Терапия злокачественной опухоли, резистентной к препаратам на основе платины

Терапия злокачественной опухоли, резистентной к препаратам на основе платины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу лечения резистентных к препаратам на основе платины злокачественной опухоли яичника, первичной перитонеальной карциномы или карциномы фаллопиевой трубы комбинацией антитела против HER2, которое эффективно подавляет димеризацию HER, а также гемцитабина.

Уровень техники

Антитела против HER

Семейство HER рецепторных тирозинкиназ является семейством важных медиаторов роста, дифференциации и выживаемости клеток. Семейство рецепторов включает четыре различных члена, включающих рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1 или HER1), HER2 (ErbB2 или p185^neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2).

EGFR, кодируемый геном erbB1, в основном принимает участие в развитии злокачественных образований у человека. В частности, наблюдали повышенную экспрессию EGFR в злокачественных опухолях молочной железы, мочевого пузыря, легких, головы, шеи и желудка, а также в глиобластоме. Повышенная экспрессия EGFR-рецептора часто связана с увеличенной продукцией лиганда EGFR, трансформирующего фактора роста альфа (ТФР-α, ТGF-α), теми же опухолевыми клетками, приводя к активации рецептора аутокринным стимулирующим путем. Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther., 64: 127-154 (1994). Оценивали эффективность моноклональных антител против EGFR или его лигандов, ТФР-α и EGF, в качестве терапевтических средств для лечения таких злокачественных образований. Смотри, например, Baselga and Mendelsohn, выше; Masui et al., Cancer Research, 44: 1002-1007 (1984) и Wu et al., J. Clin. Invest., 95: 1897-1905 (1995).

Второй член семейства HER, p185^neu, первоначально был установлен в качестве продукта трансформирующего гена из нейробластомы у обработанных химическими соединениями крыс. Активная форма протоонкогена neu возникает в результате точечной мутации (валин в глутаминовую кислоту) в трансмембранной области кодируемого белка. Амплификацию человеческого гомолога neu наблюдают в злокачественных опухолях молочной железы и яичника, и она коррелирует с плохим прогнозом (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989) и патент США № 4968603). К настоящему времени не сообщалось о точечных мутациях, подобных в протоонкогене neu, для человеческих опухолей. Также наблюдали сверхэкспрессию HER2 (часто, но не во всех случаях в результате амплификации гена) в других карциномах, включая карциному желудка, эндометрия, слюнной железы, легких, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря. Смотри, например, среди прочих King et al., Science, 229: 974 (1985); Yokota et al., Lancet, 1: 765-767 (1986); Fukushige et al., Mol. Cell Biol., 6: 955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner et al., Cancer Research, 50: 421-425 (1990); Kern et al., Cancer Research, 50: 5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer, 57: 358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology, 59: 46-52 (1991) и МcCann et al., Cancer, 65: 88-92 (1990). HER2 может сверхэкспрессироваться в злокачественной опухоли простаты (Gu et al., Cancer Lett., 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79: 2162-70 (1997) и Sadasivan et al., J. Urol., 150: 126-31 (1993)).

Описаны антитела против крысиного p185^neu и белковых продуктов человеческого HER2. Drebin и соавторы получили антитела против продукта крысиного гена neu, p185^neu. Смотри, например, Drebin et al., Cell, 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991) и WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2: 273-277 (1988) сообщают, что смеси антител, реагирующих с двумя различными областями p185^neu, приводят к синергическим противоопухолевым эффектам в отношении трансформированных neu клеток NIH-3T3, имплантированных голым мышам. Также смотри патент США № 5824311 от 20 октября 1998 г.

Hudziak et al., Mol. Cell Biol., 9(3): 1165-1172 (1989) описывают получение панели антител против HER2, которые были охарактеризованы с использованием клеток опухоли молочной железы SK-BR-3. Определяли относительную клеточную пролиферацию клеток SK-BR-3 после воздействия антител по окрашиванию монослоев кристаллическим фиолетовым через 72 ч. С использованием данного теста максимальное ингибирование получали с антителом, названным 4D5, которое подавляло клеточную пролиферацию на 56%. Другие антитела в данной панели снижали клеточную пролиферацию в меньшей степени в данном тесте. Дополнительно было установлено, что антитело 4D5 сенсибилизирует клетки опухоли молочной железы со сверхэкспрессией HER2 к цитотоксическому действию ТФР-α. Смотри также патент США № 5677171 от 14 октября 1997 г. Антитела против HER2, обсужденные Hudziak et al., были дополнительно охарактеризованы Fendly et al., Cancer Research., 50: 1550-1558 (1990); Kotts et al., In vitro 26(3): 59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell Biol., 11(2): 979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37: 255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9: 1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research, 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol Chem., 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266: 14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996); и Schaefer et al., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997).

