Выделенный полипептид ib альфа гликопротеина тромбоцитов человека, слитый белок, молекула днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), клетка (варианты), способ экспрессии полипептида, способ экспрессии слитого белка, фармацевтическая композиция (варианты), способ ингибирования прикрепления клетки крови к биологической ткани в биологической системе, способ ингибирования прикрепления белка к биологической ткани в биологической системе и способ лечения нарушения

Выделенный полипептид ib альфа гликопротеина тромбоцитов человека, слитый белок, молекула днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), клетка (варианты), способ экспрессии полипептида, способ экспрессии слитого белка, фармацевтическая композиция (варианты), способ ингибирования прикрепления клетки крови к биологической ткани в биологической системе, способ ингибирования прикрепления белка к биологической ткани в биологической системе и способ лечения нарушения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Считается, что пагубные эффекты связанных с сосудами нарушений, таких как инсульт, сердечный приступ и артериосклероз, обусловлены, по меньшей мере частично, неуместным запуском воспаления и реакции репарации сосудов. Воспаление и реакция репарации сосудов включают в себя адгезивные взаимодействия между различными типами клеток, обычно обнаруживаемых свободно циркулирующими в крови. Примеры таких взаимодействий включают в себя взаимодействия, которые могут происходить между тромбоцитами, лейкоцитами и внутренней стенкой сосудов крови (т.е. васкулярным эндотелием). В условиях высоких сил трения в жидкости тромбоциты прикрепляются к эндотелию посредством взаимодействия между комплексом гликопротеинов (GP) Ib-IX-V на их поверхности и фактором фон Виллебранда (vWF), присутствующим на экспонированном субэндотелии сосудов. Кроме того, тромбоциты, прикрепляющиеся к эндотелию сосудов, могут связывать и захватывать свободно циркулирующие тромбоциты посредством опосредованного vWF связывания, что дает возможность для роста тромба за счет последовательных слоев тромбоцитов. GPIbα-цепь комплекса GPIb-IX-V может также облегчать связывание α-тромбина с поверхностью тромбоцитов, повышая уровень опосредованного тромбином расщепления GPV и активируемых протеазой рецепторов (PAR).

В противоположность этому, лейкоциты могут прикрепляться к активированному эндотелию либо непосредственно, либо опосредованно, прикрепляясь сначала к vWF-иммобилизованным тромбоцитам. В обоих случаях эти связанные с адгезией события опосредованы молекулами клеточной поверхности лейкоцитов, которые связываются с классами либо селектинов, либо интегринов адгезивных рецепторов. Считают, что адгезия лейкоцит-тромбоцит частично происходит посредством взаимодействия молекулы интегрина поверхности лейкоцита MacI и компонента GPIb комплекса GPIb-IX-V поверхности тромбоцита.

В ответ на васкулярные повреждения, такие как атеросклеротические бляшки, или механическое повреждение, например, такое как повреждение, вызываемое ангиопластикой, установлением стента, процедурами искусственного кровообращения, ишемическим повреждением или стенозом, лейкоциты и тромбоциты могут накапливаться в месте повреждения сосуда и обеспечивать множественные адгезивные субстраты друг для друга. Это накопление лейкоцитов и тромбоцитов приводит к локальному продуцированию факторов, например митогенов, цитокинов и хемокинов, вызывая дополнительное нежелательное прогрессирование сосудистого заболевания.

Были описаны терапевтические полипептиды, в том числе vWF-связывающий район, полученный из GPIbα. Один подобный полипептид основан на последовательности, содержащей две аминокислотные замены (G233V M239V) в человеческой аминокислотной последовательности GPIbα дикого типа. Ig-слитый белок, содержащий 290 аминокислот внеклеточного vWF-связывающего домена этого варианта (названный GPIb2V-Ig), ингибирует тромбоз коронарной артерии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение обеспечивает улучшенные полипептиды вариантов гликопротеина-Ibα, которые применимы в качестве терапевтических агентов для лечения сосудистых нарушений. При различных вариантах осуществления эти варианты обнаруживают уменьшенную агрегацию, повышенную стабильность, уменьшенное связывание с тромбином или два или более из этих свойств. Одним применением этих полипептидов вариантов белка гликопротеина-Ibα является применение в качестве слитого белка для лечения сосудистых состояний, связанных с воспалением сосудов, тромбозом, атеросклерозом и связанным с ангиопластикой рестенозом.

