аммония, или органических растворителей, предпочтительно этанола, или их смесей.

Неожиданно было обнаружено, что твердые формы анти-EGFR антител, предпочтительно моноклональных анти-EGFR антител, особенно предпочтительно Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000), и/или их варианты или фрагменты, полученные с помощью процесса в соответствии с изобретением, являются преимущественно нативными после повторного растворения, а также, что их преимущественно получают с высоким выходом.

Изобретение, таким образом, относится к твердым формам анти-EGFR антител и/или их вариантам или фрагментам, которые приводят к получению биологически активного белка антитела при растворении или суспендировании в водной среде, получаемым с помощью осаждения антитела и/или его вариантов и/или фрагментов, растворенных или суспендированных в водной среде с помощью осаждающего реагента, выбранного из полимеров, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), солей, предпочтительно, сульфата аммония, или органических растворителей, предпочтительно этанола, или их смесей, в присутствии приемлемого буфера, при приемлемом значении рН и приемлемой температуре.

Твердые формы анти-EGFR антител:

Выражение «твердые формы анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением» предпочтительно взято для обозначения преципитатов или кристаллов, которые приводят к получению биологически активного антитела посредством растворения или суспендирования в водной или неводной среде.

Твердые формы в соответствии с изобретением получают с помощью осаждения антитела, растворенного или суспендированного в водной среде в соответствии с процессом, описанным ниже. Твердые формы в соответствии с изобретением могут иметь размеры, находящиеся в пределах микрометрового и нанометрового диапазона.

«Преципитаты»: для целей настоящего изобретения термин «преципитаты» взят для обозначения твердых форм в аморфной некристаллической структуре или в состоянии агрегации или ассоциации.

«Кристаллы»: для целей настоящего изобретения термин «кристаллы» взят для обозначения твердых форм в кристаллической структуре. Кристаллические структуры могут быть определены при использовании следующих процессов.

«Осажденный»: для целей настоящего изобретения термин «осажденный» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением в осажденной форме, то есть в форме преципитата или кристалла, в зависимости от условий процесса.

«Осажденный кристаллический»: для целей настоящего изобретения термин «осажденный кристаллический» или «кристаллический» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением в упорядоченной кристаллической структуре.

«Осажденный некристаллический»: для целей настоящего изобретения термин «осажденный некристаллический» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением в аморфной некристаллической структуре или в состоянии агрегации и ассоциации.

«Растворенный»: для целей настоящего изобретения термин «растворенный» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением, которые являются растворенными или повторно растворенными в растворе в соответствии с изобретением.

«Суспендированный»: термин «суспендированный» взят для обозначения твердых форм в соответствии с изобретением, которые являются суспендированными или повторно суспендированными в растворе в соответствии с изобретением.

Для целей настоящего изобретения термин «водная среда» взят для обозначения воды или смесей воды с приемлемыми инертными растворителями или другими агентами, упомянутыми в Примере 1, такими, как, например, буферы, стабилизаторы или вспомогательные вещества, которые обладают свойством, таким, что водная среда в соответствии с изобретением сама по себе не приводит к осаждению или кристаллизации антитела, а вместо этого осаждение или кристаллизация происходят только при прибавлении осаждающих реагентов в соответствии с изобретением.

Для целей настоящего изобретения термин «неводная среда» взят для обозначения масел или смесей масел с водой или другими приемлемыми инертными растворителями или другими агентами, упомянутыми в Примере 1, такими, как, например, стабилизаторы или вспомогательные вещества, которые обладают свойством, таким, что неводная среда в соответствии с изобретением сама по себе не приводит к осаждению или кристаллизации антитела, а вместо этого осаждение или кристаллизация происходят только при прибавлении осаждающих реагентов в соответствии с изобретением.

В отношении анти-EGFR антител в соответствии с изобретением и для целей настоящего изобретения термины «биологически активный», «нативный» и «эффективный» взяты для обозначения факта, что анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением способны выявлять свой биологический эффект даже после превращения в твердые формы в соответствии с изобретением и последующего повторного растворения или ресуспендирования, в частности, связывание с EGFR, ингибирование связывания лигандов, в частности, EGF, с EGFR, модуляцию, в частности, ингибирование опосредованной EGFR сигнальной трансдукции, и эффект в отношении профилактики или терапии заболеваний, опосредованных EGFR.

