Способ получения l-треонина

Способ получения l-треонина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу, который используется в ферментирующей промышленности. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу для эффективного производства L-треонина посредством ферментации при помощи бактерии Escherichia. L-Треонин является незаменимой аминокислотой и может быть использован в качестве ингредиента в питательных смесях медицинского назначения. Далее, она имеет различные применения в питательных подкормках для животных, а также среди реагентов в фармацевтической и химической отраслях.

Уровень техники

L-Аминокислоты, такие как L-треонин и L-изолейцин, получают в промышленных масштабах посредством ферментации, используя бактерии, производящие аминокислоты, например коринеформные бактерии или Escherichia, которые могут производить L-аминокислоты. Помимо таких бактерий, производящих аминокислоты, также используют природные бактериальные штаммы или их искусственные мутанты. С целью повышения производительности используют рекомбинантные штаммы бактерий, в которых ферменты, участвующие в биосинтезе L-аминокислот, повышены в силу рекомбинации генов или подобных способов.

В частности, известны мутантные штаммы бактерий Escherichia, которые продуцируют L-треонин, такие как 6-диметиламинопурин-устойчивые (выложенный Патент Японии (Kokai) No 5-304969) и боррелидин-устойчивый штамм (Международная патентная публикация WO 98/04715). Известны способы получения L-треонина с помощью бактерий Escherichia, особенно с помощью штамма, в котором треониновый оперон амплифицирован при помощи плазмиды (US 5175107) или у которого ген фосфоенолпируваткарбоксилазы и ген аспартазы амплифицированы при помощи плазмиды (заявка на патент США No. 2002/0110876).

В качестве генов, кодирующих ферменты, принимающих участие в биосинтезе L-треонина у Escherichia coli, известны следующие гены: ген аспартокиназы III (lysC), ген аспартатсемиальдегиддегидрогеназы (asd), ген аспартокиназы I-гомосериндегидрогеназы (thrA), ген гомосеринкиназы (thrB) и ген треонинсинтазы (thrC). Гены thrA, thrB и thrC (thrABC) составляют треониновый оперон. Треониновый оперон образует структуру аттенюатора, и экспрессия его генов ингибируется в присутствии изолейцина и треонина в культуральной среде. Известно, что если удалить из треонинового оперона лидерную последовательность участка аттенюатора, то выход ферментативного производства улучшается (Патент США No. 5538873, Biotechnology Letters, Vol.24, No. 21, November 2002, и Международная патентная публикация WO 05/049808).

На сегодняшний день к уже разработанным способам получения L-треонина относятся использование периодической культуры, выращиваемой в ферментере, в котором изначально содержатся все питательные вещества, а также культуры с подпиткой, выращиваемой в ферментере, который содержит базовый набор питательных веществ и непрерывно пополняется одним или более дополнительными питательными компонентами (Патент СШA No. 5538873 и Европейский патент No 593792), и способ регулируемой концентрации сахаридов, которую поддерживают на определенном уровне или ниже (Международные патентные публикации WO 05/014840 и WO 05/014843). Помимо этого, разработан еще один способ получения L-треонина, согласно которому культуральная среда пополняется питательными компонентами таким образом, что фосфорная кислота и источники углерода являются сдерживающими факторами роста (Патент СШA No 5763230).

Сера является незаменимым компонентом для роста бактерий и обычно добавляется в среду для производства L-треонина посредством ферментации в виде сульфата аммония. Однако, что касается производства L-треонина путем ферментации, способы регуляции концентрации серы в ферментационной среде, а также влияние снижения концентрации серы еще неизвестны.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа эффективного получения L-треонина с помощью бактерий рода Escherichia, которые способны продуцировать L-треонин.

Авторы данного изобретения провели всесторонние исследования в целях достижения указанной цели. В итоге было установлено, что концентрация серы в среде может повлиять на результаты ферментации и что выход L-треонина в процессе ферментации может быть улучшен путем регуляции концентрации серы в ферментационном растворе на определенном уровне или ниже, и это изложено в настоящем изобретении.