В одном из аспектов этот полипептид связывается с альфа-тромбином с более низкой аффинностью по сравнению со связыванием с альфа-тромбином полипептида, который включает в себя природно встречающуюся аминокислотную последовательность GPIbα человека (SEQ ID NO:1), или полипептида, названного GPIb2V (SEQ ID NO:2), который включает в себя аминокислотные замены (G233V и M239V) относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. При связывании этого полипептида с тромбином с более низкой аффинностью большее количество тромбина становится доступным для образования тромба, и нежелательное кровотечение у субъекта минимизируется. Примерами полипептидов, которые обнаруживают уменьшенное связывание тромбина по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, являются полипептиды, которые включают в себя одну, две или три аминокислотные замены Y276F, Y278F, Y279V или их консервативный вариант.

В некоторых вариантах осуществления агрегация этого полипептида снижается относительно агрегации полипептида, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления уменьшенная агрегация наблюдается во время синтеза этого полипептида в клетке. Примером полипептида, который обнаруживает уменьшенную агрегацию, является полипептид, который включает в себя аминокислотную замену C65S или ее консервативный вариант, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления этот полипептид является более устойчивым к протеолизу, чем полипептид, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Примером такого полипептида является полипептид, который включает в себя аминокислотную замену K237V, или ее консервативный вариант, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

Примерами подходящих полипептидов являются полипептиды, которые имеют следующие замены аминокислотной последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2: Y276F, Y276F K237V, Y276F C65S, Y276F Y278F Y279F, Y276F Y278F Y279F K237V и Y276F Y278F Y279F K237V C65S.

Полипептиды согласно изобретению могут быть обеспечены в виде слитых белков. Например, слитый белок гликопротеина Ibα может включать в себя первый полипептид, содержащий по меньшей мере район варианта полипептида гликопротеина Ibα, связанный со вторым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид образует мультимер, например димер. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид включает в себя по меньшей мере район полипептида иммуноглобулина.

Данное изобретение обеспечивает также нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид варианта гликопротеина Ibα, а также векторы, клетки и способы экспрессии полипептида варианта гликопротеина Ibα с использованием кодирующих полипептид варианта гликопротеина Ibα нуклеиновых кислот. Данное изобретение дополнительно включает в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид слитого белка варианта гликопротеина Ibα, а также вектор, содержащий кодирующие полипептид слитого белка гликопротеина Ibα нуклеиновые кислоты, описанные здесь, и клетку, содержащую векторы или нуклеиновые кислоты, описанные здесь.

Данное изобретение обеспечивает также способ ингибирования адгезии лейкоцитов в биологической ткани путем контактирования лейкоцита со слитым полипептидом гликопротеина Ibα. Этот лейкоцит контактируют в количестве, достаточном для ингибирования сцепления лейкоцита и биологической ткани.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения нарушения, ассоциированного с активацией тромбоцитов. Способ включает в себя введение субъекту эффективного количества слитого полипептида гликопротеина Ibα.

В данное изобретение включены также фармацевтические композиции, которые включают в себя полипептиды вариантов гликопротеина Ibα или слитые полипептиды вариантов гликопротеина Ibα.

Если нет других укзаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, которое обычно понимается специалистом с обычной квалификацией в области, к которой относится данное изобретение. Хотя в применении на практике или испытании согласно изобретению могут быть использованы способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном объеме. В случае противоречия следует руководствоваться данным описанием, в том числе определениями согласно изобретению. Кроме того, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения изобретения.

