Двугибридная система, основанная на обеспечении умолчания генов путем транскрипционной интерференции

Двугибридная система, основанная на обеспечении умолчания генов путем транскрипционной интерференции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новой двугибридной системе, основанной на обеспечении умолчания генов путем транскрипционной интерференции. Оно также относится к применению этой системы для идентификации биологически активных соединений, оказывающих влияние на взаимодействие белок-белок.

Двугибридная система (Y2H: «Yeast Two hybrid system») была использована экстенсивным образом в случае дрожжей для идентификации взаимодействий белок-белок (см., в частности, Chien C.T. и др., 1991; Fields S. и O. Song, 1989; Cagney G. и др., 2000; Causier B. и B. Davis, 2002; Coates P.J. и P.A. Hall, 2003).

Двугибридная технология основана на том факте, что ДНК-связывающий домен и домен активации транскрипции, содержащиеся в разных химерных белках, могут активировать транскрипцию гена, когда эти два домена являются достаточно близкими друг к другу. Обычно используемый вариант двугибридной системы у дрожжей является полезным в отношении свойств белка GAL4p дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Fields. S и O. Song, 1989).

Белок GAL4p, кроме того, активирует транскрипцию гена GAL1, необходимого для использования галактозы дрожжами, и образован двумя доменами: N-концевой домен, который специфически связывает последовательность ДНК (UAS_G, активируемая, расположенная выше хода транскрипции последовательность генов дрожжей GAL), и С-концевой домен, содержащий кислотную область, позволяющую осуществляться транскрипционной активации.

В этой первой двугибридной системе принимают участие три активных компонента: два гибридных белка и конструкция, в которой ген-репортер находится под контролем промотора гена GAL1 (Pgal1). Первый гибридный белок с ДНК-связывающим доменом (DBD, ДНК-связывающий домен) белка GAL4p экспрессируется дрожжами S.cerevisiae, несущими вышеуказанную конструкцию. Второй гибридный белок с доменом активации транскрипции (AD, активация транскрипции) GAL4p соэкспрессируется в тех же самых дрожжах. В случае взаимодействия двух гибридных белков сближение домена активации транскрипции GAL4-AD и ДНК-связывающего домена позволяет осуществляться реконструкции функционального фактора транскрипции GAL4p, что, в свою очередь, позволяет индуцировать экспрессию гена-репортера, находящегося под контролем Pgal1.

Выбор в качестве гена-репортера гена, существенного для жизнеспособности дрожжей (как, например, ген HIS3), позволяет легко осуществлять скрининг штаммов, которыми экспрессируется ген-репортер и, следовательно, в случае которых происходит взаимодействие между двумя гибридными белками. Штаммы, в случае которых такое взаимодействие не имеет места, не могут активировать Pgal1 и не могут расти, если геном-репортером является ген, необходимый для жизнеспособности дрожжей.

Недавно были получены так называемые обратные двугибридные системы (rY2H: «reverse Yeast Two hybrid system»). В этих системах активация гена-репортера индуцируется в отсутствие взаимодействия белок-белок, что является пригодным, в частности, для идентификации мутантных белков, утративших способность взаимодействовать со своим партнером, а также для идентификации молекул, специфически ингибирующих взаимодействие белок-белок.

Так, Young и др. разработали высокоэффективный тест скрининга, основанный на обратной двугибридной системе, для идентификации модуляторов кальциевых каналов (Young K. и др., 1998). В этой системе rY2H используются свойства гена CYH2. Ген CYH2 кодирует рибосомный белок L29, компонент рибосомной субъединицы 60S, который придает клеткам чувствительность к циклогексимиду (Kaufer N.F. и др., 1983). Репортерную кассету Pgal1-CYH2 вводят в резистентный к циклогексимиду штамм дрожжей, обладающий эндогенным мутированным геном CYH2. При доминировании аллеля CYH2 дикого типа рост клетки-репортера ингибируется на среде, содержащей циклогексимид, когда происходит взаимодействие между двумя белками (и, следовательно, когда репортерная кассета является транскриптом). Прерывание взаимодействия уменьшает токсический эффект циклогексимида и позволяет клетке-репортеру расти на среде, содержащей циклогексимид (Leanna C.A. и M. Hannink, 1996).

Однако проблемы, связанные со стабильностью мРНК и белка, а также различиями на уровне активности белков CYH2p дикого типа и мутированных делают эту систему сложной для использования и довольно малочувствительной для детектирования прекращения взаимодействий белок-белок (обратное Y2H взаимодействие).

Эта система, кроме того, обладает тем недостатком, что ее относительно трудно использовать в целях достижения максимальной чувствительности, так как ее ответ по отношению к обратным Y2H взаимодействиям зависит от нескольких молекул. Так, конкуренция между CYH2p дикого типа и мутантным CYH2p на уровне включения в рибосомы влияет на чувствительность репортера. Кроме того, флуктуации на уровне захвата циклогексимида и его реактивности в отношении рибосом с высокой степенью вероятности влияют на ответную способность системы.