Целью данного изобретения является разработка способа для получения L-треонина, который включает культивирование микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, который способен продуцировать L-треонин в ферментационной среде, содержащей источник углерода, источник азота и источник серы, а также выделение L-треонина из среды, при этом концентрация серы в среде регулируется на определенном уровне или ниже.

Следующей целью настоящего изобретения является разработка изложенного выше способа, при этом концентрация серы в ферментационой среде регулируется таким образом, что она составляет 0,35 г/л или ниже.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, при этом микроорганизмом является Escherichia coli.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, при этом фермент биосинтеза L-треонина в микроорганизме изменен таким образом, что он не является мишенью ингибирования L-треонином по механизму обратной связи.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, в котором фермент биосинтеза L-треонина выбран из группы, в которую входят аспартокиназа, гомосеринкиназа, треонинсинтаза и их комбинации.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, при этом источник серы выбран из группы, в которую входят сульфаты, тиосульфаты, сульфиты, цистеин, цистин, глутатион и их комбинации.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, в котором способ культивирования выбран из группы, в которую входят способ периодического культивирования, способ подпитываемого культивирования и способ непрерывного культивирования.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, в котором способом культивирования является способ подпитываемого культивирования или способ непрерывного культивирования, при этом подпитывающую среду, содержащую источник серы, добавляют к ферментирующей культуре.

Следующей целью настоящего изобретения является изложенный выше способ, в котором указанная подпитывающая среда содержит также источник углерода и питательный компонент, ускоряющий рост, при этом указанную подпитывающую среду добавляют к ферментационой среде непрерывно или периодически так, чтобы концентрация источника углерода в культуральной среде поддерживалась на уровне 30 г/л или ниже после окончания периода логарифмического роста микроорганизма.

Следующей целью настоящего изобретения является разработка способа получения кормовых добавок для животных на основе ферментации, включая

А) культивирование микроорганизма из рода Escherichia, который способен к продуцированию L-треонина в ферментационной среде, которая включает источник углерода, источник азота и источник серы,

Б) проведение ферментации, при этом концентрация серы в среде регулируется таким образом, что она поддерживается на определенном уровне или ниже,

В) высушивание необработанного ферментационного бульона до состояния, когда содержание воды составляет 10% по массе или менее.

Краткое описание чертежа

На чертеже изображена взаимосвязь между количеством исходно добавленной к среде серы и выходом L-треонина.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

1. Способ настоящего изобретения

Способом настоящего изобретения является способ получения L-треонина методом культивирования микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, который обладает способностью к продуцированию L-треонина в среде для ферментации, в которой содержится источник углерода, источник азота и источник серы, причем L-треонин продуцируется в среде, где концентрация серы регулируется таким образом, что она поддерживается на определенном уровне или ниже. В настоящем изобретении термин «концентрация серы» обозначает концентрацию источника серы, имея в виду концентрацию атомов серы.

Среда, используемая в настоящем изобретении, может быть любой жидкой средой, которая содержит источник углерода, источник азота и источник серы в виде питательных компонентов, и среда не особо ограничена, за исключением того, что в ней регулируется концентрация серы, которая поддерживается на определенном уровне или ниже. Источником серы может быть любое вещество, содержащее серу. Желательно использовать соли серной кислоты, такие как сульфаты, тиосульфаты и сульфиты, а также серосодержащие аминокислоты, такие так цистеин, цистин и глутатион. Среди данных особенно предпочтителен сульфат аммония. Перечень таких солей не особенно ограничен, также можно использовать соли аммония, соли кальция, соли натрия, соли калия, соли магния, соли марганца и соли железа. Более того, в среде может содержаться и один тип, и два типа, и даже больше типов таких веществ. Под обозначением концентрации «на определенном уровне или ниже» может быть любая концентрация, при которой выход L-треонина улучшен по сравнению с условиями высокой концентрации серы или в стандартной ферментационой среде. В особенности, концентрация серы в ферментационной среде предпочтительна 0,35 г/л или ниже, более предпочтительна 0,25 г/л или ниже и особенно предпочтительна 0,10 г/л или ниже. Одной из особенностей настоящего изобретения является то, что концентрация серы в ферментационой среде подлежит регуляции. Для способа, описанного в данном изобретении, могут быть использованы периодическая культура, культура с подпиткой и/или постоянная культура, и концентрацию серы в среде можно регулировать для удержания на определенном уровне или ниже в исходной среде, или ограничена на определенном уровне или ниже путем контролирования концентрации серы в подпитывающей среде, или можно использовать эти методы в сочетании. Для исходной среды и подпитывающей среды может быть использован один и тот же источник серы или же в подпитывающей среде может быть использован другой источник серы, нежели в исходной среде.

