Гуманизированные антагонисты, направленные против c-met

Гуманизированные антагонисты, направленные против c-met

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Настоящая заявка представляет собой действительную заявку, поданную в соответствии со ст. 37 СFR (Свода Федеральных правил) 1.53(b)(1), которая согласно ст. 35 USC (Кодекса законов США) 119(е) испрашивает приоритет предварительной заявки № 60/598991, поданной 5 августа 2004, содержание которой во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и регуляции факторов роста. Более конкретно настоящее изобретение относится к модуляторам пути передачи сигнала HGF/c-met и к применению указанных модуляторов.

Предшествующий уровень техники

HGF представляет собой мезенхимальный плейотропный фактор, обладающий митогенной, мотогенной и морфогенной активностью в ряде клеток различных типов. Действие HGF опосредуется специфической тирозинкиназой, c-met и аберрантным HGF, причем экспрессия c-met часто наблюдается в различных опухолях (см., например, Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovich-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002) 109(7):863-867). Регуляция пути передачи сигнала HGF/c-Мet вовлечена в прогрессирование роста опухолей и развитие метастазов (см, например, Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300).

HGF связывается с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора Met (RTK) и регулирует различные биологические процессы, такие как рассеяние, пролиферация и выживание клеток. Передача сигнала HGF-Met, в основном, происходит при нормальном развитии эмбриона, а в частности при миграции мышечных клеток-предшественников и развитии печени и нервной системы (Bladt et al., 1995; Hamanoue et al., 1996; Maina et al., 1996; Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995)). Эволюционные фенотипы Met- и HGF-дефицитных мышей имеют очень большое сходство, что позволяет предположить, что HGF является узнаваемым лигандом для рецептора Met (Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). HGF-Met также играет определенную роль в регенерации печени, в ангиогенезе и в заживлении ран (Bussolino et al., 1992; Matsumoto & Nakamura, 1993; Nusrat et al., 1994). Предшественник рецептора Met подвергается протеолитическому расщеплению с образованием внеклеточной субъединицы α и мембранной остовной субъединицы β, связанных дисульфидными связями (Tempest et al., 1988). Субъединица β содержит цитоплазматический киназный домен и у своего С-конца имеет связывающий сайт для множества субстратов, где белки-адаптеры связываются и инициируют передачу сигнала (Bardelli et al., 1997; Nguyen et al., 1997; Pelicci et al., 1995; Ponzetto et al., 1994; Weidner et al., 1996). После связывания с HGF активация Met приводит к фосфорилированию тирозина и к последующей передаче сигнала посредством Gаb1- и Grb2/Sos-опосредуемой активации киназы Р13 и Rаs/MAPK, соответственно, что, в свою очередь, приводит к подвижности и пролиферации клеток (Furge et al., 2000; Hartmann et al., 1994; Ponzetto et al., 1996; Royal & Park, 1995).

Было показано, что Met трансформируется в обработанную канцерогеном клеточную линию остеосаркомы (Cooper et al., 1984; Park et al., 1986). Сверхэкспрессия или амплификация гена Met наблюдается при различных раковых заболеваниях человека. Так, например, при раке ободочной кишки наблюдается, по меньшей мере, 5-кратная сверхэкспрессия белка Met, причем, сообщалось, что при метастазах в печени происходит амплификация его гена (Di Renzo et al., 1995; Liu et al., 1992). Также сообщалось, что белок Met сверхэкспрессируется при плоскоклеточной карциноме ротовой полости, гепатоцеллюлярной карциноме, почечно-клеточной карциноме, карциноме молочной железы и карциноме легких (Jin et al., 1997; Morello et al., 2001; Natali et al., 1996; Olivero et al., 1996; Suzuki et al., 1994). Кроме того, сверхэкспрессия мРНК наблюдается в гепатоцеллюлярной карциноме, карциноме желудка и карциноме ободочной кишки (Boix et al., 1994; Kuniyasu et al., 1993; Liu et al., 1992).

