Варианты бета-цепи hgf

Варианты бета-цепи hgf

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Настоящая заявка является непредварительной заявкой, поданной в соответствии с 37 CFR 1.53 (b)(1), по которой заявляется приоритет в соответствии с 35 USC 119(e) по предварительной заявке номер 60/671 610, поданной 15 апреля 2005 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится, в основном, к области молекулярной биологии и регуляции факторами роста. Более конкретно настоящее изобретение относится к модуляторам сигнального пути HGF/c-met и к использованию указанных модуляторов.

Предпосылки создания изобретения

Фактор роста гепатоцитов (HGF), также известный как скаттер-фактор, или фактор рассеивания (SF), представляет собой лиганд для Met (Bottaro et al., 1991), рецептора тирозинкиназы, который кодируется протоонкогеном c-met (Cooper et al., 1984a & b). Связывание HGF с Met индуцирует фосфорилирование внутриклеточного домена киназы, что приводит к активации сложного комплекса внутриклеточных путей, а это, в свою очередь, ведет к росту, дифференцировке и миграции клеток разных типов; в ряде обзоров последних лет дается исчерпывающее описание этих процессов (Birchmeier et al., 2003; Trusolino and Comoglio, 2002; Maulik et al., 2002). Было показано, что сигнальный путь HGF/Met, имеющий фундаментальное значение в эмбриональном развитии и регенерации тканей, вовлекается также в инвазивный опухолевый рост и метастазирование и, в качестве такового, представляет собой интересную терапевтическую мишень (Birchmeier et al., 2003; Trusolino and Comoglio, 2002; Danilkovich-Miagkova and Zbar, 2002; Ma et al., 2003).

HGF принадлежит к семейству плазминоген-родственного фактора роста и включает α-цепь размером 69 кДа, содержащую N-концевой фингер-домен (N) и четыре крингл-домена (Kringle; K1-K4), и β-цепь размером 34 кДа, которая обладает большим сходством с доменами протеазы химотрипсин-подобных сериновых протеаз из семейства Clan PA(S)/FamilyS1 (Nakamura et al., 1989; Donate et al., 1994; Rawlings et al., 2002). Подобно плазминогену и другим зимогенам сериновых протеаз HGF секретируется в виде одноцепочечного предшественника (scHGF). Далее scHGF связывается с гепаран-сульфатными протеогликанами, такими как синдекан-1 (Derksen et al., 2002), на клеточных поверхностях или во внеклеточном матриксе. Гепаран-сульфатные протеогликаны связываются с N-доменом (Hartmann et al., 1998), который вносит определенный вклад в высокую аффинность связывания Met с аминокислотами, расположенными в K1 (Lokker et al., 1994). Хотя scHGF способен связываться с Met с высокой афинностью, он не может активировать рецептор (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992). Приобретение HGF сигнальной активности происходит при протеолитическом расщеплении (активации) scHGF в положении Arg494-Val495, что приводит к образованию зрелого HGF, гетеромера α/β, связанного дисульфидной связью (Lokker et al., 1992; Hartmann et al., 1992; Naldini et al., 1992). Протеазоподобный домен HGF (β-цепь HGF) не обладает каталитической активностью, поскольку он не содержит требуемую каталитическую триаду Asp[c102]-His[c57]-Ser[c195] (в тексте всего описания используется стандартная нумерация химотрипсиногена с включением скобок), обнаруженную во всех сериновых протеазах (Perona and Craik, 1995; Hedstrom, 2002), включая Gln534[c57] и Tyr673[c195].

В связи с важностью сигнальной активности HGF данный процесс должен жестко контролироваться HGF-превращающими ферментами и их соответствующими физиологическими ингибиторами. Активация scHGF опосредована in vitro химотрипсин-подобными сериновыми протеазами, включающими активатор фактора роста гепатоцитов (HGFA) (Miyazawa et al., 1993), матриптазу/MT-SP1 (Takеuchi et al., 1999; Lin et al., 1999), активатор плазминогена урокиназного типа (Naldini et al., 1992), фактор XIIa (Shimomura et al., 1995), фактор XIa (Peek et al., 2002) и калликреин плазмы (Peek et al., 2002). Как и scHGF, указанные протеазы продуцируются в виде неактивных предшественников; их ферментативная активность также жестко регулируется другими активирующими протеазами и ингибиторами обоих типов, как Куниц-типа (Kunitz), так и серпинового типа.