В настоящем изобретении среда с подпиткой обозначает метод культивирования, при котором среда добавляется непрерывно или периодически в сосуд во время культивирования, не удаляя среду из сосуда до окончания культивирования. Непрерывное культивирование означает метод непрерывного культивирования или периодического добавления среды в сосуд в течение культивирования и забор среды из сосуда (обычно в объеме, равном объему подпитывающей среды). Термин «исходная среда» означает среду, которая используется для периодической культуры до добавления подпитывающей среды при использовании подпитываемой культуры или постоянной культуры, а термин «подпитывающая среда» означает среду, которая вносится в ферментер, если производится культивирование с подпиткой или непрерывное культивирование. Подпитывающая среда может содержать все или только часть необходимых для роста микроорганизма компонентов. В настоящем изобретении термин «ферментационная среда» означает среду в ферментере, и L-треонин выделяется из данной ферментационной среды. Далее, в данном изобретении термин «ферментер» означает сосуд, в котором проводится ферментирование L-треонина, и он не ограничен по форме. Могут быть использованы бак или колба для ферментирования. Более того, у ферментера нет ограничения по объему до тех пор, пока можно получить и выделить L-треонин.

Несмотря на то, что концентрация серы предпочтительно ограничена на определенном уровне или ниже в течение всего процесса культивирования, ограничение по концентрации серы может иметь место только для части процесса. Например, когда способ данного изобретения включает стадию, когда клетки пролиферируют (фаза роста), и стадию, когда продуцируется L-треонин (L-треонин продуцирующая фаза), достаточно, чтобы концентрация серы была ограничена определенным уровнем или ниже в течение фазы продукции L-треонина. В фазе роста (во время пролиферации клеток) сера может присутствовать в среде в более высокой, чем определенная, концентрации, или же концентрация серы может быть в пределах определенного уровня или ниже. Более того, в фазу продукции L-треонина содержание серы не обязано находится в пределах вышеупомянутых значений в течение всего периода данной фазы, и содержание серы может быть в пределах вышеупомянутого уровня или выше его на раннем этапе данной фазы, и может быть сокращено со временем культивирования. И далее, серу можно периодически добавлять, кода ее уровень снижается. Термин «фаза роста», использующийся в настоящем изобретении, означает период в течение 3 часов, предпочтительно 6 часов, особенно предпочтительно 10 часов от начала культивирования, в течение которого источник углерода главным образом расходуется на рост бактериальных клеток, в логарифмической фазе роста. Термин “фаза продуцирования L-треонина”, использующийся в настоящем изобретении, означает период в течение 3 часов, предпочтительно 6 часов, особенно предпочтительно 10 часов, от начала культивирования, в течение которого источник углерода главным образом расходуется на продуцирование L-треонина.

Достаточно, чтобы в ферментационной среде содержалось минимальное количество серы, которое необходимо для роста микроорганизма; однако количество серы может временно подходить к концу. Фраза «подходить к концу» означает, что концентрация серы понижена в сравнении с предшествующими временными точками культивирования и даже может становится «0». Термин «временно» означает, что, например, в определенное время содержание серы может подойти к концу, и этот период времени соответствует примерно 20%, примерно 40% или в крайней степени примерно 60% от всего периода ферментации. Хотя концентрация серы временно может достигать 0, в течение этого времени содержание серы в ферментационной среде составляет 1 мкг/л или более, 10 мкг/л или более, или 100 мкг/л или более. Таким образом, даже если концентрация серы временно становится 0, выражение «культивирование микроорганизма, принадлежащего роду Escherichia, в ферментационной среде, содержащей источник углерода, источник азота и источник серы», подходит для описания культивирования в среде, содержащей серу в любое время. Концентрация серы в среде для культивирования можно измерять методом ионной хроматографии и методом горячего флакона.