Рекомбинантный гуманизированный вариант мышиного антитела против HER2 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb, трастузумаб или HERCEPTIN®; патент США № 5821337) является клинически эффективным у пациенток с метастазирующими злокачественными опухолями молочной железы со сверхэкспрессией HER2, которые до этого получали продолжительную противоопухолевую терапию (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14: 737-744 (1996)). Трастузумаб разрешен к применению Администрацией по санитарному надзору за продуктами питания и медикаментами от 25 сентября 1998 г. для лечения пациенток с метастазирующими опухолями молочной железы со сверхэкспрессией белка HER2.

Описаны другие антитела к HER2 с различными свойствами Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47: 933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4: 543-548 (1989); Mair et al., Cancer Res., 51: 5361-5369 (1991); Bakus et al., Molecular Carcinogenesis, 3: 350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bakus et al., Cancer Research, 52: 2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research, 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res., 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267: 15160-15167 (1992); патент США № 5783186 и Klapper et al., Oncogene, 14: 2099-2109 (1997).

В результате скрининга на гомологию было идентифицировано два других члена семейства рецепторов HER: HER3 (патенты США № 5183884 и 5480968, а также Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) и HER4 (заявка на Европейский патент № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) и Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Для обоих данных рецепторов характерна повышенная экспрессия, по меньшей мере, в некоторых клеточных линиях опухолей молочной железы.

Как правило, рецепторы HER обнаруживают в различных комбинациях в клетках, и полагают, что гетеродимеризация повышает разнообразие ответных реакций на различные лиганды HER (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment, 35: 115-132 (1995)). EGFR связывается с шестью различными лигандами: эпидермальным фактором роста (EGF), трансформирующим фактором роста альфа (ТФР-α), амфирегулином, связывающимся с гепарином эпидермальным фактором роста (НВ-EGF), бетацеллюлином и эпирегулином (Groenen et al., Growth Factors, 11: 235-257 (1994)). Семейство белков герегулинов, происходящих в результате альтернативного сплайсинга одного гена, представляют лиганды для HER3 и HER4. Семейство герегулинов включает альфа, бета и гамма герегулины (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); патент США № 5641869 и Schaefer et al., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)); факторы дифференциации neu (NDF); глиальные факторы роста (GGF); рецептор, индуцирующий активность ацетилхолина (ARIA); и факторы сенсорных и двигательных нейронов (SMDF). Обзор смотри у Groenen et al., Growth Factors, 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell Neurosci., 7: 247-262 (1996); и Lee et al., Pharm. Rev., 47: 51-85 (1995). Недавно было идентифицировано три дополнительных лиганда HER: нейрегулин-2 (NRG-2), о котором сообщалось, что он связывается с HER3 или HER4 (Chang et al., Nature, 387: 509-512 (1997) и Carraway et al., Nature, 387: 512-516 (1997)); нейрегулин-3, который связывается с HER4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18): 9562-7 (1997)); и нейрегулин-4, который связывается с HER4 (Harari et al., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)) HB-EGF, бетацеллюлин и эпирегулин, которые также связываются с HER4.

Несмотря на то, что EGF и ТФРα не связываются с HER2, EGF стимулирует EGFR и HER2 к образованию гетеродимера, который активирует EGFR и приводит к трансфосфорилированию HER2 в гетеродимере. Оказалось, что димеризация и/или трансфосфорилирование активируют тирозинкиназу HER2. Смотри Earp et al., выше. Аналогично, когда HER3 коэкспрессируется с HER2, то образуется активный сигнальный комплекс, и антитела против HER2 способны разрушать данный комплекс (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Дополнительно аффинность HER3 для герегулина (HRG) повышается до состояния более высокой аффинности при коэкспрессии с HER2. Также смотри Levi et al., Journal of Neuroscience, 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1431-1435 (1995) и Lewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) в отношении белкового комплекса HER2-HER3. HER4, подобно HER3, образует активный сигнальный комплекс с HER2 (Carraway and Cantley, Cell, 78: 5-8 (1994)).