Сериновые протеазы и процесс их активации описаны в литературе (Donate et al., 1994). При активации сериновых протеаз происходит расщепление зимогена, с последующей конформационной перегруппировкой так называемого «активирующего домена», что приводит к образованию соответствующим образом сформированного активного сайта и области взаимодействия субстрат/ингибитор. Активирующий домен включает три поверхностных петли, обозначенные как [c140]-, [c180]- и [c220]-петли, и содержит инсерцию из вновь сформированного N-конца в гидрофобном кармане (Huber and Bode, 1978). В гомологичной паре лиганд/рецептор для белка, стимулирующего макрофаги (MSP)/Ron), β-цепь MSP, подобного сериновой протеазе, обеспечивает основную энергию для связывания с рецептором (Wang et al., 1997; Miller and Leonard, 1998). Указанный процесс представляет собой реверсию системы HGF/Met, где сайт связывания высокоаффинного рецептора с остатками Met находится в α-цепи HGF (Lokker et al., 1994; Okigaki et al., 1992).

Важность сигнальной оси HGF/Met в процессах клеточного функционирования в условиях нормы и в этиологии клинических нарушений указывает на ее возможную значимость при разработке высокоэффективных терапевтических средств, основанных на модуляции данной оси. Однако сложность указанного пути, частично из-за недостаточно изученного механизма взаимодействия HGF-HGF и HGF/Met, замедляет прогресс в этом направлении и подводит к необходимости разработки подходов, основанных на лучшем понимании механизма взаимодействия HGF-HGF и HGF/Met. Приведенное ниже описание отвечает данной потребности и обеспечивает другие преимущества.

Все цитируемые источники, в том числе патентные заявки и публикации, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Описание изобретения

Фактор роста гепатоцитов (HGF), плазминоген-родственный фактор роста, связывается с рецептором тирозинкиназы Met (также называемым как С-Met, с-Met или с-met), которая вовлекается в процессы развития, регенерации тканей и инвазивного опухолевого роста. Сама β-цепь HGF типа сериновой протеазы связывается с Met. Кроме того, что происходит связывание с Met, не ясно, какие области и какие конкретные остатки в β-цепи HGF необходимы для осуществления соответствующей сигнальной функции по пути HGF/Met. Авторы полагают, что определенные области/положения в β-цепи вносят важный вклад в соответствующую функциональную активность HGF, тогда как указанный вклад может вовлекать, а может и не вовлекать, связывание β-цепи HGF со своим соответствующим рецептором. Приведенные в настоящем описании результаты подтверждают тот факт, что мутации N-концевого участка и/или участка димеризации β-цепи HGF могут нарушать биологическую функцию HGF/Met, при наличии или в отсутствие существенного нарушения связывания HGF (в частности, β-цепи HGF) с С-Met. В основном, но не обязательно, указанные мутации не вовлекают те положения, которые, как считается, содержат «активирующий домен» или «область активного сайта» HGF дикого типа.

Мутационный анализ, приведенный в настоящем описании, обеспечивает основу для разработки множества мутантов HGF, способных ингибировать взаимодействие HGF/HGF и HGF/с-met дикого типа по широкому спектру функций. Примеры таких мутантов приведены в настоящем описании. Указанные мутанты способны конкурировать с HGF дикого типа за связывание с c-met, демонстрируя при этом сниженную способность воздействовать на c-met-ассоциированные биологические функции. Это особенно важно в том случае, когда нежелательно полное или существенное ингибирование оси HGF/c-met; указанная возможность весьма существенна, поскольку HGF и c-met широко экспрессируются в нормальных клетках и тканях. Такого рода мутанты также могут использоваться как полезные терапевтические агенты для лечения патологических состояний, где желательно снижение, но не полное отсутствие биологической активности HGF/c-met. Способы и композиции согласно настоящему изобретению основаны, по меньшей мере частично, на тех фактах, которые были открыты авторами и которые ниже описаны более подробно.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле-антагонисту HGF/С-Met, включающей мутант HGF, который содержит мутацию в N-концевом участке β-цепи HGF и/или в участке димеризации β-цепи HGF.