В частности, непосредственное получение кристаллов анти-EGFR антител в соответствии с изобретением, таким образом, не предполагалось, поскольку антитела в основном имеют высокую тенденцию к агрегации, что делает упорядоченное введение в кристаллическую решетку более сложным или даже предотвращает ее образование (McPherson A. (1999) Кристаллизация биологических макромолекул, 1-ое изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Несмотря на трудности, которые поджидают специалиста в данной области при кристаллизации антител в соответствии с изобретением по причине упомянутой выше негомогенности в отношении белковой структуры, гликозилирования и структурной сегментальной гибкости, которая существует даже в пределах видов антител, неожиданно отличные результаты были достигнуты с помощью процесса в соответствии с изобретением.

Высокая стабильность полученных кристаллов антител в соответствии с изобретением также не характеризуется ни изменением формы частиц, ни диапазоном размеров частиц, который следует рассматривать как критический в отношении иммуногенных побочных эффектов, ни изменениями первичной структуры или вторичной структуры получаемого белка. Способ в соответствии с изобретением, таким образом, обеспечивает преимущество, которое заключается в том, что размер полученных кристаллов является преимущественно контролируемым, при этом преимущественно получают стабильные трехмерные кристаллы. Размер кристаллов может находиться в микрометровом и нанометровом диапазоне.

«Анти-EGFR антитела»: анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением предпочтительно представляют собой моноклональные антитела и такие, которые имеют происхождение от мыши или человека, а также химерные или гуманизированные антитела. Антитело, направленное против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), в частности, представляет собой Mab C225 (цетуксимаб) или Mab h425 (EMD 72000) и/или их варианты или фрагменты. Дополнительные антитела против EGFR описаны, например, в ЕР 0586002 и в J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528).

Mab C225 (цетуксимаб. Эрбитукс™): Mab C225 (цетуксимаб) представляет собой клинически одобренное антитело, которое связывается с рецептором EGF. Mab C225 (цетуксимаб) представляет собой химерное антитело, вариабельные участки которого имеют мышиное происхождение, а константные участки - происхождение от человека. Это антитело было впервые описано Naramura и др., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349 и в WO 96/40210 Al.

Mab h425 (EMD 72000): Mab h425 (EMD 72000) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (Mab), полученное из мышиного анти-EGFR антитела 425 (Mab 425) (ЕР 0531472). Мышиное моноклональное антитело Mab 425 было разработано на линии клеток карциномы человека А431, поскольку здесь оно связывается с внеклеточным эпитопом рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Было обнаружено, что оно ингибирует связывание EGF (Murthy и др., 1987). Повышенная экспрессия EGFR была обнаружена в злокачественных тканях, полученных из различных источников, и, следовательно, Mab 425 является возможным активным ингредиентом для диагностики и терапевтического лечения опухолей человека. Так, было обнаружено, что Mab 425 опосредует опухолевую цитотоксичность in vitro и супрессирует опухолевый рост линии клеток эпидермоидных и колоректальных карцином in vitro (Rodeck и др., 1987). В дополнение к этому, было показано, что Mab 425 связывается с ксенотрансплантатами человеческих злокачественных глиом у мышей (Takahashi и др., 1987). Гуманизированные и химерные формы этого антитела были раскрыты, например, в ЕР 0531472; Kettleborough и др.. Белковая инженерия, 1991, 4: 773-783; Bier и др., Cancer Chemother Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier и др., Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46: 167-173. Mab h425 (EMD 72000) представляет собой гуманнизированное антитело (h425), которое находится на клинической фазе I/II, его константные участки состоят из κ и человеческой γ-1 цепи (ЕР 0531472).

Человеческое анти-EGFR антитело может быть получено с помощью методики XenoMouse, как описано в WO 9110741, WO 9402602 и WO 9633735. Антитело, которое проходит в настоящее время клинические испытания и было получено в соответствии с этой методикой, представляет собой, например, АВХ-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).

Антитело: антитело или иммуноглобулин используется в самом широком смысле для целей настоящего изобретения и относится, в частности, к поликлональным антителам и мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам) и, в частности, предпочтительно интактным моноклональным антителам (Mab), которые являются биологически активными, их вариантам и фрагментам. Термин также охватывает гетероантитела, которые состоят из двух или более антител или их фрагментов и/или имеют различные связывающие специфичности и связываются друг с другом. В зависимости от аминокислотной последовательности их константных участков антитела могут относиться к различным классам антител (иммуноглобулинов): IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Этот ряд может быть разделен далее на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Антитела обычно имеют молекулярный вес приблизительно 150 кДа и состоят из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н). Моноклональные антитела получают из популяции гомогенных клеток. Они являются высоко специфическими и направлены против одного эпитопа, в то время как поликлональные антитела охватывают различные антитела, которые направлены против различных эпитопов. Способы получения моноклональных антител включают, например, гибридомный способ, описанный Kohler и Milstein (Nature 256, 495 (1975)), а также у Burdon и др., (1985) «Технология моноклональных антител, получение и характеристика гибридом грызунов и человека», изд. Лабораторные способы в биохимии и молекулярной биологии, том 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. Они могут быть получены, в частности, с помощью известных способов рекомбинантной ДНК (смотри, например, US 4816567). Моноклональные антитела также могут быть изолированы из библиотеки фаговых антител, например, с помощью методик, описанных у Clackson и др. (Nature, 352:624-628 (1991)) и Marks и др. (J.Mol.Biol., 222:58, 1-597(1991)).