Злокачественная опухоль яичника

Злокачественная опухоль яичника является наиболее частой причиной смерти от злокачественных образований органов репродуктивной системы у женщин. Ежегодно в США регистрируется 24000 новых диагнозов при смертности от данного заболевания на уровне примерно 13000. Пациентки с далеко зашедшим раком яичника часто подвергаются лечению химиотерапией препаратами на основе платины, часто в комбинации с таксаном. При отсутствии эффективности данных препаратов имеется небольшой выбор терапевтических средств. Часто пациентки с опухолями, чувствительными к препаратам на основе платины, повторно подвергаются лечению платиной, но у значительной части пациенток наблюдается незначительная продолжительность ответной реакции на повторное лечение. Результативность лечения у пациенток с опухолью, резистентной к препаратам на основе платины, еще ниже. Топотекан разрешен к применению Администрацией по санитарному надзору за продуктами питания и медикаментами (FDA) для пациенток с отсутствием эффективности первоначальной или последующей химиотерапии; липосомальный доксорубицин разрешен только для пациенток со злокачественной опухолью яичника, которая резистентна к химиотерапии препаратами платины и паклитакселом. Было показано, что топотекан и липосомальный доксорубицин вызывают частичную ответную реакцию соответственно у 6 и 12% пациенток с опухолью, резистентной к препаратам на основе платины, при среднем значении выживаемости без прогрессирования заболевания, составляющем 14-18 недель. Совсем недавно сообщалось об обещающих результатах с гемцитабином при опухоли яичника с резистентностью к препаратам платины при наличии частичной ответной реакции на уровне 16%, что привело к повышенному применению данного средства в качестве 2 линии терапии. Однако существует четкая потребность в новых и усовершенствованных лекарственных препаратах для пациенток с далеко зашедшим раком яичника, для которых имеющиеся в настоящее время средства терапии не эффективны.

ErbB или семейство рецепторов человеческого эпидермального фактора роста (HER) принимает участие в патогенезе рака яичника. Для целенаправленного воздействия на сигнальный путь с участием HER был разработан пертузумаб (rhuMAb 2C4) в качестве гуманизированного антитела, которое подавляет димеризацию HER2 с другими HER-рецепторами, тем самым ингибируя лиганд-регулируемые фосфорилирование и активацию и даунстрим активацию путей RAS и АКТ.

Гемцитабин применяли для лечения различных опухолей, и он показан для применения при раке поджелудочной железы и легких. Наиболее частым проявлением токсичности при применении гемцитабина в качестве одного средства является цитопения с частотой проявления анемии и нейтропении, равной соответственно 68 и 63%. Другим обычным видом токсичности является тошнота и рвота при общей частоте на уровне 69%, при 13% III степени и 1% IV степени. Диарея имеет место реже в 19% случаев. Кожные высыпания проявляются чаще в 30% случаев при том, что III степени только в 1% случаев. Гемцитабин комбинировали со многими другими химиотерапевтическими средствами, такими как таксаны, антрациклины и препараты на основе платины, без какой-либо существенной повышенной или неожиданной токсичности.

Трастузумаб сочетали с гемцитабином в нескольких комбинациях различных химиотерапевтических средств на фазе II клинических испытаний, и он также хорошо переносился без проявления сердечной или неожиданной токсичности. Safran et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20: 130a (2001); Miller et al., Oncology, 15(2): 38-40 (2001). Смотри также Zinner et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20: 328a (2001); Nagourney et al., Breast Cancer Res. Treat., 57: 116, Abstract, 475 (1999); Bun et al., Proc. Am. Assoc. Canc. Res., 41: 719, Abstract #4571 (2000); Konecny et al., Breast Cancer Res. Treat., 57: 114, Abstract 476 (1999); O'Shaugnessy et al., Sem. Oncol., 2(suppl 3): 22-26 (2004); Sledge et al., Sem. Oncol., 2(suppl 3): 19-21 (2003); Zinner et al., Lung Cancer, 44(1): 99-110 (2004); Gatzemeier et al., Ann. Of Oncol., 15: 19-27 (2004), касающиеся комбинации трастузумаба и гемцитабина.