Мутация в N-концевом участке β-цепи HGF может представлять собой любую мутацию, которая нарушает вставку N-конца β-цепи в HGF-связывающий карман. В одном варианте полученный мутант по β-цепи HGF связывается с С-Met со сниженной связывающей аффинностью по сравнению с β-цепью HGF дикого типа. В одном варианте полученный мутант по β-цепи HGF связывается с С-Met с по существу эквивалентной аффинностью, как и в случае β-цепи HGF дикого типа. В одном варианте полученный полноразмерный HGF, содержащий мутированную β-цепь HGF, связывается с С-Met со сниженной связывающей аффинностью в сравнении с полноразмерным HGF дикого типа. В одном варианте полученный полноразмерный HGF, содержащий мутированную β-цепь HGF, связывается с С-Met с по существу эквивалентной аффинностью, как и полноразмерный HGF дикого типа. В одном варианте мутация находится в P1' положении (т.е. в положении 495[c16]) или в прилегающем положении, где указанная мутация приводит к получению расщепляемого HGF мутанта, и где N-конец β-цепи HGF не встраивается в активный сайт/карман связывания. Примеры неспособности встраиваться в активный сайт/карман связывания включают, без ограничения, конфигурации, в случае которых мутант является дефектным либо по одному, либо по обоим (i) гидрофобным взаимодействиям и (ii) по образованию солевого мостика, соединяющего N-конец с Asp672[c]194, то есть, где N-конец содержит мутацию, например включает положительно заряженный замещенный или встроенный аминокислотный остаток. В одном варианте сигнальная функция через данный мутант нарушается. В одном варианте мутация находится в одном или нескольких положениях P1', P2', Р3' и P4' или рядом с ними.

Мутация в домене димеризации β-цепи HGF может быть любой мутацией, которая, как ожидается, будет нарушать контактирование между двумя β-цепями HGF, так что димеризация двух цепей (и, таким образом, двух HGF молекул) нарушается. Возможность таких мутаций определяется аминокислотной структурой HGF комплексов, например, как описано в работе Kirchhofer et al., J. Biol. Сhem. (2004), 279(38):39915-24. Релевантные аминокислотные положения включают, без ограничения, приведенные в настоящем описании положения. В одном варианте полученный мутант HGF обладает сниженной способностью димеризоваться с другой β-цепью HGF. В одном варианте мутация в области димеризации β-цепи HGF существенно не нарушает связывания полученного HGF мутанта с С-Met.

Домен димеризации относится к участку β-цепи HGF, который взаимодействует с другой β-цепью HGF с образованием димера (например, в комплексе активации HGF/Met). При расщеплении proHGF β-цепь HGF подвергается конформационному изменению. N-концевой остаток 495 в β-цепи HGF образует солевой мостик с остатком Asp 672. В некоторых вариантах участок димеризации β-цепи HGF включает аминокислотные остатки, по существу состоит из аминокислотных остатков или состоит по меньшей мере из одного аминокислотного остатка (вплоть до всех аминокислотных остатков), соответствующих остаткам β-цепи HGF на участке от примерно 495 до примерно 502 аминокислоты [петля c140], включая Y619, T620, G621, [c180] петли, включающей участок 662-665, или их смеси. В одном варианте домен димеризации включает положения, локализованные вплотную/вблизи одного или нескольких положений, приведенных выше, и будет, таким образом, как предполагается, влиять на указанные одно или несколько положений. Например, в одном варианте домен димеризации может также включать положения 622 и 626.