Варианты и фрагменты: варианты (мутеины) антител представляют собой структурно родственные белки, например, такие, которые могут быть получены путем модификации первичной последовательности (аминокислотной последовательности), гликоинженерии (варианты сайтов гликозилирования или структур, а также дегликозизилированные белки), с помощью ПЭГилирования, посредством получения в модифицированных хозяйских клетках или с помощью других методик. Варианты в соответствии с изобретением не ограничены приведенными выше примерами, а включают все варианты антител в соответствии с изобретением, которые являются известными специалисту в данной области.

Фрагменты (частичные сегменты) антител представляют собой продукты расщепления полученных антител, например, с помощью ограниченного ферментативного переваривания с помощью папаина, пепсина и плазмина, или путем получения частичных сегментов при использовании генетической инженерии. Типичные частичные сегменты представляют собой, например, бивалентный фрагмент F(ab')₂, моновалентный фрагмент Fab и фрагмент Fc (Lottspeich F., H. Zorbas (ред.). Bioanalytik, Heidelberg; Berlin: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, (1998) стр.1035). Фрагменты в соответствии с изобретением не ограничиваются приведенными выше примерами, а включают все фрагменты антител в соответствии с изобретением, которые известны специалисту в данной области.

Фармацевтические препараты: термин «фармацевтическая композиция» и «фармацевтический препарат» используются как синонимы для целей настоящего изобретения.

Как используется в данной заявке термин «фармацевтически переносимый» относится к лекарственным средствам, осаждающим реагентам, наполнителям, вспомогательным веществам, стабилизаторам, растворителям и другим агентам, которые способствуют введению фармацевтических препаратов млекопитающему при отсутствии нежелательных побочных эффектов, таких, как, рвота, головокружение, проблемы с перевариванием пищи или тому подобное.

Если фармацевтические препараты предназначены для парентерального введения, то существует требование в отношении изотоничности, эугидрии, переносимости и безопасности композиции (низкая токсичность), используемых вспомогательных веществ и первичной упаковки. Неожиданно было обнаружено, что твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением предпочтительно обладают преимуществом, которое заключается в том, что является возможным непосредственное применение, поскольку используемые осаждающие реагенты представляют собой физиологически переносимые агенты и, таким образом, дополнительные этапы очистки для удаления токсикологически неприемлемых агентов, таких, как, например, высокие концентрации органических растворителей или других токсикологически неприемлемых вспомогательных веществ, не являются необходимыми перед применением твердых форм в соответствии с изобретением в фармацевтических композициях. Получение твердых форм анти-EGFR антител в соответствии с изобретением преимущественно с одновременным высоким выходом нативного и фармацевтически приемлемого белка высокой чистоты является, таким образом, простым, экономящим время и недорогим.

Изобретение, таким образом, также относится к способу получения твердой формы анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением и/или одного из его вариантов и/или фрагментов, который приводит к получению биологически активного белка антитела, посредством растворения или суспендирования в водной среде, который отличается тем, что антитело и/или его варианты и/или фрагменты, растворенные или суспендированные в водном растворе, осаждают с помощью осаждающего реагента, а продукт осаждения отделяют. Осаждающие реагенты, используемые в способе в соответствии с изобретением, предпочтительно представляют собой полимеры, в частности, предпочтительно полиэтиленгликоль (ПЭГ), соли, в частности сульфат аммония, или органические растворители, в частности, предпочтительно этанол.