При почечной папиллярной карциноме в киназном домене Met был обнаружен ряд мутаций, которые вызывают активацию конститутивного рецептора (Olivero et al. 1999; Schmidt et al., 1997; Schmidt et al., 1999). Эти активирующие мутации приводят к конститутивному фосфорилированию тирозина Met, активации МАРК, образованию патологических очагов и к онкогенезу (Jeffers et al., 1997). Кроме того, эти мутации усиливают подвижность и инвазию клеток (Giordano et al., 2000, Lorenzato et al., 2002). HGF-зависимая активация Met в трансформированных клетках опосредует увеличение подвижности, рассеяния и миграции клеток, что, в конечном счете, приводит к инвазивному росту опухоли и к развитию метастазов (Jeffers et al., 1996; Meiners et al., 1998).

Было показано, что Met взаимодействует с другими белками, которые стимулируют активацию, трансформацию и инвазию рецептора. Сообщалось, что в неопластических клетках, Met взаимодействует с интегрином α6β4, рецептором для компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ), таких как ламинины, и стимулирует HGF-зависимый инвазивный рост опухоли (Trusolino et al., 2001). Кроме того, было показано, что внеклеточный домен Met взаимодействует с членом семейства семафоринов, плексином В1 и усиливает инвазивный рост опухоли (Giordano et al., 2002). Кроме того, также сообщалось, что CD44v6, который участвует в онкогенезе и развитии метастазов, образует комплекс с Met и HGF, что приводит к активации рецептора Met (Orian-Rousseau et al., 2002).

Met является членом подсемейства RТК, которое включает Ron и Sea (Maulik et al., 2002). Предсказание структуры внеклеточного домена Met позволяет предположить о наличии общей гомологии Met с семафоринами и плексинами. N-конец Met содержит домен Sema, состоящий приблизительно из 500 аминокислот, которые являются консервативными для всех семафоринов и плексинов. Семафорины и плексины принадлежат к большому семейству секретируемых и мембраносвязанных белков, впервые описанных с точки зрения их роли в развитии нервных тканей (Van Vactor & Lorenz, 1999). Однако совсем недавно было обнаружено, что сверхэкспрессия семафорина коррелирует с инвазией опухоли и с метастазами. Богатый цистеином домен PSI (также называемый доменом Met-родственной последовательности), обнаруженный в плексинах, семафоринах и интегринах, расположен рядом с доменом Sеma, за которым следуют четыре повтора IРТ, которые представляют собой иммуноглобулин-подобные области, присутствующие в плексинах и в факторах транскрипции. Последние исследования позволяют предположить, что домен Sеma Met является достаточным для связывания HGF с гепарином (Gherardi et al., 2003). Кроме того, в публикации Kong-Beltran et al. (Cancer Cell (2004), 6:61-73) сообщалось, что домен Sеma Met является необходимым для димеризации и активации рецептора.

Были описаны многочисленные молекулы, нацеленные на HGF/c-met-путь передачи сигнала. Такими молекулами являются антитела, такие как антитела, описанные в патенте США № 5686292. Было показано, что часть внеклеточного домена c-met обладает антагонистическим действием, направленным против пути HGF/c-met. Однако, если принять во внимание ту важную роль, которую играет этот путь в этиологии различных патологических состояний, то совершенно очевидно, что необходимо разработать средство, которое обладало бы клиническими свойствами, являющимися оптимальными для его применения в качестве терапевтического средства. Настоящее изобретение удовлетворяет указанным требованиям, а также имеет другие преимущества.

Все цитируемые здесь работы, включая патентные заявки и публикации, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Описание изобретения