Другие признаки и преимущества согласно изобретению будут очевидны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Фиг.1 является графиком, показывающим ингибирование химер GPIbα на ристоцетин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Показан коэффициент пропускания света (y-ось) для GPIbα дикого типа («Обычный») и химер GPIb-Ig WT, GPIbα-290/2V-Ig, GPIbα-290/2V/FFF-Ig.

Фиг.2 является графиком, показывающим антитромботическую эффективность химер GPIbα в собачьей модели коронарного тромбоза Фолтса (y-ось: кровь LCX).

Фиг.3 является графиком, показывающим ингибирование функции тромбоцитов GPIbα-290/2V-Ig и GPIbα-290/2V/FFF-Ig в кроличьей модели коронарного тромбоза, оцениваемое посредством PFA-100.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Произведенные из гликопротеина Ibα полипептиды с уменьшенным связыванием с альфа-тромбином, уменьшенной агрегацией и/или увеличенной устойчивостью к протеолизу в соответствии с данным изобретением применимы в качестве терапевтических агентов, например, в лечении различных состояний, которые получают пользу в результате ингибирования связывания активированных клеток тромбоцитов с vWF на клетках сосудов. В некоторых вариантах осуществления эти полипептиды обеспечены в виде слитых белков.

Белковые варианты согласно изобретению с уменьшенным связыванием тромбина выгодным образом приводят к уменьшенному кровотечению. Связывание тромбина с рецептором GPIbα тромбоцитов является необходимым для свертывания. Связывание тромбина с терапевтически растворимым GPIb может усиливать кровотечение in vivo изолированием тромбина от рецептора GPIbα тромбоцитов, уменьшая тем самым индуцируемую тромбином агрегацию тромбоцитов. Таким образом, белковые варианты, которые обнаруживают более низкую аффинность в отношении тромбина, делают тромбин доступным для взаимодействия с рецептором Ibα тромбоцитов, что, в свою очередь, стимулирует свертывание.

Подходящий полипептид включает в себя аминокислотную последовательность с 1-15 аминокислотными заменами, делециями или инсерциями относительно аминокислот в районе 65-279 аминокислот, включительно, природно встречающейся последовательности белка GPIbα человека, показанной в SEQ ID NO:1, ниже, или варианта GPIb2V, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:2, ниже. В одном или нескольких вариантах осуществления этот полипептид имеет одну или несколько из следующих активностей: (i) более низкой аффинности связывания с альфа-тромбином относительно связывания с альфа-тромбином полипептида, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 человека; (ii) более низкой агрегации относительно агрегации полипептида, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2; или (iii) увеличенной устойчивости к протеолизу относительно полипептида, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

Хотя и не желая быть связанными теорией, авторы считают, что эти свойства основаны на результатах замен в районах-мишенях в полипептидной последовательности варианта GPIb2V (SEQ ID NO:2). Изменение остатка цистеина на остаток серина в положении 65 (т.е. C65S) приводит к ингибированию агрегации молекулы GPIbα, в частности во время процесса рекомбинантного получения. Остатки тирозина, обнаруживаемые в положениях 276, 278 и 279 в последовательности дикого типа, обычно модифицируются посттрансляционно в сульфотирозин, что создает анионное электростатическое взаимодействие с альфа-тромбином. Селективная элиминация этих остатков тирозина превращением их в фенилаланин (т.е. замены Y276F, Y278F и Y279F) уменьшает связывание с альфа-тромбином (Marchese et al., J. Biol. Chem. 270:9571-78) с сохранением желаемого связывания с vWF. Замена лизина на валин в положении 237 будет предотвращать протеолиз в этом сайте во время процесса рекомбинантного получения.