В фазе I клинических испытаний омнитарга в качестве единственного средства для лечения солидных опухолей 3 пациентки с далеко зашедшим раком яичника подверглись лечению пертузумабом. У одной была длительная частичная ответная реакция и у одной пациентки наблюдали стабилизацию заболевания в течение 15 недель. Agus et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22: 192, Absract 771 (2003).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится, в первом аспекте, к способу лечения злокачественной опухоли, резистентной к препаратам на основе платины, выбранной из группы, состоящей из злокачественной опухоли яичника, первичной перитонеальной карциномы и карциномы фаллопиевых труб, включающему введение пациентке антитела против HER2, которое подавляет димеризацию HER более эффективно по сравнению с трастузумабом, и химиотерапевтического средства антиметаболита в количествах, эффективных для лечения злокачественной опухоли.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, резистентной к препаратам на основе платины, выбранной из группы, состоящей из злокачественной опухоли яичника, первичной перитонеальной карциномы и карциномы фаллопиевых труб, включающему введение пациентке антитела против HER2, которое связывается с гетеродимерным связывающим сайтом в HER2, и гемцитабина в количествах, эффективных для лечения злокачественной опухоли.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, резистентной к препаратам на основе платины, выбранной из группы, состоящей из злокачественной опухоли яичника, первичной перитонеальной карциномы и карциномы фаллопиевых труб, включающему введение пациентке антитела против HER2, которое связывается с доменом II HER2, и гемцитабина в количествах, эффективных для лечения злокачественной опухоли.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А и 1В представлено картирование эпитопа остатков 22-645 во внеклеточном домене (ECD) HER2 (аминокислотная последовательность, включая сигнальную последовательность, представленная на фиг.1А; SEQ ID NO: 13), по данным анализа усеченния мутанта и сайт-направленного мутагенеза (Nakamura et al., J. of Virology 67(10): 6179-6191 (1993); и Renz et al., J. Cell Biol., 125(6): 1395-1406 (1994)). Различные усечения HER2-ECD или точечные мутации получали из кДНК с использованием технологии полимеразной цепной реакции. Мутанты HER2 экспрессировали в виде гибридных белков gD в экспрессирующей плазмиде млекопитающих. В данной экспрессирующей плазмиде используется промотор/энхансер цитомегаловируса с сигналами терминации и полиаденилирования SV40, расположенными справа (в положении даунстрим) от вставленной кДНК. Плазмидную ДНК трансфектировали в клетки 293. Через 1 сутки после трансфекции в клетки метаболически вводили метку в течение ночи в среде DMEM без метионина и цистеина с низкой концентрацией глюкозы, содержащей 1% диализованной фетальной телячьей сыворотки и 25 мкКи каждого ³⁵S-метионина и ³⁵S-цистеина. Собирали супернатанты и к супернатантам добавляли моноклональные антитела против HER2 или контрольные антитела и инкубировали в течение 2-4 ч при 4°С. Комплексы преципитировали, наносили на 10-20% градиентный гель трицин-SDS и подвергали электрофорезу при 100 В. Гель электрофоретически переносили на мембрану и авторадиографировали. Как показано на фиг.1В, антитела против HER2 7С2, 7F3, 2C4, 7D3, 3Е8, 4D5, 2H11 и 3Р4 связываются с различными эпитопами HER2 ECD.

На фиг.2А и 2В показано влияние моноклональных антител против HER2 2C4 и 7F3 на активацию rHRGβ1 в клетках МCF7. На фиг.2А представлены кривые зависимости для ингибирования под действием 2C4 или 7F3 стимулированного HRG фосфорилирования тирозина. На фиг.2В представлены кривые зависимости для ингибирования связывания ¹²⁵I-меченого rHRGβ_177-244 с клетками МCF7 под действием антител 2C4 или 7F3.