Более того, согласно настоящему изобретению, концентрация серы в подпитывающей среде может быть доведена таким образом, чтобы она была в пределах предустановленной или ниже, если используется метод культивирования с подпиткой. Например, если концентрация серы ограничена при культивировании с подпиткой, предпочтительно следили за тем, чтобы концентрация серы в ферментационной среде была 0,35 г/л или менее, желательно 0,25 г/л или менее и более желательно 0,10 г/л или менее.

В настоящем изобретении примером источников углерода могут служить глюкоза, глицерин, фруктоза, сахароза, мальтоза, манноза, галактоза, гидролизированный крахмал и меласса. Особенно предпочтительны глюкоза и сахароза. В дополнение, могут быть использованы по одиночке или в сочетании с другими источниками углерода органические кислоты, такие как уксусная кислота и лимонная кислота, и спирты, такие как этанол. Более того, необработанным источником углерода может быть тростниково-сахарная меласса, меласса сахарной свеклы и цитрусовая меласса, а также гидролизаты природных сырых материалов, таких как целлюлоза, крахмал, зерновые культуры, крупы и тапиока. Помимо этого, в качестве источника углерода можно использовать растворенную в среде двуокись углерода. Данные источники углерода можно использовать для приготовления исходной среды и/или подпитывающей среды. В среде могут содержаться один или более видов этих источников углерода. Более того, для приготовления исходной и подпитывающей сред можно использовать один и тот же источник углерода или для приготовления подпитывающей среды можно использовать иной источник углерода, нежели при приготовлении исходной среды. К примеру, глюкозу можно использовать для приготовления исходной среды, а сахарозу - для приготовления подпитывающей среды.

В настоящем изобретении примером источников азота могут служить аммиак, соли аммония, такие как сульфат аммония, карбонат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, ацетат аммония, а также мочевина, нитраты и так далее. Газообразный аммиак или водный раствор аммиака, которые применяются для доведения рН, также могут быть использованы в качестве источника азота. Более того, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат соевых бобов и тому подобные также могут быть использованы. В среде могут содержаться один или более данных видов источников азота. Данные источники азота также могут быть использованы при приготовлении исходной среды и/или подпитывающей среды. Более того, для приготовления исходной и подпитывающей сред можно использовать один и тот же источник азота или для приготовления подпитывающей среды можно использовать иной источник азота, нежели при приготовлении исходной среды.

Более того, в настоящем изобретении среда предпочтительно содержит в добавление к источнику углерода, источнику азота и серы еще и источник фосфорной кислоты. В качестве источника фосфорной кислоты могут быть использованы дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия и фосфатные полимеры, такие как пирофосфорная кислота.

Кроме того, в настоящем изобретении среда может содержать факторы роста (питательные компоненты, которые обладают эффектом стимуляции роста) в дополнение к источнику углерода, источнику азота и серы. В качестве факторов роста могут быть использованы микроэлементы, аминокислоты, витамины, жирные кислоты, нуклеиновые кислоты, такие как пептон, казаминовая кислота, дрожжевой экстракт, гидролизат белков соевых бобов.

Примерами микроэлементов служат железо, марганец, магний, кальций, калий, натрий и так далее. Примерами витаминов служат витамин В₁, витамин В₂, витамин В₆, никотиновая кислота, никотинамид, витамин В₁₂, и так далее. Эти факторы роста могут содержаться в исходной среде или в подпитывающей среде.