Фрагмент с последовательностью из 290 аминокислот природно встречающейся цепи гликопротеина Ibα человека представлен ниже:

Аминокислотная последовательность варианта GPIb2V приведена ниже в виде SEQ ID NO:2. Этот вариант обсуждается также в публикации заявки на патент США № 20030091576 и ее копии WO 02/063003.

В некоторых вариантах осуществления этот полипептид имеет не более чем 12 замен, инсерций или делеций относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Например, он может иметь 10, 8, 7, 6, 5 или менее замен, инсерций или делеций относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления эти замены, инсерции или делеции находятся в районе аминокислот 65-279 включительно.

В некоторых вариантах осуществления этот полипептид связывается с более низкой аффинностью с альфа-тромбином относительно связывания с альфа-тромбином полипептида, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Примерами полипептидов, которые обнаруживают уменьшенное связывание, являются полипептиды, которые включают в себя одну, две или три из аминокислотных замен Y276F, Y278F, Y279V, или их консервативный вариант, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления агрегация этого полипептида снижается относительно агрегации полипептида, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления уменьшенная агрегация наблюдается во время синтеза этого полипептида в клетке. Примером полипептида, который обнаруживает уменьшенную агрегацию, является полипептид, который включает в себя аминокислотную замену C65S, или ее консервативный вариант, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления этот полипептид является более устойчивым к протеолизу, чем полипептид, который включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Примером такого полипептида является полипептид, который включает в себя аминокислотную замену K237V, или ее консервативный вариант, относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления этот полипептид включает в себя аминокислотную последовательность с 1-10 аминокислотными заменами, инсерциями или делециями относительно аминокислот 1-290 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, при условии, что по меньшей мере одной из этих аминокислотных замен является C65S, K237V, Y276F, Y278F, Y279F, K237V.

Примерами подходящих полипептидов являются полипептиды, которые имеют следующие замены аминокислотной последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2: Y276F, Y276F K237V, Y276F C65S, Y276F Y278F Y279F, Y276F Y278F Y279F K237V и Y276F Y278F Y279F K237V C65S.

Данное изобретение включает в себя также полипептиды с одной или несколькими, например 2, 3, 5, 6, 8, 10, 15 или более, аминокислотными заменами в полипептидах, произведенных из последовательностей гликопротеина Ibα, наряду с полипептидами, соответствующими SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Они включают в себя, например, GPIb302 (SEQ ID NO:3), GPIb302/2А (SEQ ID NO:4), GPIb/4Х (SEQ ID NO:5) и GPIb290/1А (SEQ ID NO:6).

Вариант белка гликопротеина может быть обеспечен в виде части слитого белка. Например, слитые белки белок гликопротеина Ibα-иммуноглобулин применимы для ингибирования прикрепления тромбоцитов и лейкоцитов к биологическим тканям, таким как, например, эндотелий сосудов. Слитые белки согласно изобретению или нуклеиновые кислоты, кодирующие эти слитые белки, могут быть включены в фармацевтические композиции и введены субъекту для ингибирования взаимодействия между лигандом гликопротеина Ibα (таким как фактор фон Виллебранда, Мас-1, Р-селектин или тромбин) и белком гликопротеина Ibα на поверхности клетки, такой как тромбоцит. Ингибирование связывания подавляет опосредованную белком гликопротеина Ibα агрегацию тромбоцитов и ассоциированную трансдукцию сигнала in vivo.

Слитые белки белок гликопротеина Ibα-иммуноглобулин могут быть использованы для модуляции биодоступности родственного лиганда белка гликопротеина Ibα. Ингибирование взаимодействия лиганд белка гликопротеина Ibα/белок гликопротеина Ibα применимо терапевтически, inter alia, для лечения сосудистого воспаления и других сосудистых нарушений, ассоциированных с активацией тромбоцитов.