На фиг.3 показано ингибирование специфического связывания ¹²⁵I-меченого rHRGβ_177-244 с панелью человеческих опухолевых клеток под действием моноклональных антител 2C4 или 7F3 против HER2. Моноклональными контрольными антителами являются изотипные мышиные моноклональные антитела, которые не блокируют связывание rHRG. Неспецифическое связывание ¹²⁵I-меченого rHRGβ_177-244 определяли с использованием параллельных инкубационных смесей в присутствии 100 нМ rHRGβ1. Значения неспецифического связывания ¹²⁵I-меченого rHRGβ_177-244 составляло менее 1% от общего значения для всех тестированных клеток.

На фиг.4А и 4В показано влияние моноклональных антител 2C4 или 4D5 на пролиферацию клеток MDA-MB-175 (фиг.4А) и SK-BR-3 (фиг.4В). Клетки MDA-MB-175 и SK-BR-3 высевали в 96-луночные планшеты и давали прикрепиться в течение 2 ч. Опыт проводили в среде, содержащей 1% сыворотки крови. Вносили антитела против HER2 или одну среду и клетки инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Затем добавляли rHRGβ1 (1 нМ) или одну среду и клетки инкубировали в течение 4 суток. Монослои промывали и окрашивали/фиксировали 0,5% кристаллическим фиолетовым. Пролиферацию клеток оценивали по поглощению при 540 нм.

На фиг.5А и 5В показано влияние моноклонального антитела 2C4, антитела трастузумаба или анти-EGFR-антитела на зависимую от герегулина (HRG) ассоциацию HER2 с HER3 в клетках MCF7, экспрессирующих низкий/нормальный уровень HER2 (фиг.5А), и клетках SK-BR-3, экспрессирующих высокие уровни HER2 (фиг.5В); смотри пример 2 ниже.

На фиг.6А и 6В приводится сравнение активности интактного мышиного моноклонального антитела 2С4 (mu 2С4) и химерного Fab-фрагмента антитела 2С4. На фиг.6А показано ингибирование связывания ¹²⁵I-HRG с клетками MCF7 химерным Fab-фрагментом 2С4 или интактным мышиным моноклональным антителом 2С4. Клетки MCF7 высевали в 24-луночные планшеты (1×10⁵ клеток/лунку) и культивировали до 85% слияния в течение 2 суток. Опыты по связыванию проводили, как описано Lewis et al., Cancer Researh, 56: 1457-1465 (1996). На фиг.6В показано ингибирование активации rHRGβ1 фосфорилирования тирозина р180 в клетках MCF7, проводимое, как описано Lewis et al., Cancer Researh, 56: 1457-1465 (1996).

На фиг.7А и 7В представлено сопоставление аминокислотных последовательностей вариабельного домена легкой цепи (V_L) (фиг.7А) и вариабельного домена тяжелой цепи (V_Н) (фиг.7В) мышиного моноклонального антитела 2С4 (соответственно SEQ ID NO 1 и 2); доменов V_L и V_Н гуманизированного варианта 2С4 574 (соответственно SEQ ID NO 3 и 4) и консенсусных каркасных областей человеческих V_L и V_Н (hum κ1, подгруппа I легкой цепи каппа; humIII, подгруппа III тяжелой цепи) (соответственно SEQ ID NO 5 и 6). Звездочки указывают различия между гуманизированным вариантом 2С4 574 и мышиным моноклональным антителом 2С4, или гуманизированным вариантом 2С4 574 и человеческой каркасной областью. В рамках находятся определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.8А-С показано связывание химерного Fab 2С4 (Fab.v1) и нескольких гуманизированных вариантов 2С4 с внеклеточным доменом HER2 (ECD) по данным определения ELISA в примере 3.

Фиг.9 представляет ленточную схему доменов V_L и V_Н моноклонального антитела 2С4 с представленным в белом цвете остовом CDR (L1, L2, L3, H1, H2, H3). Также показаны боковые цепи V_Н, определенные мутагенезом во время гуманизации (смотри пример 3, таблица 2).

На фиг.10 показано влияние моноклонального антитела 2С4 или трастузумаба на опосредуемую EGR, ТФР-α и HRG активацию митоген-активированной протеинкиназы (МАРК).