Твердая форма анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением может быть получена путем прибавления реагентов осаждения в соответствии с изобретением, упомянутых в Примере 1, предпочтительно полимеров, таких, как особенно предпочтительно полиэтиленгликоль (ПЭГ) в концентрации от 0,1 до 99,9% (мас./об.), который имеет средний молекулярный вес 200-80000, предпочтительно от 400 до 20,000, особенно предпочтительно 400-8000; солей, таких, как, в частности, предпочтительно сульфат аммония в концентрации 0,1-4,5 М, тригидрат ацетата натрия в концентрации 0,1-4,5 М, дигидрат цитрата динатрия в концентрации 0,1-1,5 М, фосфат калия в концентрации 0,1-1,2 М, хлорид калия в концентрации от 0,1 до 4,7 М, хлорид натрия в концентрации от 0,1 до 6,1 М, гидрофосфат дикалия в концентрации от 0,1 до 3,0 М, дигидрат гидрофосфата динатрия в концентрации от 0,1 до 0,5 М, или органических растворителей, таких, как, особенно предпочтительно этанол в концентрации 0,1-99,9% (об./об.), или их смесей, а также вспомогательных веществ, буферов и/или стабилизаторов, к раствору, включающему антитела в соответствии с изобретением в периодическом процессе, и инкубации смеси при значениях рН и температурах, упомянутых в Примере 1. С этой целью определенные объемы маточных растворов, включающие осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы, упомянутые в Примере 1, в определенной концентрации преимущественно прибавляли к раствору, содержащему определенные концентрации EGFR антител (от 0,01 до 150 мг/мл, предпочтительно от 2 до 100 мг/мл, в частности, предпочтительно приблизительно 5-20 мг/мл), как полученные в своем препарате, и необязательно разводили водой или буфером (например, цитратным или фосфатным буфером, в концентрации от 1 мМ до 200 мМ, предпочтительно от 2 до 20 мМ, особенно предпочтительно приблизительно 10 мМ; также с прибавлением агентов изотоничности, таких, как, например, хлорид калия, хлорид натрия в концентрации 1-1000 мМ, предпочтительно 40 мМ - 310 мМ) до предварительно рассчитанной концентрации. Альтернативно, осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и стабилизаторы в соответствии с изобретением могут также прибавляться в твердой форме. Если антитела сами по себе находятся в твердом агрегатном состоянии, например, в виде лиофилизата, то твердые формы анти-EGFR антител в соответствии с изобретением могут быть получены путем изначального растворения антител в соответствии с изобретением в воде или водном растворе, включающем один или более дополнительных ингредиентов, и последующего прибавления определенных объемов маточных растворов, включающих осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы, упомянутые в Примере 1, в определенной концентрации. Осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы в соответствии с изобретением могут в дополнение также прибавляться в твердом агрегатном состоянии. Антитела в соответствии с изобретением могут предпочтительно непосредственно растворяться в растворе, включающем все осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы.

Изобретение также охватывает все гидраты, соли и производные упомянутых выше агентов, которые являются известными и доступными для специалиста в данной области.

Один или более агентов, упомянутых в изобретении, могут предпочтительно прибавляться во время или после завершения процесса осаждения и могут необязательно удаляться вновь для того, чтобы, например, осуществить дополнительный этап очистки.

Один или более реагентов осаждения, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы, упомянутые в изобретении, могут преимущественно прибавляться во время или после завершения процесса получения антитела. Это можно предпочтительно осуществлять путем растворения антитела в соответствии с изобретением непосредственно в водном растворе, включающем один, множество или все дополнительные осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы на заключительном этапе очистки, который осуществляется после его получения. Для получения фармацевтического препарата в соответствии с изобретением соответствующий(ие) дополнительный(ые) ингредиент(ы) потом только должны быть добавлены в соответствующим образом меньших количествах или не будут прибавляться вообще. Является особенно предпочтительным, если соответствующий ингредиент растворен в водном растворе, включающем все дополнительные осаждающие реагенты, вспомогательные вещества, буферы и/или стабилизаторы на заключительном этапе очистки антитела после его получения. Таким образом, предпочтительно может быть получен раствор, который упаковывают или лиофилизуют непосредственно. Полученный раствор, включающий соответствующее антитело, доводят до значения рН от 4 до 10, предпочтительно от 5 до 9, стерильно фильтруют и, если это является необходимым, подвергают сублимационной сушке.

Реакцию осуществляют с помощью способов, известных специалисту в данной области в приемлемом растворителе, в частности, в инертном растворителе. Приемлемые инертные растворители представляют собой этанол, глицерин, смеси с водой или чистую воду, или воду, включающую другие вспомогательные вещества, такие, как, например, соли, оказывающие буферирующее действие или действие, регулирующее изотоничность. Особое предпочтение отдается воде.

Способ, описанный в данной заявке, может, в частности, преимущественно осуществляться в периодическом формате. Твердые анти-EGFR антитела в соответствии с изобретением и/или их варианты и/или фрагменты, полученные способом в соответствии с изобретением, могут, в частности, предпочтительно превращаться в биологически активный белок антитела посредством растворения или суспендирования в водной среде. С этой целью антитела и/и