Слитые полипептиды вариантов гликопротеина Ibα

В различных аспектах данное изобретение обеспечивает слитые белки, которые включают в себя первый полипептид, содержащий по меньшей мере часть варианта полипептида гликопротеина Ibα, функционально связанную со вторым полипептидом. В данном контексте “слитый белок” или “химерный белок” гликопротеина Ibα включает в себя по меньшей мере часть варианта полипептида гликопротеина Ibα, функционально связанную с полипептидом, не являющимся гликопротеином Ibα. Термины “полипептид гликопротеина Ibα” или “вариант полипептида гликопротеина Ibα” относятся к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую по меньшей мере части полипептида гликопротеина Ibα, тогда как термин “полипептид, не являющийся гликопротеином Ibα”, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является по существу гомологичным белку гликопротеина Ibα, например, соответствующую белку, который отличается от полипептида или гликопротеина Ibα и который получен из того же самого или отличающегося организма. В слитом белке гликопротеина Ibα полипептид гликопротеина Ibα может соответствовать всему белку или части белка Ibα.

В одном варианте осуществления слитый белок гликопротеина Ibα содержит по меньшей мере одну биологически активную часть белка гликопротеина Ibα. В другом варианте осуществления слитый белок гликопротеина Ibα содержит по меньшей мере две биологически активные части белка гликопротеина Ibα. Еще в одном варианте осуществления слитый белок гликопротеина Ibα содержит по меньшей мере три биологически активные части белка гликопротеина Ibα. В слитом белке термин “функционально связанный” предназначен для указания, что первый и второй полипептиды связаны таким образом, который делает возможной по меньшей мере одну функцию, ассоциированную с полипептидом гликопротеина Ibα. При использовании для ссылки на нуклеиновые кислоты, кодирующие слитый полипептид гликопротеина Ibα, термин "функционально связанные" означает, что нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид гликопротеина Ibα, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, не являющийся гликопротеина Ibα, слиты в одной рамке считывания друг с другом. Полипептид, не являющийся гликопротеином Ibα, может быть слит с N-концом или с С-концом полипептида гликопротеина Ibα.

В следующем варианте осуществления слитый белок гликопротеина Ibα может быть связан с одним или несколькими дополнительными частями молекулы. Например, слитый белок гликопротеина Ibα может быть дополнительно связан со слитым белком GST, в котором последовательности слитого белка гликопротеина Ibα слиты с С-концом последовательностей GST (т.е. глутатион-S-трансферазы). Такие слитые белки могут облегчать очистку слитого белка гликопротеина Ibα.

В другом варианте осуществления этот слитый белок включает в себя гетерологичную сигнальную последовательность (т.е. полипептидную последовательность, которая не присутствует в полипептиде, кодируемом нуклеиновой кислотой гликопротеина Ibα) на его N-конце. Например, сигнальная последовательность нативного гликопротеина Ibα может быть удалена и заменена сигнальной последовательностью из другого белка. В некоторых клетках-хозяевах (например, клетках-хозяевах млекопитающего) экспрессия и/или секреция гликопротеина Ibα может быть увеличена посредством использования гетерологичной сигнальной последовательности. Репрезентативной сигнальной последовательностью является MPLLLLLLLLPSPLHP (SEQ ID NO:8). Другой репрезентативной сигнальной последовательностью является MPLQLLLLLILLGPGNSLQL WDTWADEAEK ALGPLLARDRR (SEQ ID NO:9). Если желательно, одна или несколько аминокислот могут быть дополнительно встроены между первой полипептидной частью молекулы, содержащей GPIbα-часть, и частью второго полипептида.

Химерный или слитый белок согласно изобретению может быть получен стандартными способами рекомбинантных ДНК. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды GPIbα, а также аминокислотные последовательности этих полипептидов, из которых конструируют варианты полипептида GPIbα, описаны в WO02/063003, содержание которого включено здесь в качестве ссылки в его полном виде.