При этом, если используется ауксотрофный мутант, который нуждается в аминокислоте или подобном веществе для своего роста, предпочтительно добавлять в среду требуемый питательный компонент. В особенности, в силу того, что путь биосинтеза L-треонина проактивирован, а способность к разложению L-треонина ослаблена у тех L-треонинсинтезирующих бактерий, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, как указано выше, предпочтительно добавлять L-лизин, L-гомосерин, L-изолейцин, L-метионин или их комбинации.

Состав исходной и подпитывающей сред может быть одинаковым или различаться. Более того, концентрация серы в исходной среде и в подпитывающей среде может быть одинаковая или различная. Кроме того, если подпитывающая среда добавляется на нескольких этапах, состав подпитывающей среды, добавляемой на каждом из этапов, может быть одинаковым или различным.

Культивирование предпочтительно проводить в условиях аэрации, предпочтительно проводить ферментирование при температуре от 20 до 45°С, особенно предпочтительно от 33 до 42°С. Концентрация кислорода предпочтительно настроена на уровне от 5 до 50% и более предпочтительно на уровне примерно 10%. Кроме того, аэрацию предпочтительно проводить в условиях рН от 5 до 9. Если в процессе культивирования рН снижается, то можно для нейтрализации добавить, к примеру, карбонат кальция или основания, такие как газообразный аммиак или водный раствор аммиака. Если культивирование производится при данных условиях, предпочтительно в течение примерно от 10 до 120 часов, в среде накапливается значительное количество L-треонина. Концентрация накопившегося L-треонина не ограничена в силу того, что L-треонин можно удалить и выделить из среды, и она составляет 50 г/л или выше, желательно 75 г/л или выше и более желательно 100 г/л или выше.

В настоящем изобретении культивирование микроорганизма можно проводить в рассеянной культуре и/или в основной культуре с целью добиться накопления L-треонина в концентрации выше определенного уровня. Рассеянное культивирование можно проводить путем встряхивания, используя колбу или же что-то подобное, или культивирование в условиях одного производственного цикла. Основную культуру можно вести как культуру с подпиткой или постоянную культуру. Как вариант, рассеиваемую культуру и основную культуру можно вести как периодическую культуру.

При данных методах культивирования, если концентрация L-треонина достигает определенного уровеня, можно удалить часть ферментационного бульона и добавить свежей среды для повторения культивирования. В качестве свежей среды предпочтительно использовать среду, содержащую источник углерода и питательные компоненты, способные стимулировать рост (факторы, стимулирующие рост), и предпочтительно, если она содержит серу в определенной концентрации или ниже. Выражение «определенная концентрация или ниже» означает, что добавляемая среда приготовлена таким образом, что концентрация серы в ферментационном бульоне составляет 0,35 г/л или менее, желательно 0,25 г/л или менее и более желательно 0,10 г/л или менее. В качестве источника углерода предпочтение отдается глюкозе, сахарозе и фруктозе. В качестве факторов роста предпочтение отдается источнику азота, фосфорной кислоте, аминокислотам и так далее. В качестве источника азота можно использовать аммиак, соли аммония, такие как сульфат аммония, карбонат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, ацетат аммония и мочевина, нитраты и так далее. Более того, в качестве источника фосфорной кислоты можно использовать дигидрофосфат калия и гидрофосфат калия. В качестве аминокислот, в случае применения штамма ауксотрофного мутанта, предпочтительно снабжать необходимой аминокислотой.

Если в рамках данного изобретения используется способ периодического культивирования или непрерывного культивирования, добавление подпитывающей среды можно временно приостановить, таким образом снабжение сахаридами или питательными компонентами временно приостановится. Внесение подпитывающей среды предпочтительно приостановить самое большее на 30%, желательно на 20% и особенно желательно на 10% от периода подпитки. Под «периодом подпитки» понимается период от начала первого внесения подпитывающей среды до конца последнего добавления подпитывающей среды. Приостановление добавления подпитывающей среды может быть меньше 30% и наиболее предпочтительно на менее чем 10%. Если подпитывающая среда добавляется периодически, то подпитывающую среду можно в первый раз добавить через определенное время, а повторно и все последующие разы можно производить добавки так, чтобы они начались после того, как компьютер зафиксирует повышение рН или концентрации растворенного кислорода. Данные опознания обычно происходят при истощении источника углерода в ферментационной среде во время добавления/приостановления перед этапом определенного добавления, и таким образом, концентрация субстрата в емкости для культивирования следует автоматически и в нужной мере поддерживать на низком уровне (Патент СШA No 5912113).