На фиг.11А и 11В представлены аминокислотные последовательности соответственно легкой цепи трастузумаба (SEQ ID NO: 14) и тяжелой цепи трастузумаба (SEQ ID NO: 15).

На фиг.12А и 12В представлены аминокислотные последовательности соответственно легкой цепи пертузумаба (SEQ ID NO: 16) и тяжелой цепи пертузумаба (SEQ ID NO: 17).

На фиг.13 схематично показано связывание 2С4 с гетеродимерным связывающим сайтом HER2, посредством чего предупреждается гетеродимеризация с активированными EGFR и HER3.

На фиг.14 показана связь HER2/HER3 с путями МАРК и Akt.

На фиг.15 приводится сравнение активности трастузумаба и пертузумаба.

На фиг.16 схематично представлены различные домены HER2.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

I. Определения

"Рецептор HER" представляет рецепторную протеин-тирозинкиназу, которая относится к семейству рецепторов HER и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 и другие члены данного семейства, которые будут установлены в будущем. Как правило, рецептор HER содержит внеклеточный домен, который может связываться с лигандом HER; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный домен тирозинкиназы и С-концевой сигнальный домен, содержащий несколько остатков тирозина, которые могут фосфорилироваться. Рецептор HER может быть рецептором HER с "природной последовательностью" или его "вариантом аминокислотной последовательности". Предпочтительно рецептор HER представляет рецептор HER с природной человеческой последовательностью.

Внеклеточный домен HER2 включает четыре домена, домен I (аминокислотные остатки примерно 1-195), домен II (аминокислотные остатки примерно 196-320), домен III (аминокислотные остатки примерно 321-488) и домен IV (аминокислотные остатки примерно 489-632) (нумерация остатков без сигнального пептида). Смотри Garrett et al., Mol. Cell., 11: 495-505 (2003); Cho et al., Nature, 421: 756-760 (2003); Franklin et al., Cancer Cell., 5: 317-328 (2004) и Рlowman et al., Рroc Natl. Acad. Sci., 90: 1746-1750 (1993), и фиг.16 здесь.

Термины "ErbB1", "HER1", "рецептор эпидермального фактора роста" и "EGFR" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к EGFR, раскрытому, например, Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), включающему его природные мутантные формы (например, смотри мутантный EGFR как результат делеции у Humphrey et al. PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). erbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт, EGFR.

Выражения "ErbB2" и "HER2" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к человеческому белку HER2, описанному, например, Semba et al., PNAS (USA), 82: 6497-6501 (1985) и Yamamoto et al., Nature, 319: 230-234 (1986) (номер для доступа в Genеbank X033363). Термин "erbB2" относится к гену, кодирующему человеческий ErbB2, и "neu" относится к гену, кодирующему крысиный р185^neu. Предпочтительный HER2 представляет природную человеческую последовательность HER2.

"ErbB3" и "HER3" относятся к рецепторному полипептиду, раскрытому, например, в патентах США № 5183884 и 5480968, а также Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989).

"ErbB4" и "HER4" относятся здесь к рецепторному полипептиду, раскрытому, например, в заявке на Европейский патент № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); и Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993), включая его изоформы, например, раскрытые в WO 99/19488, опубликованной 22 апреля 1999 г.

Под "лигандом HER" понимается полипептид, который связывается и/или активирует рецептор HER. Представляющим особый интерес лигандом HER является лиганд HER с человеческой природной последовательностью, такой как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247: 7612-7621 (1972)); трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science, 223: 1079-1082 (1984)); амфирегулин, также известный как шванома или аутокринный фактор роста кератиноцитов (Shoyab et al., Science, 243: 1074-1076 (1989)); Kimura et al., Nature, 348: 257-260 (1990) и Cook et al., Mol. Cell Biol., 11: 2547-2557 (1991)); бетацеллюлин (Shing et al., Science, 259: 1604-1607 (1993)) и Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993)); гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251: 936-939 (1991)); эпирегулин (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270: 7495-7500 (1995) и Komurasaki et al., Onkogene, 15: 2841-2848 (1997); герегулин (смотри ниже); нейрегулин-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387: 512-516 (1997); нейрегулин-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567 (1997); нейрегулин-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene, 18: 2681-89 (1999) или крипто (CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem., 272(6): 3330-3335 (1997)). Лиганды HER, которые связываются с EGFR, включают EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, НВ-EGF и эпирегулин. Лиганды HER, которые связываются с HER3, включают герегулины. Лиганды, которые способны связываться с HER4, включают бетацеллюлин, эпирегулин, НВ-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и герегулины.