В одном аспекте молекула антагониста HGF/Met согласно настоящему изобретению включает мутацию в N-концевом участке β-цепи HGF, где указанная мутация находится в положении V495, G498, R502 плюс T503 и/или D672. Мутация может быть представлена в любой форме, которая меняет первичную, вторичную и/или третичную структуру N-концевого участка β-цепи HGF. Например, в одном варианте мутация N-концевого участка β-цепи HGF представляет собой замещение, вставку и/или делецию, такие как V495G, V495A, G498I, G498P, G498V, R502del плюс T503del или D672N. В другом варианте мутация в N-концевом участке β-цепи HGF представляет собой делецию V495. Мутация, которая изменяет первичную, вторичную и/или третичную структуру N-концевого участка β-цепи HGF, может находиться также в положении любой аминокислоты, которая сама не находится в N-концевом участке β-цепи HGF. Например, мутация D672, которая устраняет образование солевого мостика (например, D672N) с N-концом β-цепи HGF, как ожидается, изменит первичную, вторичную и/или третичную структуру N-концевого участка β-цепи HGF. Таким образом, мутации в N-концевом участке β-цепи HGF и в участке димеризации β-цепи HGF необязательно должны быть взаимоисключающими. Например, как будет описано в настоящем тексте и как показано на фиг.1, мутации некоторых положений, как ожидается, будут влиять и на N-концевой домен, и на домен димеризации в β-цепи HGF.

В одном аспекте молекула-антагонист HGF/Met согласно настоящему изобретению включает мутацию в домене димеризации β-цепи HGF, где указанная мутация находится в положении N497, G498, P500 или рядом с T501 и R502 или R502. Мутация может иметь любую форму, которая изменяет первичную, вторичную и/или третичную структуру участка димеризации β-цепи HGF. Примеры мутаций, которые меняют структуру участка димеризации β-цепи HGF, включают мутации, вводящие заряженный остаток или остаток с крупной боковой цепью (например, объемную), в последовательность дикого типа, где заряженный остаток может приводить к взаимодействиям по типу отталкивания, а крупная боковая цепь может сказываться на возникновении неблагоприятных стерических взаимодействий. Кроме того, цистеиновые мутации (например, L622C, I664C, P500C и N497C) также могут быть введены таким образом, чтобы они стали доступными для модификации специфическими тиол-алкилирующими реагентами, такими как агенты, содержащие малеимидные и галогенацетильные группы. В одном варианте мутация в участке димеризации β-цепи HGF представляет собой замещение, инсерцию и/или делецию, такую как N497R или K; G498A или S; P500W, H или E; инсерцию между T501 и R502 (например, инсерцию R и/или S); или R502del. В одном варианте мутация в положении N497 не может быть N497F, A или E. В одном варианте мутация находится в одном или нескольких положениях на участке 495-503, где такая мутация может менять димеризацию β-цепи HGF и/или связывание с рецептором. В другом варианте мутации, которые затрагивают домен димеризации, могут быть объединены с мутацией в одном или нескольких положениях за пределами домена димеризации, например, это может быть мутация в сайте расщепления 494-495 или вблизи него. Например, в случае мутанта, который, как ожидается, будет нерасщепляемым (например, двойной мутант R494E:V495G) и который также содержит мутацию в домене димеризации, такой мутант будет тем не менее демонстрировать нарушенную биологическую функцию, даже если он подвергнется расщеплению in vivo.

В некоторых вариантах молекула-антагонист HGF/Met согласно настоящему изобретению будет включать аминокислоты дикого типа в положении 534, 578, 619, 673, 692, 693, 694, 695, 696, 699 и/или 702. В некоторых вариантах молекула-антагонист HGF/Met согласно настоящему изобретению включает мутации в положении L622 (например, L622C или K); I623 (например, I623C); D626 (например, D626K); L622 плюс D626 (например, L622K плюс D626K); K663 (например, K663C); I664 (например, I664C); R502 (например, 502C); P500 (например, P500C); N497 (например, N497C); R494 плюс I623 (например, R494E плюс I623C); N497 плюс G498 (например, N497R плюс G498A или N497K плюс G498A); N497 плюс P500 (например, N497R плюс P500H или N497K плюс P500H); G498 плюс P500 (например, G498A плюс P500H); N497 плюс G498 плюс P500 (например, N497R плюс G498A плюс P500Н или N497K плюс G498A плюс P500H); N497 плюс L622 (например, N497R плюс L622K или N497K плюс L622K); N497 плюс D626 (например, N497R плюс D626K или N497K плюс D626K); N497 плюс L622 плюс D626 (например, N497R плюс L622K плюс D626K или N497K плюс L622K плюс D626K).