Также описана другая обратная двугибридная система, основанная на использовании гена-репортера URA3 в комбинации с его протоксическим субстратом: 5-фтороротовая кислота (5-FOA) (Huang J. и S.L. Schraiber, 1997; Vidal M. и др., 1996; WO-96/32503). В этой системе индукция экспрессии белка URA3p ингибирует клеточный рост, так как 5-FOA тогда превращается в свой токсический аналог: 5-фтор-UTP. Инактивация URA3, напротив, способствует клеточному росту, так как 5-FOA тогда более не метаболизируется и клетки используют введенный в среду урацил. Эту систему использовали для идентификации мутантных белков, утративших свою способность взаимодействовать с их обычным партнером (Burke T.W. и др., 2001; Daros J.A. и др., 1999; Puthalakath H. и др., 1999).

Конфигурация и механизм этой системы подобны таковым обратной двугибридной системы, описанной выше (Young K. и др., 1998). Следовательно, эта система обладает вышеуказанными недостатками. Кроме того, система, основанная на использовании 5-FOA, обладает тем недостатком, что генерирует позитивные имитации, связанные с самой же системой. В самом деле, клеточный рост связан с инактивацией URA3 дикого типа. Следовательно, соединения, ингибирующие белок URA3p, способствуют клеточному росту. Эти соединения, таким образом, генерируют ложный положительный сигнал во время использования системы для идентификации молекул, специфически ингибирующих взаимодействие белок-белок.

Эта система также обладает тем недостатком, что в ней используется 5-FOA, которая представляет собой относительно дорогостоящий химический реагент.

Наконец, также описана промежуточная система, включающая каскад из двух генов-репортеров и так называемый «расщепленный гибрид» (WO-95/26400 и WO-98/13502). Эта система rY2H была использована для идентификации мутаций в белке CREB, которые прерывают его ассоциацию с СВР (Crispino J.D. и др., 1999). В этих системах двугибридное взаимодействие активирует экспрессию первого белка-репортера, который, в свою очередь, контролирует экспрессию второго гена-репортера, используемого для селекции роста. Эта система, однако, является сложной для использования и довольно малочувствительна для детектирования обратных Y2H взаимодействий.

Вышеописанные системы, следовательно, зависят от активности нескольких молекул (два гена-репортера, ген-репортер и токсическое вещество, ген-репортер дикого типа и мутированный ген-репортер). Это повышает сложность их осуществления, в частности, когда стремятся к максимальной чувствительности. Желательно иметь систему, одновременно более простую, более экономичную, обладающую очень хорошей чувствительностью.

Общее описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новой двугибридной системе, основанной на обеспечении умолчания гена путем транскрипционной интерференции. Двугибридная система согласно настоящему изобретению является простой, не требует добавления в среду токсических веществ и может быть использована без необходимости интеграции в геном.

Первый объект изобретения относится к клетке, включающей интерференционную конструкцию ДНК, причем вышеуказанная конструкция включает:

- ген-репортер, находящийся под контролем первого промотора;

- один или несколько индуцируемый(ых) промотор(ов), так называемый(ых) промотор(ов) интерференции, выбираемый(ых) и фиксированный(ых) таким образом, что его(их) активация вызывает транскрипционную интерференцию первого промотора, приводящую к поддающемуся обнаружению уменьшению экспрессии гена-репортера;

причем вышеуказанная клетка, кроме того, экспрессирует:

- первый химерный белок (Y-AD), образованный доменом активации транскрипции (AD), гибридизированный с белком Y, способным взаимодействовать с белком-партнером Х;

- второй химерный белок (Х-DBD), образованный первым, ДНК-связывающим доменом (DBD), гибридизированным со вторым доменом, образованным белком Х, способным взаимодействовать с белком Y, причем взаимодействие двух химерных белков Х-DBD и Y-AD приводит к конструкции функционального фактора транскрипции, активирующего промотор или промоторы интерференции.

Согласно одному варианту осуществления объектом настоящего изобретения является клетка, такая как описанная выше, промотор которой, регулирующий экспрессию гена-репортера, представляет собой индуцируемый промотор, белок Y которого способен взаимодействовать с двумя белками-партнерами Х и Z, причем клетка, кроме того, экспрессирует третий химерный белок (Z-DBD), образованный ДНК-связывающим доменом (DBD), гибридизированным со вторым доменом, образованным белком Z, способным взаимодействовать с белком Y, причем взаимодействие двух химерных белков Z-DBD и Y-AD приводит к конструкции функционального фактора транскрипции, активирующего экспрессию гена-репортера.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, объектом настоящего изобретения является клетка, такая как указанная выше, индуцируемый, регулирующий экспрессию гена-репортера промотор которой включает последовательность, способную взаимодействовать с ДНК-связывающим доменом (DBD) химерного белка (Z-DBD).