Например, ДНК-фрагменты, кодирующие полипептидные вариантные последовательности, лигируют вместе в рамке считывания в соответствии с общепринятым способом, например, с использованием тупых концов или ступенчатых концов для лигирования, расщепления рестрикционными ферментами (рестриктазами) для обеспечения подходящих концов, застраивания липких концов, по мере необходимости, обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного присоединения и ферментативного лигирования. В другом варианте осуществления слитый ген может быть синтезирован общепринятыми способами, в том числе автоматизированными ДНК-синтезаторами. Альтернативно, может проводиться ПЦР-амплификация генных фрагментов с использованием якорных праймеров, которые приводят к образованию комплементарных выступов между последовательными генными фрагментами, которые могут быть затем подвергнуты отжигу и повторно амплифицированы для генерирования последовательности химерного гена (см. например, Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Johm Wiley and Sons, 1992). Кроме того, доступными являются многочисленные экспрессионные векторы, которые кодируют часть слияния (например, Fc-район тяжелой цепи иммуноглобулина). Нуклеиновая кислота гликопротеина Ibα может быть клонирована в такой экспрессионный вектор таким образом, что эта часть слияния связывается в рамке считывания с белком иммуноглобулина.

Слитые полипептиды гликопротеина Ibα могут существовать в виде олигомеров, таких как димеры или тримеры. В некоторых вариантах осуществления слитый полипептид гликопротеина Ibα является димером.

В некоторых вариантах осуществления полипептидная часть гликопротеина Ibα обеспечена в виде варианта полипептида гликопротеина Ibα, имеющего мутацию в природно встречающейся последовательности GPIbα (дикого типа), которая приводит к более высокой аффинности (относительно немутированной последовательности) связывания полипептида GPIbα с молекулой клеточной поверхности лейкоцита. Например, этот мутантный полипептид может связываться с более высокой аффинностью с фактором фон Виллебранда (vWF). Эта увеличенная реактивность, или гиперреактивность, может оцениваться с использованием низких концентраций ристоцетина. Альтернативно, любой другой способ для определения реактивности этого полипептида с vWF может быть также использован для идентификации полипептидов, которые являются «более» реактивными с vWF, т.е. более реактивными, чем природно встречающийся GPIbα дикого типа. Примеры вариантов полипептида гликопротеина Ibα, которые связываются с более высокой активностью с vWF, включают в себя варианты GPIbα, которые включают в себя изменения последовательности в шарнирной области полипептида GPIbα. Шарнирная область определяется как район, включающий в себя остатки 220-310, и, как сообщается, является главным сайтом связывания для vWF в полипептиде GPIbα. Мутации в шарнирном районе включают в себя мутации в остатке 233, который в GPIbα дикого типа кодирует глицин. Примером подходящей замены является замена, в которой глицин в положении 233 заменен валином (т.е. G233V). Вторым сайтом для мутации в шарнирном районе является сайт в остатке 239, который в GPIbα дикого типа кодирует метионин. Замена метионина 239 валином является репрезентативной заменой, но могут быть также заменены другие аминокислоты. Кроме того, варианты шарнирной области полипептидов GPIbα, подходящие для использования в слитом полипептиде согласно изобретению, имеют мутации в остатке как положения 233, так и положения 239 (см. например, Dong et al., JBC 275:36 27663-27670 (2000)). Так, данное изобретение включает в себя слитые белки, которые имеют замену в положении 239, например замену M239V варианта полипептида GPIbα. Данное изобретение относится также к слитому белку, имеющему замену в положении 233, например G233V, и слитому белку, который включает в себя вариантный полипептид GPIbα с положениями замен как 233, так и 239, например с заменой G233V и M239V.