Подпитывающая среда, которая используется для культивирования с подпиткой, предпочтительно содержит источник углерода и питательный компонент с эффектом стимуляции роста (фактор, стимулирующий рост), и может содержать серу, причем концентрация серы в ферментационной среде поддерживается на определенном уровне или ниже. Выражение «определенная концентрация или ниже», использующееся здесь, означает, что добавляемая среда готовится таким образом, что концентрация серы в ферментационной среде поддерживается на уровне 0,35 г/л или ниже, желательно 0,25 г/л или ниже и более желательно 0,10 г/л или ниже. Несмотря на то, что концентрация серы в подпитывающей среде может быть в или вне пределов вышеуказанного промежутка концентраций, но предпочтительно в пределах вышеуказанного промежутка концентраций.

В качестве источника углерода предпочтение отдается глюкозе, сахарозе и фруктозе. В качестве факторов роста предпочтение отдается источнику азота, фосфорной кислоте, аминокислотам и так далее. В качестве источника азота можно использовать аммиак, соли аммония, такие как сульфат аммония, карбонат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, ацетат аммония и мочевина, нитраты и так далее. Более того, в качестве источника фосфорной кислоты можно использовать дигидрофосфат калия и гидрофосфат калия. В качестве аминокислот, в случае применения штамма ауксотрофного мутанта, предпочтительно снабжать необходимой аминокислотой. Помимо этого, подпитывающая среда может быть одинаковая или же быть композицией из двух или более типов сред. Если используются два или более типов подпитывающих сред, то среду можно смешивать и добавлять, используя одну емкость или используя две или более емкостей.

Более того, если применяется культивирование с подпиткой, то добавление осуществляется предпочтительно таким образом, что количество сахаридов в конечной ферментационной среде или общей среде, применяемой для культивирования с подпиткой, не превышает 30 г/л, предпочтительно 20 г/л и более предпочтительно 10 г/л. В особенности, концентрацию сахаридов следует контролировать таким образом, чтобы она находилась в пределах вышеуказанных концентраций после завершения фазы логарифмического роста микроорганизма. Частоту подпитывания источником углерода можно контролировать способом, описанным в Патенте США No. 5912113. Помимо этого, подпитывание сахаридами и фосфорной кислотой осуществляется таким образом, что концентрации сахаридов и фосфорной кислоты являются лимитирующими факторами роста бактериальных клеток. Содержание фосфорной кислоты в подпитывающей среде является таким, что отношение фосфор/углерод (Ф/У) составляет 2 или меньше, предпочтительно 1,5 или меньше и более предпочтительно 1 или меньше (Патент СШA No. 5763230).

Если в рамках настоящего изобретения использовать метод непрерывного культивирования, забор и добавление среды можно осуществлять одновременно или часть среды может быть отобрана и после этот среда добавляется. Более того, методика культивирования может быть основана на способе непрерывного культивирования, при этом при заборе культуральной среды, содержащей L-треонин и бактериальные клетки, осуществляется рециркуляция только бактериальных клеток в ферментер (Патент Франции No. 2669935). В качестве способа непрерывного или периодического добавления питательных компонентов используется такой же способ, как и при культивировании с подпиткой.

При периодическом заборе среды с культурой часть L-треонина может быть выделена, если концентрация L-треонина достигает определенного уровня, и для продолжения культивирования добавляется свежая среда. Более того, что касается количества свежей среды, которую требуется добавить, то конечный общий объем среды после добавления свежей среды равен объему среды для культивирования до момента экстракции. Термин «равен», использующийся здесь, означает приблизительно от 93 до 107% от объема культуральной среды до экстракции.