В одном варианте молекула-антагонист HGF/Met согласно настоящему изобретению включает мутацию в активном сайте HGF, одну или в сочетании с одной или несколькими мутациями, приведенными в настоящем описании. Мутации в активном сайте включают мутации в положении 667 и/или 704. Подходящие мутации включают замещение одного или обоих из этих положений на С или W.

В основном, молекула-антагонист HGF/Met согласно настоящему изобретению включает молекулу HGF, содержащую мутацию в β-цепи HGF, которая снижает одну или несколько биологических характеристик, в норме ассоциированных с HGF дикого типа. Например, в одном варианте молекула обладает сниженной С-Met сигнальной способностью (например, фосфорилированием Met) по сравнению с HGF дикого типа. В другом варианте молекула обладает сниженной способность стимулировать миграцию клеток по сравнению с HGF дикого типа. В другом варианте молекула обладает сниженной способностью стимулировать пролиферацию клеток по сравнению с HGF дикого типа. В другом варианте молекула обладает сниженной способностью стимулировать ангиогенез по сравнению с HGF дикого типа. Молекула-антагонист HGF/Met согласно настоящему изобретению в основном включает по меньшей мере часть цепи HGF, которая вовлечена в связывание с Met, присоединенную к мутированной β-цепи HGF, согласно настоящему описанию.

Как показано по результатам мутационного анализа, описанного в настоящем описании, некоторые участки β-цепи HGF, и в них конкретные положения аминокислот, играют важные роли в модуляции биологических функций HGF. Соответственно в одном аспекте настоящее изобретение относится к модуляторам HGF/Met, которые специфически направлены на указанные участки. Такие модуляторы включают нуклеиновые кислоты, такие как аптамеры, и полипептиды, такие как связывающие пептиды и антитела.

В контексте настоящего описания буква, стоящая перед числовым показателем, означает соответствующую аминокислоту дикого типа, имеющуюся в положении аминокислоты, обозначаемой данным номером, в полипептиде HGF человека дикого типа, и одна или несколько букв (если они присутствуют) после числового показателя указывают тип мутации/аминокислоту (например, замещение аминокислоты, делецию (del) или инсерцию (ins)).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к мутанту HGF, который обладает модулирующей активностью в отношении HGF/c-met, например к антагонисту активности HGF/c-met или к варианту HGF, демонстрирующему снижение, но не отсутствие биологической активности HGF (например, активность, стимулирующая клеточный рост). В одном варианте антагонист согласно настоящему изобретению способен ингибировать биологическую активность HGF дикого типа in vivo или in vitro (такая биологическая активность включает, без ограничения, фосфорилирование рецептора, стимуляцию клеточной пролиферации, повышение выживаемости клеток, ускорение ангиогенеза, индукцию/усиление клеточной миграции). В одном варианте мутант HGF обеспечивает сниженную активность, способствующую клеточному росту (например, клеточную пролиферацию, выживаемость клеток, ангиогенез, клеточную миграцию).

В одном варианте молекула-антагонист согласно настоящему изобретению конкурирует с HGF дикого типа за связывание с Met. В некоторых вариантах указанная молекула ингибирует мультимеризацию рецептора c-met (например, димеризацию). В некоторых вариантах указанная молекула включает вариант (мутант) β-цепи, обладающий сниженной способностью к взаимодействию (например, к мультимеризации/димеризации) с β-цепью другой молекулы. В некоторых вариантах указанная молекула ингибирует мультимеризацию β-цепи HGF (например, димеризацию). В некоторых вариантах указанная молекула связывается с c-met, но демонстрирует сниженную способность воздействовать на активацию c-met (например, как выявлено по сниженному уровню фосфорилирования c-met, фосфорилирования митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) и/или по снижению зависимой от HGF/c-met миграции клеток, клеточной пролиферации, по выживаемости клеток, морфогенезу клеток, ангиогенезу и т.п.).