В некоторых вариантах осуществления первый полипептид включает в себя полноразмерный полипептид GPIbα. Альтернативно, первый полипептид содержит меньший полипептид, чем полноразмерный полипептид GPIbα. Например, первый полипептид имеет длину, меньшую, чем 600 аминокислот, например меньшую, чем 500, 250, 150, 100, 50 или 25 аминокислот, или равную этим количествам аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления второй полипептид является растворимым. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид увеличивает полупериод существования в организме (например, полупериод существования в сыворотке) связанного полипептида. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид включает в себя последовательность, которая облегчает связывание этого слитого полипептида со вторым полипептидом GPIbα. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид включает в себя по меньшей мере район полипептида иммуноглобулина. Слитые полипептиды иммуноглобулина известны в данной области и описаны, например, в патентах США с номерами 5516964, 5225538, 5428130, 5514582, 5714147 и 5455165.

В некоторых вариантах осуществления второй полипептид содержит полноразмерный полипептид иммуноглобулина. Альтернативно, второй полипептид содержит меньший полипептид, чем полноразмерный полипептид иммуноглобулина, например тяжелую цепь, легкую цепь, Fab, Fab₂, Fv или Fc-фрагменты. Например, в некоторых вариантах осуществления второй полипептид включает в себя тяжелую цепь полипептида иммуноглобулина. В других вариантах осуществления второй полипептид включает в себя Fc-район полипептида иммуноглобулина.

В другом аспекте согласно изобретению второй полипептид имеет меньшую эффекторную функцию, чем эффекторная функцией Fc-района тяжелой цепи иммуноглобулина дикого типа. Эффекторная функция Fc включает в себя, например, связывание Fc-рецептора, фиксацию комплемента и активность элиминации Т-клеток (см. например, патент США № 6136310). Способы анализа активности элиминации Т-клеток, Fc-эффекторной функции и стабильности антител известны в данной области. В одном варианте осуществления второй полипептид имеет низкую аффинность или не имеет аффинности в отношении Fc-рецептора. В другом варианте осуществления второй полипептид имеет низкую аффинность или не имеет аффинности в отношении белка комплемента C1q.

Репрезентативная последовательность второго полипептида включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. Эта последовательность включает в себя Fc-район. Неподчеркнутые аминокислоты являются аминокислотами, которые отличаются от аминокислот, обнаруживаемых в соответствующем положении последовательности иммуноглобулина дикого типа:

Варианты полипептида GPIbα могут включать в себя, кроме указанной замененной аминокислоты, альтернативную аминокислоту, которая выполняет ту же самую функцию, что и указанная аминокислота. В некоторых вариантах эта альтернативная аминокислота является родственной указанной аминокислоте, в качестве консервативной аминокислотной замены указанной аминокислоты. “Консервативная аминокислотная замена” является заменой, в которой конкретный аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления вместо замены тирозина фенилаланином в положении 276, 278 или 279 (Y276F, Y278F или Y279F), остаток тирозина может быть заменен триптофаном или гистидином. Подобным образом для варианта C65S цистеин может быть альтернативно заменен глицином, аспарагином, глутамином, треонином или тирозином. Для замены L237V лизин может быть альтернативно заменен аланином, лейцином, изолейцином, пролином, фенилаланином, метионином или триптофаном.

Данное изобретение включает в себя также полипептид, последовательность которого является на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологичной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, при условии, что он включает в себя одну или несколько из аминокислотных замен C65S, K237V, Y276F, Y278F, Y279F, K237V. Производные или аналоги нуклеиновых кислот или белков согласно изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, молекулы, содержащие районы, которые являются по существу гомологичными нуклеиновым кислотам или белкам согласно изобретению, в различных вариантах, по меньшей мере на приблизительно 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или даже 99% на протяжении последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности идентичного размера при сравнении с сопоставляемой последовательностью, причем это сопоставление выполняют с использованием компьютерной программы гомологии, известной в данной области, или молекулу, кодирующая нуклеиновая кислота которой способна гибридизоваться с комплементом последовательности, кодирующей вышеуказанные белки, при строгих, умеренно строгих условиях или условиях низкой строгости. Примером программы является программа Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI), использующая установки по умолчанию, которая использует алгоритм Смита и Уотермана.