Если же культуральная среда непрерывно отводится, забор предпочтительно начать в то же время или после, что и добавление питательной среды. К примеру, время начала составляет максимально 5 часов, предпочтительно 3 часа, более предпочтительно 1 час после начала добавления. Более того, количество среды, которое забирается, предпочтительно равно количеству среды, которое добавляется.

Способ непрерывного культивирования с многократным использованием бактериальных клеток является способом, при котором периодически или непрерывно забирается среда из ферментационной среды, когда концентрация аминокислоты достигает определенного уровня, причем забирается только L-треонин, и после рециркулирующей фильтрации остатки, включая бактериальные клетки, попадают в ферментер, и это можно воспроизвести, ссылаясь, например, на Патент Франции No. 2669935.

Анализ на L-треонин и другие аминокислоты можно провести с помощью анионообменной хроматографии и последующим анализом продукта обработки нингидрином, как описано у Spackman и соавт. (Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958)), или с помощью ВЭЖХ с обратной фазой, как описано у Lindroth и соавт. (Analytical Chemistry 51:1167-1174).

2. Способ производства пищевой добавки для животных, основанный на ферментировании бульона, проведенном по способу данного изобретения

Изготовление пищевой добавки для животных согласно данному изобретению можно осуществить, придерживаясь следующей методики выделения.

Для удаления биомассы или уменьшения биомассы можно использовать такие способы отделения L-треонина, как центрифугирование, фильтрация, удаление хлопьев осадка или их комбинации.

Бульон, полученный согласно данному изобретению, можно уплотнить или сконцентрировать при помощи известных методик, таких как роторное эвапорирование, тонкослойное эвапорирование, обратный осмос или нанофильтрация (FR 8613346В, US 4997754, EP410005В, JP1073646В).

Сконцентрированный бульон далее подвергается воздействию таких способов, как замораживание-высушивание, спрэй-высушивание, спрэй-гранулирование, или другим обработкам для придания предпочтительно свободносыпучести, высокозернистости порошку для использования в качестве пищевой добавки для животных. Этот свободносыпучий, мелкозернистый порошок может быть переработан в крупнозернистый, высокосыпучий, устойчивый и в высокой степени свободный от пыли продукт, применяя подходящие процедуры прессования или гранулирования. В конечном итоге, более 90% воды удаляется таким способом, и в пищевой добавке остается лишь менее 10% воды, предпочтительно менее 5% от массы.

Содержание белка в пищевой добавке может быть менее 10%, предпочтительно менее 5% по весу, и концентрация L-треонина может быть более 50%, предпочтительно более 85% и более предпочтительно более 95% (US 5431933, JP 121463GB, US 4956471, US 4777051, US 4946654, US 5840358, US 6238714, US 2005/0025878).

Этап отделения, описанный выше, необязательно должен быть выполнен, но может быть совмещен технически подходящим способом.

3. Бактерии Escherichia, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения

Бактерии Escherichia, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, это бактерии Escherichia, которые способны продуцировть L-треонин, и термин «способны продуцировать L-треонин», использованный в настоящем изобретении, означает способность, если бактерии культивируются в среде, продуцировать свободный L-треонин в среду, то есть за пределы клетки, в таком количестве, чтобы L-треонин можно было выделить из среды. Предпочтительно, чтобы в рамках настоящего изобретения использовали такой штамм бактерии Escherichia, который производит большее количество L-треонина в сравнении со штаммами дикого типа или родственными штаммами. В особенности предпочтительно, если бактерия Escherichia продуцирует L-треонин в количестве 30 г/л или более, более предпочтительно 50 г/л или более, особенно предпочтительно 75 г/л или выше, при использовании обычных методов культивирования, в которых не контролируется концентрация серы.

Список исходных штаммов бактерий Escherichia, которые можно использовать для получения бактерий Escherichia с целью использовать их в рамках настоящего изобретения, особенно не ограничен, и конкретные примеры таковых упоминаются в работе Neidhardt и соавт. (Neidhardt, F.C. и соавт., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for microbiology, Washington D.C., 1029, таблица 1). Среди указанных, например, предпочтительно использовать Escherichia coli. Конкретными примерами Escherichia coli являются Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) и Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), которые (оба) происходят от одного прототипа - штамма К12 дикого типа, и так далее.