Настоящее изобретение частично основано на идентификации ряда антагонистов биологического пути HGF/c-met, который представляет собой биологический/клеточный процесс, являющийся важной и преимущественной терапевтической задачей. Настоящее изобретение относится к композициям и к способам, основанным на подавлении активации HGF/c-met, включая, но не ограничиваясь ими, подавление связывания HGF с внеклеточной частью c-met и мультимеризацию рецептора. Описанные здесь антагонисты представляют собой важные терапевтические и диагностические средства, которые могут быть использованы для лечения патологических состояний, ассоциированных с аномальной или нежелательной передачей сигнала по пути HGF/c-met. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способам, к композициям, к наборам и к промышленным изделиям, предназначенным для модуляции пути HGF/c-met, включая модуляцию связывания с лигандом c-met, димеризацию c-met, активацию и другие биологические/физиологические активности, ассоциированные с передачей сигнала HGF/c-met.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к терапевтическим средствам против HGF/c-met, подходящим для терапевтического применения и способным в различной степени нарушать пути передачи сигнала HGF/c-met. Так, например, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против c-met, где аффинность указанного моновалентного антитела против человеческого c-met (например, аффинность Fab-фрагмента этого антитела против человеческого c-met), по существу, аналогична аффинности моновалентного мышиного антитела (например, аффинности Fab-фрагмента мышиного антитела против человеческого c-met), включающего последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, представленной на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10), или состоящего, или по существу состоящего, из указанной последовательности. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против c-met, где аффинность моновалентного антитела против человеческого c-met (например, аффинность Fab-фрагмента антитела против человеческого c-met) ниже, например, по меньшей мере, в 3, 5, 7 или 10 раз, чем аффинность моновалентного мышиного антитела (например, аффинность Fab-фрагмента мышиного антитела против человеческого c-met), включающего последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, представленной на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10), или состоящего, или по существу, состоящего из указанной последовательности. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против c-met, где аффинность моновалентного антитела против человеческого c-met (например, аффинность Fab-фрагмента антитела против человеческого c-met) является более высокой, например, по меньшей мере, в 3, 5, 7, 10 или 13 раз, чем аффинность моновалентного мышиного антитела (например, аффинность Fab-фрагмента мышиного антитела против человеческого c-met), включающего последовательность вариабельного домена легкой цепи и тяжелой цепи, представленной на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10), или состоящего, или по существу, состоящего из указанной последовательности. В одном из вариантов изобретения аффинность моновалентного мышиного антитела против человеческого c-met, по существу, аналогична аффинности связывания Fab-фрагмента, содержащего последовательности вариабельного домена антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонированной в Американской коллекции типовых культур рег.№ АТСС НВ-11894 (гибридома 1А3.3.13) или НВ-11894 (гибридома 5D5.11.6). Как хорошо установлено специалистами, аффинность связывания лиганда с его рецептором может быть определена с помощью любого из различных анализов и выражается различными количественными величинами. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения аффинность связывания выражается в виде величин Кd и представляет собой истинную аффинность связывания (например, с минимизированными эффектами авидности). Обычно и предпочтительно аффинность связывания измеряют in vitro, независимо от того, измеряют ли эту аффинность в бесклеточной или в клеточной системе. Как будет более подробно описано ниже, кратное различие в аффинностях связывания может быть определено количественно как отношение величины аффинности связывания моновалентного гуманизированного антитела (например, в Fab-форме) к величине аффинности связывания моновалентного эталонного антитела сравнения (например, в Fab-форме)(например, мышиного антитела, имеющего донорные последовательности гипервариабельной области), где указанные величины аффинности связывания определяют в тех же самых условиях анализа. Таким образом, в одном из вариантов изобретения кратное различие в аффинностях связывания определяют как отношение величин Кd гуманизированного антитела в Fab-форме к величине Кd аффинности связывания эталонного Fab-антитела сравнения. Так, например, в одном из вариантов изобретения, если антитело согласно изобретению (А) имеет “в 3 раза более низкую” аффинность по сравнению с аффинностью эталонного антитела (М), то величина Кd для А составляет 3х, величина Кd для М составляет 1х, а отношение Кd для А к Кd для М составляет 3:1. И наоборот, в одном из вариантов изобретения, если антитело согласно изобретению (С) имеет “в 3 раза более высокую” аффинность по сравнению с аффинностью эталонного антитела (R), то величина Кd для С составляет 1х, величина Кd для R составляет 3х, а отношение Кd для С к Кd для R составляет 1:3. Для измерения аффинности связывания может быть применен любой из различных анализов, известных специалистам, включая описанные здесь анализы, например Biacore, радиоиммуноанализ (РИА) и ELISA.

В одном из аспектов настоящего изобретения антагонист HGF/c-met согласно изобретению включает антитело против c-met, содержащее:

(а) по меньшей мере, одну, две, три, четыре или пять последовательностей гипервариабельной области (HVR), выбранных из группы, состоящей из:

(i) HVR-L1, включающей последовательность А1-А17, где А1-А17 представляет собой KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:1)

(ii) HVR-L2, включающей последовательность В1-В7, где В1-В7 представляет собой WASTRES (SEQ ID NO:2)

(iii) HVR-L3, включающей последовательность С1-С9, где С1-С9 представляет собой QQYYAYPWT (SEQ ID NO:3)

(iv) HVR-Н1, включающей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFTSYWLH (SEQ ID NO:4)