В любой молекуле согласно настоящему изобретению, где одно или несколько положений было мутировано относительно соответствующей последовательности дикого типа, такая мутация может быть представлена в любой форме, которая изменяет функциональный эффект соответствующего остатка дикого типа. Мутация может быть получена посредством любого способа, известного в данной области (и/или может определена эмпирически), например, путем замещения, инсерции, добавления и/или делеции. В некоторых вариантах указанная мутация включает неконсервативное замещение. Подходящие замещения включают, без ограничения, замещения, приведенные в настоящем описании (в частности, в указанных ниже примерах), например, аминокислотами, такими как аланин или серин.

В одном аспекте молекулу/вещество (например, модуляторы HGF/c-met, приведенные в настоящем описании) связывают с токсином, таким как цитотоксический агент. Указанные молекулы/вещества могут быть получены в составе композиции или могут быть введены в сочетании с дополнительным/усиливающим агентом, таким как облучение и/или химиотерапевтический агент.

Настоящее изобретение также относится к способам и композициям, применяемым для модуляции патологический состояний, ассоциированных с нарушением регуляции сигнальной оси HGF/c-met. Таким образом, настоящее изобретение в одном аспекте относится к способу модуляции активации c-met у субъекта, включающему введение субъекту молекулы-антагониста HGF/c-met согласно настоящему изобретению, посредством чего достигается модуляция активации c-met. В одном варианте указанная молекула представляет собой антагонист HGF/c-met, который ингибирует активность HGF/c-met. В одном варианте указанный антагонист ингибирует специфическое связывание β-цепи HGF дикого типа с c-met. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния, ассоциированного с активацией c-met у субъекта, включающему введение субъекту антагониста c-met согласно настоящему изобретению, в результате чего ингибируется активация c-met.