Что касается возможности приобретения указанных штаммов, то их можно получить, например, в Американском фонде типовых культур (адрес: P.O. box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America). Каждый бактериальный штамм имеет соответствующий регистрационный номер, и любой штамм можно заказать, указав его регистрационный номер. Регистрационные номера, соответствующие бактериальным штаммам, представлены в каталоге Американского фонда типовых культур.

3-1. Привнесение способности продуцировать L-треонин

Здесь и далее будет описан метод внедрения способности продуцировать L-треонин в бактерии Escherichia.

Для получения способности продуцировать L-треонин могут быть использованы такие общепринято адаптированные для разведения бактерий Escherichia или коринеформных бактерий методы, как получение ауксотрофного мутанта, штамма, устойчивого к аналогу, или штамма с мутацией на уровне регуляции метаболизма, каждый из которых обладает способностью продуцировать L-треонин в той же степени, как создание рекомбинантного штамма с усиленной активностью системы биосинтеза L-треонина. Для примера, мутант или рекомбинантный штамм могут быть изменены таким образом, чтобы фермент биосинтеза L-треонина не являлся мишенью ингибирования по механизму обратной связи, или рекомбинантный штамм может быть модифицирован с целью усиления экспрессии гена, кодирующего фермент биосинтеза L-треонина. При разведении бактерий, продуцирующих L-треонин такими способами, можно придать им свойства, такие как ауксотрофность, устойчивость к аналогу и мутацию в системе регуляции метаболизма, отдельно или в сочетании. При увеличении активности фермента биосинтеза L-треонина может быть увеличен один или более типов активностей данного фермента. Более того, придание свойств, упомянутых выше, и усиление активности фермента, как упомянуто выше, могут быть применены в сочетании.

Ниже следует описание варианта способа по внедрению способности к продуцированию L-треонина в бактерию Escherichia или усилению способности к продуцированию L-треонина посредством усиления активности фермента биосинтеза L-треонина. Для того чтобы усилить ферментативную активность можно, например, внести мутацию в ген, кодирующий фермент, или увеличить число копий гена, и в результате внутриклеточная активность фермента возрастет. Такого можно достичь посредством применения методик генной рекомбинации.

В число генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-треонина, входят ген аспартокиназы III (lysC), ген аспартатсемиальдегиддегидрогеназы (asd), ген аспартокиназы I в составе thr оперона (thrA, последовательность нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности SEQ ID NO:1), ген гомосеринкиназы (thrB, последовательность нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности SEQ ID NO:1) и ген треонинсинтазы (thrC, последовательность нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности SEQ ID NO:1). В скобках указаны аббревиатуры названий генов. Два или более этих генов могут быть введены в бактерию. Гены биосинтеза L-треонина можно ввести в бактерию Escherichia, в которой подавлены механизмы разрушения L-треонина. Примерами бактерий Escherichia, у которых подавлены механизмы разрушения треонина, являются штамм TDH6, который дефицитен по активности треониндегидрогеназы ЕР1149911А, и так далее.

Энзиматическая активность ферментов биосинтеза L-треонина подавляется L-треонином как конечным продуктом. В силу этого особое значение имеет создание L-треонинпродуцирующей бактерии с модифицированными генами биосинтеза L-треонина таким образом, чтобы ферменты не являлись мишенью ингибирования L-треонином по механизму обратной связи. Вышеупомянутые гены thrA, thrB и thrC составляют треониновый оперон, и треониновый оперон имеет структуру аттенюатора. Экспрессия треонинового оперона подавляется в присутствие изолейцина и треонина в культуральной среде и это осуществляется по механизму аттенюации. Вышеупомянутые модификации можно получить посредством удаления лидерной последовательности в участки аттенюатора (SEQ ID NO:6) или путем удаления аттенюатора (SEQ ID NO:1) (Междунаро