(v) HVR-H2, включающей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:5) и

(vi) HVR-H3, включающей последовательность F1-F11, где F1-F11 представляет собой XYGSYVSPLDY (SEQ ID NO:6), а Х не является R; и

(b) по меньшей мере, один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию, по меньшей мере, в одном остатке последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 или 6. В одном из вариантов изобретения HVR-L1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:1. В одном из вариантов изобретения HVR-L2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:2. В одном из вариантов изобретения HVR-L3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:3. В одном из вариантов изобретения HVR-Н1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:4. В одном из вариантов изобретения HVR-Н2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:5. В одном из вариантов изобретения HVR-Н3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO:6. В одном из вариантов изобретения HVR-Н3 содержит последовательность TYGSYVSPLDY (SEQ ID NO:7). В одном из вариантов изобретения HVR-Н3 содержит последовательность SYGSYVSPLDY (SEQ ID NO:8). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению, содержащее эти последовательности (в описанной здесь комбинации), является гуманизированным или человеческим.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или шесть областей HVR, где каждая область HVR содержит последовательность, или состоит, или, по существу, состоит из последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, и где SEQ ID NO:1 соответствует HVR-L1, SEQ ID NO:2 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO:3 соответствует HVR-L3, SEQ ID NO:4 соответствует HVR-Н1, SEQ ID NO:5 соответствует HVR-Н2, а SEQ ID NO:6, 7 или 8 соответствуют HVR-Н3. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Н1, HVR-Н2 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 7, в соответствующем порядке. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Н1, HVR-Н2 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 8 в соответствующем порядке.