"Герегулин" (HRG) в том смысле, в котором здесь используется данный термин, относится к полипептиду, кодируемому продуктом гена герегулина, раскрытому в патенте США № 5641869 или Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Примеры герегулинов включают герегулин-α, герегулин-β1, герегулин-β2 и герегулин-β3 (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992) и патент США № 5641869); фактор дифференциации neu (NDF) (Peles et al., Cell, 69: 205-216 (1992)); индуцирующий активность ацетилхолинового рецептора (ARIA) (Falls et al., Cell, 72: 801-815 (1993)); глиальные факторы роста (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); факторы, полученные из сенсорных и двигательных нейронов (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); γ-герегулин (Schaefer et al., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)). Термин включает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотных последовательностей полипептида HRG с природной последовательностью, такие как EGF-подобные фрагменты его домена (например, HRGβ1_177-244).

"Димер HER" представляет нековалентно связанный димер, содержащий, по меньшей мере, два различных рецептора HER. Такие комплексы могут образоваться, когда клетка, экспрессирующая два или более рецепторов HER, подвергается воздействию лиганда HER, и их можно выделить, например, иммунопреципитацией и подвергнуть анализу электрофорезом в SDS-PAGE, как описано Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Примеры таких димеров HER включают гетеродимеры EGFR-HER2, HER2-HER3 и HER3-HER4. Кроме того, димер HER может включать два или более рецепторов HER2 в комбинации с другим рецептором HER, таким как HER3, HER4 или EGFR. С димером могут быть связаны другие белки, такие как субъединица рецептора цитокина (например, gp 130).

"Гетеродимерный связывающий сайт" в HER относится к области во внеклеточном домене HER2, который контактирует или граничит с областью во внеклеточном домене EGFR, HER3 или HER4 при образовании с ним димера. Данная область обнаружена в домене II HER2. Franklin et al., Cancer Cell, 5: 317-328 (2004).

"Активация HЕR" или "активация HER2" относится к активации или фосфорилированию одного или более рецепторов HЕR или рецепторов HЕR2. Как правило, активация HЕR приводит к передаче сигнала (например, который индуцируется внутриклеточным доменом киназы рецептора HЕR, фосфорилируя остатки тирозина в рецепторе HЕR или полипептиде-субстрате). Активация HЕR может опосредоваться лигандом HЕR, связывающимся с димером HЕR, содержащим интересующий HЕR-рецептор. Связывание лиганда HЕR с димером HЕR может активировать домен киназы одного или более рецепторов HЕR в димере и, тем самым, приводить к фосфорилированию остатков тирозина в одном или более рецепторов HЕR и/или фосфорилированию остатков тирозина в дополнительном субстрате-полипептиде(ах), таком как внутриклеточные киназы Akt или МАРК.

Полипептид с "природной последовательностью" представляет таковой, который имеет такую же аминокислотную последовательность в виде полипептида (например, рецептор HЕR или лиганд HЕR), полученного из природы. Такие полипептиды с природной последовательностью можно выделить из природы или можно получить рекомбинантными или синтетическими путями. Таким образом, полипептид с природной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность природного человеческого полипептида, мышиного полипептида или полипептида от любого другого вида млекопитающих.

Термин "вариант аминокислотной последовательности" относится к полипептидам, имеющим аминокислотные последовательности, которые до некоторой степени отличаются от полипептида с природной последовательностью. Как правило, варианты аминокислотных последовательностей будут обладать, по меньшей мере, примерно 70% гомологией, по меньшей мере, с одним доменом связывания рецептора природного лиганда HЕR или, по меньшей мере, с одним доменом связывания лиганда природного рецептора HЕR, и, предпочтительно, они будут, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90% гомологичны с доменами связывания такого рецептора или лиганда. Варианты аминокислотных последовательностей включают замены, делеции и/или вставки в определенных положениях аминокислотной последовательности природной аминокислотной последовательности.