Сигнальный путь HGF/c-met вовлечен во множественные биологические и физиологические функции, включающие, например, стимуляцию клеточного роста (например, пролиферацию клеток, выживаемость клеток, миграцию клеток, клеточный морфогенез) и ангиогенез. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования клеточного роста, активируемого с-met (например, пролиферации и/или выживаемости), где указанный способ включает контактирование клетки или ткани с антагонистом согласно настоящему изобретению, в результате которого достигается ингибирование клеточной пролиферации, ассоциированной с активацией c-met. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования ангиогенеза, включающему введение в клетку, ткань и/или в организм субъекта с патологическим состоянием, ассоциированным с аномальным ангиогенезом, антагониста HGF/c-met согласно настоящему изобретению, в результате чего достигается ингибирование ангиогенеза.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к использованию антагониста согласно настоящему изобретению при изготовлении лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное нарушение (такое как аутоиммунное нарушение) и/или нарушение, связанное с ангиогенезом. Указанный антагонист может иметь любую приведенную в настоящем описании форму, включая форму антитела, фрагмента антитела, полипептида (например, олигопептида, мутанта/варианта полипептида HGF), нуклеиновой кислоты (аптамера) или их сочетания.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное нарушение (такое как аутоиммунное нарушение) и/или нарушение, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению вектора экспрессии согласно настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное нарушение (такое как аутоиммунное нарушение) и/или нарушение, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению клетки-хозяина согласно настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное нарушение (такое как аутоиммунное нарушение) и/или нарушение, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению изделия согласно настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное нарушение (такое как аутоиммунное нарушение) и/или нарушение, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению набора согласно настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное нарушение (такое как аутоиммунное нарушение) и/или нарушение, связанное с ангиогенезом.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования клеточной пролиферации, активируемой c-met, включающему контактирование клетки или ткани с эффективным количеством антагониста согласно настоящему изобретению, посредством чего достигается ингибирование клеточной пролиферации, ассоциированной с активацией c-met.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения патологического состояния, ассоциированного с нарушенной регуляцией c-met-активации у субъекта, где указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества антагониста согласно настоящему изобретению, в результате чего достигается лечение указанного состояния.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, которая экспрессирует c-met или фактор роста гепатоцитов, или оба из них, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с антагонистом c-met согласно настоящему изобретению, что приводит к ингибированию роста указанной клетки. В одном варианте указанную клетку приводят в контакт с HGF, экспрессируемым другой клеткой (например, посредством паракринного эффекта).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения млекопитающего, имеющего раковую опухоль, которая включает клетку, экспрессирующую c-met или фактор роста гепатоцитов, или оба из них, где указанный способ включает введение указанному млекопитающему эффективного количества антагониста согласно настоящему изобретению, что приводит к эффективному лечению указанного млекопитающего. В одном варианте указанную клетку приводят в контакт с HGF, экспрессируемым другой клеткой (например, посредством паракринного эффекта).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики клеточно-пролиферативного нарушения, ассоциированного с повышенной экспрессией или активностью c-met или фактора роста гепатоцитов, или их обоих, где указанный способ включает введение субъекту, при наличии необходимости в таком лечении, эффективного количества антагониста согласно настоящему изобретению, что приводит к эффективному лечению или предупреждению указанного клеточно-пролиферативного нарушения. В одном варианте указанное пролиферативное нарушение представляет собой рак.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клетки, где рост указанной клетки, по меньшей мере частично, зависит от рост-потенцирующего эффекта c-met или фактора роста гепатоцитов, или их обоих, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с эффективным количеством антагониста согласно настоящему изобретению, в результате чего достигается ингибирование роста указанной клетки. В одном варианте клетку приводят в контакт с HGF, экспрессируемым другой клеткой (например, посредством паракринного эффекта).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу терапевтического воздействия на опухоль млекопитающего, где рост указанной опухоли, по меньшей мере частично, зависит от рост-потенцирующего эффекта c-met или фактора роста гепатоцитов, или их обоих, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с эффективным количеством антагониста согласно настоящему изобретению, в результате чего достигается эффективное лечение данной опухоли. В одном варианте клетку приводят в контакт с HGF, экспрессируемым другой клеткой (например, посредством паракринного эффекта).

Способы согласно настоящему изобретению могут использоваться для воздействия на любое подходящее патологическое состояние, например, клетки и/или ткани, ассоциированные с нарушенной регуляцией HGF/c-met сигнального пути. В одном варианте клетка, которая является мишенью в способе согласно настоящему изобретению, представляет собой раковую клетку. Например, раковая клетка может представлять собой клетку, выбранную из группы, состоящей из: раковой клетки молочной железы, клетки колоректального рака, клетки рака легкого, клетки папиллярной карциномы (например, клетки щитовидной железы), клетки рака ободочной кишки, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака яичника, цервикальной раковой клетки, клетки рака центральной нервной системы, клетки остеогенной саркомы, клетки карциномы почки, клетки гепатоцеллюлярной карциномы, клетки рака мочевого пузыря, клетки рака желудка, клетки плоскоклеточной карциномы головы и шеи, клетки меланомы, клетки множественной меланомы и лейкозной клетки. В одном варианте клетка, которая является мишенью в способе согласно настоящему изобретению, представляет собой геперпролиферирующую и/или гиперплазирующую клетку. В одном варианте клетка, которая является мишенью в способе согласно настоящему изобретению, представляет собой дипластическую клетку. В еще одном варианте клетка, которая представляет собой мишень в способе согласно настоящему изобретению, является метастазирующей клеткой.

Способы согласно настоящему изобретению могут также включать дополнительные стадии лечения. Например, в одном варианте способ также включает стадию, при которой клетку-мишень и/или ткань-мишень (например, раковую клетку) подвергают облучению или воздействию химиотерапевтического агента. В одном варианте молекулу-антагонист HGF/Met по настоящему изобретению вводят субъекту с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, например с эрлотинибом (TARCEVA®), пеметрекседом (ALIMTA®), бевацизумабом (AVASTIN®), гефитинибом (IRESSA®), трастузумабом (HERCEPTIN®) и ритуксимабом (RITUXAN®). Введение терапевтических агентов при проведении комбинированной терапии может осуществляться в одновременном или в последовательном режиме.