Варианты HVR в антителе согласно изобретению могут иметь модификации в одном или нескольких остатках HVR. В одном из вариантов изобретения вариант HVR-L2 содержит 1-5 (1, 2, 3, 4 или 5) замен в любой комбинации в следующих положениях: В1 (М или L), В2 (P, T, G или S), B3 (N, G, R или Т), В4 (I, N или F), В5 (P, I, L или G), В6 (A, D, T или V) и В7 (R, I, M или G). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-Н1 содержит 1-5 (1, 2, 3, 4 или 5) замен в любой комбинации в следующих положениях: D3 (N, P, L, S, A, I), D5 (I, S или Y), D6 (G, D, T, K, R), D7 (F, H, R, S, T или V) и D9 (М или V). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-Н2 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замены в любой комбинации в следующих положениях: Е7 (Y), Е9 (I), Е10 (I), Е14 (T или Q), E15 (D, K, S, T или V), E16 (L), E17 (E, H, N или D) и Е18 (Y, E или Н). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-Н3 содержит 1-5 (1, 2, 3, 4 или 5) замен в любой комбинации в следующих положениях: F1 (T, S), F3 (R, S, H, T, A, K), F4 (G), F6 (R, F, M, T, E, K, A, L, W), F7 (L, I, T, R, K, V), F8 (S, A), F10 (Y, N) и F11 (Q, S, H, F). Буква(ы) в скобках после каждого положения означает(ют) репрезентативную замену (т.е. модификацию) аминокислоты, причем для специалиста в данной области очевидно, что эффективность замен одних аминокислот другими аминокислотами, в соответствии с настоящим изобретением, может быть оценена рутинными методами, известными специалистам и/или описанными в настоящей заявке. В одном из вариантов изобретения HVR-L1 имеет последовательность SEQ ID NO:1. В одном из вариантов изобретения в положении F1 в варианте HVR-Н3 присутствует Т. В одном из вариантов изобретения в положении F1 в варианте HVR-Н3 присутствует S. В одном из вариантов изобретения в положении F3 в варианте HVR-Н3 присутствует R. В одном из вариантов изобретения в положении F3 в варианте HVR-Н3 присутствует S. В одном из вариантов изобретения в положении F7 в варианте HVR-Н3 присутствует Т. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует T или S, в положении F3 присутствует R или S, а в положении F7 присутствует Т.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует Т, в положении F3 присутствует R, а в положении F7 присутствует Т. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует S. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует Т, а в положении F3 присутствует R. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует S, в положении F3 присутствует R, а в положении F7 присутствует Т. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует Т, в положении F3 присутствует S, в положении F7 присутствует Т, а в положении F8 присутствует S. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н3, где в положении F1 присутствует Т, в положении F3 присутствует S, в положении F7 присутствует Т, а в положении F8 присутствует А. В некоторых вариантах изобретения указанный вариант антитела HVR-Н3 дополнительно содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Н1 и HVR-Н2, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5. В некоторых вариантах изобретения такие антитела дополнительно включают консенсусную последовательность человеческой каркасной области тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител указанная консенсусная последовательность каркасной области имеет замены в положениях 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител в положении 71 присутствует А, в положении 73 присутствует Т и/или в положении 78 присутствует А. В одном из вариантов указанных антител эти антитела дополнительно включают консенсусную последовательность человеческой каркасной области легкой цепи кI.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H2, где в положении В6 присутствует V. В некоторых вариантах изобретения указанный вариант HVR-L2-антитела дополнительно включает HVR-L1, HVR-L3, HVR-Н1, HVR-Н2 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 и 6. В некоторых вариантах изобретения указанный вариант HVR-L2-антитела дополнительно включает HVR-L1, HVR-L3, HVR-Н1, HVR-Н2 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 и 7. В некоторых вариантах изобретения указанный вариант HVR-L2-антитела дополнительно включает HVR-L1, HVR-L3, HVR-Н1, HVR-Н2 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 3, 4, 5 и 8. В некоторых вариантах изобретения такие антитела дополнительно включают консенсусную последовательность человеческой каркасной области тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител указанная консенсусная последовательность каркасной области имеет замены в положениях 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител в положении 71 присутствует А, в положении 73 присутствует Т и/или в положении 78 присутствует А. В одном из вариантов этих антител указанные антитела дополнительно включают консенсусную последовательность человеческой каркасной области легкой цепи κI.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где в положении Е14 присутствует Т, в положении Е15 присутствует К, а в положении Е17 присутствует Е. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-Н2, где в положении Е17 присутствует Е. В некоторых вариантах изобретения указанный HVR-Н3-вариант антитела дополнительно включает HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Н1 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 6. В некоторых вариантах изобретения указанный вариант антитела HVR-Н2 дополнительно включает HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Н1 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 7. В некоторых вариантах изобретения указанный HVR-Н2-вариант антитела дополнительно включает HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Н1 и HVR-Н3, где каждая из этих областей содержит, в соответствующем порядке, последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 8. В некоторых вариантах изобретения такие антитела дополнительно включают консенсусную последовательность человеческой каркасной области тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител указанная консенсусная последовательность каркасной области имеет замены в положениях 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител в положении 71 присутствует А, в положении 73 присутствует Т и/или в положении 78 присутствует А. В одном из вариантов этих антител указанные антитела дополнительно включают консенсусную последовательность человеческой каркасной области легкой цепи κI.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или все последовательности HVR, представленные на фиг. 2, 3 и/или 4 (SEQ ID NO:56-163).

Терапевтическое средство, используемое для введения индивидууму-хозяину, предпочтительно, вырабатывает незначительный иммунный ответ или вообще не вырабатывает иммунного ответа против указанного агента у данного индивидуума. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к указанному агенту. Так, например, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое вырабатывает и/или, предположительно, вырабатывает у индивидуума-хозяина иммунный ответ в виде продуцирования человеческого антимышиного антитела (НАМА), на уровне, который, по существу, значительно ниже уровня продуцирования антитела, содержащего последовательности SEQ ID NO:9 и 10. В другом примере настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое вырабатывает и/или, предположительно, вырабатывает минимальный иммунный ответ в виде продуцирования человеческого антимышиного антитела (НАМА), или вообще не вырабатывает такого ответа. В одном из примеров антитело согласно изобретению вырабатывает иммунный ответ в виде продуцирования антимышиного антитела на клинически приемлемом уровне или на более низком уровне.

Гуманизированное антитело согласно изобретению может содержать одну или несколько последовательностей человеческой и/или человеческой консенсусной последовательности негипервариабельной области (например, каркасной области) в вариабельном домене тяжелой цепи и/или легкой цепи. В некоторых вариантах изобретения в последовательностях человеческой и/или человеческой консенсусной последовательности негипервариабельной области присутствует одна или несколько дополнительных модификаций. В одном из вариантов изобретения вариабельный домен тяжелой цепи антитела согласно изобретению содержит человеческую консенсусную каркасную последовательность, которая, в одном из вариантов изобретения, представляет собой консенсусную каркасную последовательность подгруппы III. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит консенсусную каркасную последовательность подгруппы III, модифицированную, по меньшей мере, в одном положении аминокислоты. Так, например, в одном из вариантов изобретения модифицированная консенсусная каркасная последовательность подгруппы III может содержать замену в одном или нескольких из положений 71, 73 и/или 78. В одном из вариантов изобретения указанными заменами являются R71А, N73Т и/или N78А в любой их комбинации.