"Гомология" определяется как процент остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые являются идентичными после сопоставления последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимальной процентной гомологии. Способы и компьютерные программы для сопоставления хорошо известны в данной области. Одной такой компьютерной программой является "Align 2" производства Genentech, Inc., которая была подана с документацией для пользователя в United States Copyright Office, Washington, DC 20559, 10 декабря 1991.

Термин "антитело" в том смысле, в котором он здесь используется, применятся в самом широком смысле, и, в частности, он включает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифически антитела), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител, и фрагменты антитела, при условии, что они обладают желаемой биологической активностью.

Термин "моноклональное антитело" в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу, полученному из популяции в основном однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связываются с одним эпитопом, за исключением возможных вариантов, которые могут появиться во время получения моноклонального антитела, где такие варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты в антигене. Помимо их специфичности моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они не содержат примесей других иммуноглобулинов. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела как полученного в основном из однородной популяции антител и не сводится к необходимости получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или можно получить методами рекомбинантной ДНК (смотри, например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделить из фаговых библиотек антител с использованием, например, методов, описанных Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела здесь, в частности, включают "химерные" антитела, в которых область тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной с соответствующими последовательностями в антителах, полученных от определенного вида или относящимся к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или относящимся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Интересующие химерные антитела здесь включают "приматизированные" антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от примата, не относящегося к человеку (например, низшие узконосые обезьяны, высшие обезьяны и т.д.), и последовательности человеческой константной области.

"Фрагменты антитела" включают участок интактного антитела, предпочтительно содержащий его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, полученные из фрагмента(ов) антитела.

"Интактное антитело" представляет таковое, которое содержит антигенсвязывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (C_L) и константные домены тяжелой цепи С_Н1, С_Н2 и С_Н3. Константные домены могут представлять собой константные домены с природной последовательностью (например, константные домены с человеческой природной последовательностью) или их вариант аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело обладает одной или более эффекторных функций.

"Эффекторные функции" антитела относятся к таким биологическим активностям, присущим области Fс (Fс-область природной последовательности или Fс-область варианта аминокислотной последовательности) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fс-рецептора; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даун-регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR) и т.д.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей интактные антитела можно подразделить на различные "классы". Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgМ, и некоторые из них можно дополнительно подразделить на "подклассы" (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgА1 и IgА2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, обозначают соответственно α, δ, ε, γ и µ. Структуры субъединиц трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

"Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" и "АDCC" относятся к клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fс-рецепторы (FсR) (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Основные клетки для опосредования АDCC, клетки NK, экспрессируют только FсγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FсγRI, FсγRII и FсγRIII. Экспрессия FсR на гематопоэтических клетках в обобщенном виде представлена в таблице 3 на странице 464 у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). Для оценки активности АDCC интересующей молекулы можно провести тест АDCC в условиях in vitro, такой как описан в патентах США № 5500362 или 5821337. Подходящие эффекторные клетки для постановки таких тестов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно активность АDCC интересующей молекулы можно оценить в условиях in vivo на животной модели, такой как раскрыта Clynes et al. PNAS (USA), 95: 652-656 (1998).

"Человеческие эффекторные клетки" представляют лейкоциты, которые экспрессируют один или более FсR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FсγRIII и осуществляют эффекторные функции АDCC. Примеры человеческих лейкоцитов, которые опосредуют АDCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при том, что РВМС и NK являются предпочтительными. Эффекторные клетки можно выделить из их природного источника, например из крови или РВМС, как здесь описано.

Термины "Fс-рецептор" или "FсR" используются для обозначения рецептора, который связывается с Fс-областью антитела. Предпочтительный FсR представляет человеческий FсR с природной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FсR является таковой, который связывается с IgG антителом (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FсγRI, FсγRII и FсγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы таких рецепторов. Рецепторы FсγRII включают FсγRIIА ("активирующий рецептор") и FсγRIIВ ("ингибирующий рецептор"), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, в основном различающиеся по их цитоплазматическим доменам. Активирующий рецептор FсγRIIА содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FсγRIIВ содержит иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ITIM) в его цитоплазматическом домене (смотри обзор Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Имеются обзоры по FсR у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Другие FсR, включая таковые, которые будут открыты в будущем, объединяются здесь термино