Как приведено в настоящем описании, c-met-активация представляет собой важный биологический процесс, нарушение регуляции которого ведет к развитию множества патологических состояний. Соответственно в одном варианте осуществления способов согласно настоящему изобретению клетка, которая является мишенью (например, раковая клетка), представляет собой такую клетку, в которой активация c-met повышена по сравнению с нормальной клеткой ткани того же происхождения. В одном варианте способ согласно настоящему изобретению вызывает гибель клетки-мишени. Например, контактирование с антагонистом согласно настоящему изобретению может привести к неспособности клетки проводить сигнал по пути c-met, что приводит к гибели клетки.

Нарушение регуляции c-met-активации (и соответственно сигнальной функции) может происходить из-за множества клеточных изменений, включающих, например, сверхэкспрессию HGF (когнатных c-met-лигандов) и/или самого c-met. Соответственно в некоторых вариантах способ согласно настоящему изобретению включает воздействие на клетку, в тех условиях, когда c-met, или фактор роста гепатоцитов, или они оба экспрессируются в усиленных количествах данной клеткой (например, раковой клеткой) по сравнению с нормальной клеткой в ткани того же происхождения. Клетка, экспрессирующая c-met, может подвергаться регуляции под действием HGF, происходящего из множества источников, например, аутокринным или паракринным способом. Например, в одном варианте осуществления способов согласно настоящему изобретению клетку-мишень приводят в контакт/связывают с фактором роста гепатоцитов, экспрессируемым в другой клетке (например, посредством паракринного эффекта). Такая другая клетка может происходить из той же самой ткани или из ткани другого происхождения. В одном варианте клетку-мишень приводят в контакт/связывают с HGF, экспрессирумым самой клеткой-мишенью (например, посредством аутокринного эффекта/петли).

В некоторых вариантах антагонисты HGF/Met согласно настоящему изобретению включают мутанты HGF, которые содержат модификации, усиливающие их ингибирующий и/или терапевтический эффект (включая, например, повышенную аффинность, улучшенные фармакокинетические свойства (такие как период полувыведения, стабильность, скорость клиренса) сниженную токсичность для субъекта). Подходящие модификации такого рода включают, например, процессы гликозилирования, пэгилирования, замещения неприродной, но функционально эквивалентной аминокислотой, связующими группами и т.п. Такие модификации известны в данной области и могут быть также определены эмпирически, при необходимости.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям, включающим один или несколько антагонистов HGF/c-met согласно настоящему изобретению и носитель. В одном варианте носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антагонист HGF/c-met согласно настоящему изобретению. В одном варианте нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению кодирует антагонист HGF/c-met, который является полипептидом или включает полипептид (например, мутант/вариант HGF). В одном варианте нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению кодирует антагонист HGF/c-met, который является антителом или его фрагментом или включает антитело или его фрагмент.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к векторам, включающим нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, включающим нуклеиновую кислоту или вектор согласно настоящему изобретению. Вектор может быть любого типа, например, он может быть рекомбинантным вектором, таким как вектор экспрессии. Может использоваться любой представитель из множества известных клеток-хозяев. В одном варианте клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, например клетку E. coli. В одном варианте клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомяка (CHO).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам получения антагониста HGF/c-met согласно настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение относится к способу получения антагониста, который представляет собой антитело (или его фрагмент) или включает антитело (или его фрагмент), где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора согласно настоящему изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела. В другом примере настоящее изобретение относится к способу получения антагониста HGF/c-met, который представляет собой полипептид или включает полипептид (такой как мутант/вариант HGF), где указанный способ включает экспрессию в соответствующей клетке-хозяине рекомбинантного вектора согласно настоящему изобретению, кодирующего указанный полипептид, и выделение указанного полипептида.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к изделию, включающему контейнер, а также композицию, содержащуюся в данном контейнере, где указанная композиция включает один или несколько антаг