Как известно специалистам, и как более подробно описано ниже, положение/окружение аминокислот, определяющих гипервариабельную область данного антитела, может варьироваться в зависимости от ситуации и различных определений, известных специалистам (как описано ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как пограничные положения гипервариабельной области, которые, в соответствии с одним из ряда критериев, могут, предположительно, находиться в гипервариабельной области, а в соответствии с другим из ряда критериев они могут, предположительно, находиться за пределами гипервариабельной области. Одно или несколько из этих положений могут также присутствовать в удлиненных гипервариабельных областях (подробно определенных ниже). Настоящее изобретение относится к антителам, содержащим модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. В одном из вариантов изобретения эти гибридные гипервариабельные положения включают одно или несколько из положений 26-30, 33-35В, 47-49, 57-65, 93, 94 и 102 в вариабельном домене тяжелой цепи. В одном из вариантов изобретения эти гибридные гипервариабельные положения включают одно или несколько из положений 24-29, 35-36, 46-49, 56 и 97 в вариабельном домене легкой цепи. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой цепи подгруппы III, модифицированный в одном или нескольких гибридных гипервариабельных положениях. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой цепи подгруппы III, модифицированный в одном или нескольких из положений 27-28, 30, 33-35, 49, 57-65, 94 и 102. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену F27Y. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену Т28N, P, L, S, A или I. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену S30I, T или Y. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену А33W. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену М34L или M34V. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену S35Н. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену T57I. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену Y58R. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену Y59F. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену A60N. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену D61P, T или Q. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену S62N, D, K, T или V. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену V63F или V63L. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену К64Е, H, N, D или Q. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену G65D, Y, E или Н. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену R94T или R94S. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену Y102Q, S, H или F. В одном из вариантов изобретения указанное антитело согласно изобретению имеет указанную модификацию R94T или R94S, а также имеет одну или несколько модификаций в положении 96 и/или 100. В одном из вариантов изобретения указанными модификациями являются замены G96R и/или S100T (т.е. в HVR-Н3). В одном из вариантов изобретения указанное антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой цепи каппа подгруппы I, модифицированный в одном или нескольких из положений 24, 25, 29 и 56. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену R24K. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену А25S. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замену I29Q. В одном из вариантов изобретения указанное антитело имеет замены S56R, I, M или G.

В одном из вариантов изобретения указанное антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий вариант человеческой консенсусной каркасной последовательности цепи подгруппы III, модифицированный в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или во всех положениях 27-28, 30, 33-35, 49, 57-65, 94 и 102. В одном из вариантов изобретения указанную модификацию выбирают из группы, состоящей из F27Y, T28 (N, P, L, S, A или I), S30 (I, T или Y), A33W, M34 (L,V), S35H, T57I, Y58R, Y59F, A60N, D61 (P,T,Q), S62 (N, D, K, T, V), V63 (F,L), K64(E, H, N, D, Q), G65(D, Y, E, H), R94(T,S) и Y102(Q, S, H, F). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению, содержащее указанные модификации R94T или R94S, дополнительно содержит одну или несколько модификаций в положении 96 и/или 100. В одном из вариантов изобретения указанными модификациями являются замены G96R и/или S100T (т.е. в HVR-Н3).

В одном из вариантов изобретения указанное антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой цепи каппа подгруппы I, модифицированной в 1, 2, 3 или во всех положениях 24, 25, 29 и 56. В одном из вариантов изобретения модификация выбрана из группы, состоящей из R24K, A25S, I29Q и S56(R, I, M, G).

Антитело согласно изобретению может содержать любые подходящие человеческие или консенсусные каркасные человеческие последовательности легкой цепи при условии, что такое антитело обладает нужными биологическими свойствами (например, нужной аффинностью связывания). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит, по меньшей мере, часть каркасной последовательности (или всю каркасную последовательность) человеческой легкой цепи κ. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит, по меньшей мере, часть каркасной консенсусной последовательности (или всю эту последовательность) человеческой цепи κ подгруппы I.