Другой аспект согласно изобретению относится к векторам (в том числе экспрессирующим векторам), содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид гликопротеина Ibα или его производные, фрагменты, аналоги или гомологи. Рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут быть сконструированы для экспрессии слитых полипептидов гликопротеина Ibα в прокариотических или эукариотических клетках.

В другом варианте осуществления экспрессирующим вектором слитого полипептида гликопротеина Ibα является дрожжевой экспрессирующий вектор. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisiae известны в данной области.

Альтернативно, слитый полипептид гликопротеина Ibα может быть экспрессирован в клетках насекомых с использованием способов, известных в данной области, например, с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов.

Еще в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота согласно изобретению экспрессируется в клетках млекопитающего с использованием экспрессирующего вектора млекопитающих.

В другом варианте осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор млекопитающих способен управлять экспрессией нуклеиновой кислоты преимущественно в конкретном типе клеток (например, используются тканеспецифические элементы для экспрессии нуклеиновой кислоты). Тканеспецифические регуляторные элементы известны в данной области.

Далее, данное изобретение обеспечивает рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК согласно изобретению, клонированную в этот экспрессирующий вектор в антисмысловой ориентации. То есть эта молекула ДНК функционально связана с регуляторной последовательностью таким образом, что это делает возможной экспрессию (посредством транскрипции этой молекулы ДНК) молекулы РНК, которая является антисмысловой относительно мРНК слитого полипептида гликопротеина Ibα. Могут быть выбраны регуляторные последовательности, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, клонированной в антисмысловой ориентации, которые управляют непрерывной экспрессией этой антисмысловой молекулы РНК в различных типах клеток, например промоторы и/или энхансеры вирусов, или могут быть выбраны регуляторные последовательности, которые управляют конститутивной, тканеспецифической или клеточноспецифической экспрессией антисмысловой РНК. Этот антисмысловой экспрессирующий вектор может быть в форме рекомбинантной плазмиды, фагмиды или аттенуированного вируса, в которых антисмысловые нуклеиновые кислоты продуцируются под контролем высокоэффективного регуляторного района, активность которого может определяться типом клетки, в которую введен этот вектор.

Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Например, слитые белки гликопротеина Ibα могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как E. coli, клетках насекомых, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих (таких как клетки человека, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или COS-клетки). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам с квалификацией в данной области.

ДНК-вектор может быть введен в прокариотические или эукариотические клетки посредством обычных способов трансформации или трансфекции.

Клетки-хозяева млекопитающего, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или COS-клетки, могут быть трансфицированы экспрессирующими векторами для создания возможности, посредством посттрансляционной модификации, генерирования эпитопа sialyl Lewis^X на N-связанных и О-связанных гликанах слитых полипептидов гликопротеина Ibα. В случае клеток СНО это требует коэкспрессии ферментов α-1,3-/1,4-фукозилтрансферазы (Kukowska-Latallo et al., Genes Dev. 4:1288-303, 1990) и Core2 β-1,6-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (Kumar et al., Blood 88:3872-79, 1996). Присутствие эпитопов sialyl Lewis^X на N-связанных и О-связанных гликанах слитых полипептидов гликопротеина Ibα будет усиливать связывание с селектинами.

В отношении стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от используемых экспрессирующего вектора и способов трансфекции только небольшая фракция клеток может интегрировать чужеродную ДНК в их геном. Для идентификации и отбора этих интегрантов ген, который кодирует селектируемый маркер (например, ген устойчивости к антибиотикам), вводят обычно в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Различные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть введена в клетку-хозяина на том же самом векторе, что и вектор, кодирующий слитые полипептиды гликопротеина Ibα, или может быть введена на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с лекарственным средством (например, клетки, которые включили в себя ген селектируемого маркера, будут выживать в то время, как другие клетки умирают).

Клетка-хозяин согласно изобретению, такая как прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин в культуре, может быть использована для продуцирования (т.е. экспрессии) слитых п