В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, включающий каркасную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 и/или 16 (фиг.1), при условии, что в положении 94 тяжелой цепи отсутствует R (а предпочтительно, но необязательно, присутствует S или Т).

В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению представляет собой гуманизированное антитело против c-met, которое ингибирует связывание человеческого фактора роста гепатоцитов с его рецептором более эффективно, чем эталонное антитело, включая химерное антитело против c-met, содержащее вариабельную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи, представленную на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10). Так, например, в одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению ингибирует связывание HGF при концентрации IC₅₀, которая составляет менее примерно половины значения IC₅₀ химерного антитела. В одном из вариантов изобретения величина IC₅₀ антитела согласно изобретению составляет примерно 0,1; 0,2; 0,3 или 0,4 от величины IC₅₀ химерного антитела. Сравнение эффективностей ингибирования связывания HGF с его рецептором может быть осуществлено различными методами, известными специалистам, включая методы, описанные ниже в примерах. В одном из вариантов изобретения величины IC₅₀ определяют в диапазоне концентраций примерно от 0,01 нМ до 1000 нМ.

В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению представляет собой гуманизированное антитело против c-met, которое ингибирует активацию рецептора человеческого фактора роста гепатоцитов (HGF) более эффективно, чем эталонное антитело, включая химерное антитело против c-met, содержащее вариабельную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи, представленную на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10). Так, например, в одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению ингибирует активацию рецептора при концентрации IC₅₀, которая составляет менее примерно половины значения IC₅₀ химерного антитела. В одном из вариантов изобретения величина IC₅₀ антитела согласно изобретению составляет примерно 0,1; 0,2; 0,3 или 0,4 от величины IC₅₀ химерного антитела. Сравнение эффективностей ингибирования активации рецептора HGF может быть осуществлено различными методами, известными специалистам, включая методы, описанные ниже в примерах. В одном из вариантов изобретения величины IC₅₀ определяют в диапазоне концентраций примерно от 0,1 до 100 нМ.

В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению представляет собой гуманизированное антитело против c-met, которое ингибирует c-met-зависимую пролиферацию клеток более эффективно, чем эталонное антитело, включая химерное антитело против c-met, содержащее вариабельную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи, представленную на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10). Так, например, в одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению ингибирует пролиферацию клеток при концентрации IC₅₀, которая составляет менее примерно половины значения IC₅₀ химерного антитела. В одном из вариантов изобретения величина IC₅₀ антитела согласно изобретению составляет примерно 0,1; 0,2; 0,3 или 0,4 от величины IC₅₀ химерного антитела. Сравнение эффективностей ингибирования пролиферации клеток может быть осуществлено различными методами, известными специалистам, включая методы, описанные ниже в примерах. В одном из вариантов изобретения величины IC₅₀ определяют в диапазоне концентраций примерно от 0,1 до 100 нМ.

В одном из вариантов изобретения гуманизированное антитело и химерное антитело являются моновалентными. В одном из вариантов изобретения гуманизированное антитело и химерное антитело содержат одну Fab-область, присоединенную к Fc-области. В одном из вариантов изобретения эталонное химерное антитело содержит последовательности вариабельных доменов, представленные на фиг.7 (SEQ ID NO:9 и 10), которые присоединены к человеческой Fc-области. В одном из вариантов изобретения человеческой Fc-областью является область IgG (например, IgG1, 2, 3 или 4).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательности HVR1-НС, HVR2-НС и/или HVR3-НС, представленные на фиг.13. В одном из вариантов изобретения вариабельный домен включает последовательности FR1-НС, FR2-НС, FR3-НС и/или FR4-НС, представленные на фиг.13. В одном из вариантов изобретения указанное антитело содержит последовательности СН1 и/или Fc, представленные на фиг.13. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательности HVR1-НС, HVR2-НС и/или HVR3-НС и последовательности FR1-НС, FR2-НС, FR3-НС и/или FR4-НС, представленные на фиг.13. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательности HVR1-НС, HVR2-НС и/или HVR3-НС и последовательности СН1 и/или Fc, представленные на фиг.13. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательности HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC; последовательности FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, представленные на фиг.13; и последовательности С