Объектом изобретения также является клетка, такая как указанная выше, промотор которой, регулирующий экспрессию гена-репортера, представляет собой конститутивный промотор.

Изобретение также относится к клетке, такой как описанная выше, отличающейся тем, что она представляет собой клетку-хозяин, трансформированную или трансфицированную с помощью интерференционной конструкции ДНК и конструкций ДНК, кодирующих химерные белки, причем совокупность этих конструкций несут один или несколько неинтегративных векторов.

Другой аспект изобретения относится к клетке, такой как указанная выше, отличающейся тем, что она представляет собой клетку-хозяин, трансформированную или трансфицированную конструкциями ДНК, кодирующими химерные белки, причем эти конструкции несут один или несколько неинтегративных векторов, и тем, что интерференционная конструкция ДНК интегрирована в геном клетки.

Изобретение относится также к клетке, такой как указанная выше, в случае которой интерференционная конструкция ДНК и конструкции ДНК, кодирующие химерные белки, интегрированы в геном клетки.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к клетке, такой как описанная выше, в случае которой интерференционная конструкция ДНК интегрирована в локус, лишенный пертурбированных геномных активностей транскрипции.

Изобретение также относится к клетке, такой как указанная выше, отличающейся тем, что ее выбирают из группы, состоящей из клеток млекопитающих, насекомых, растений и дрожжей.

Объектом изобретения также является клетка, такая как описанная выше, отличающаяся тем, что она представляет собой дрожжевую клетку.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к клетке, такой как указанная выше, отличающейся тем, что она является клеткой дрожжей вида Saccharomyces cerevisiaе, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces carlsbergensis или Candida albicans.

Изобретение относится также к клетке, такой как указанная выше, по меньшей мере с одним промотором интерференции, расположенным ниже по ходу транскрипции гена-репортера и первого промотора и в ориентации, противоположной этому последнему (DI).

Изобретение относится, кроме того, к клетке, такой как описанная выше, по меньшей мере с одним промотором интерференции, расположенным ниже по ходу транскрипции гена-репортера и первого промотора и в той же ориентации, что и таковая этого последнего (nDI).

Изобретение также относится к клетке, такой как указанная выше, по меньшей мере с одним промотором интенференции, расположенным выше хода транскрипции гена-репортера и первого промотора и в той же самой ориентации, что и таковая этого последнего (UI).

Другой аспект изобретения относится к клетке, такой как описанная выше, по меньшей мере с одним промотором интерференции, фиксированным с той и другой стороны первым промотором и геном-репортером, промотором или промоторами интерференции, фиксированным(ми) ниже по ходу транскрипции первого промотора и гена-репортера, обладающим(ми) ориентацией, конвергентной по отношению к первому промотору, и промотором или промоторами интерференции, фиксированным(ми) выше хода транскрипции первого промотора и гена-репортера, обладающим(ми) ориентацией, идентичной таковой первого промотора (UDI).

Изобретение относится, кроме того, к клетке, такой как описанная выше, по меньшей мере с одним промотором интерференции, фиксированным с той и другой стороны первым промотором и геном-репортером, промотором или промоторами интерференции, фиксированным(ми) ниже по ходу транскрипции первого промотора и гена-репортера, обладающим(ми) ориентацией, тандемной по отношению к первому промотору, и промотором или промоторами интерференции, фиксированным(ми) выше хода транскрипции первого промотора и гена-репортера, обладающим(ми) ориентацией, идентичной таковой первого промотора (nUDI).

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к клетке, такой как указанная выше и геном-репортером которой является ген, необходимый для выживания клетки.

Изобретение также относится к клетке, такой как описанная выше и геном-репортером которой является ген, необходимый для первичного метаболизма, клеточного деления, синтеза белков, синтеза ДНК или синтеза РНК.

Объектом изобретения также является клетка, такая как указанная выше, ген-репортер которой сам по себе не является необходимым для выживания клетки, но является необходимым для выживания клетки, когда ее транскрипция ингибирована, за счет ассоциации с одним или несколькими генами-репортерами одного и того же типа, экспрессия которых контролируется или нет системой транскрипционной интерференции.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретение относится к клетке, такой как описанная выше, индуцируемый промотор или индуцируемые промоторы интерференции которой включают последовательность, способную взаимодействовать с ДНК-связывающим доменом (DBD) химерного белка (Х-DBD).

Изобретение относится также к клетке, такой как указанная выше, индуцируемый промотор или индуцируемые промоторы интерференции которой включают последовательность, способную взаимодействовать с белком, имеющим ДНК-связывающий домен (DBD), выбираемый из группы, состоящей из: GAL4 UAS, LexAop, cIop и TetRop, и ДНК-связывающим доменом химерного белка Х-DBD которой является соответствующий DBD (соответственно, GAL4, LexA, cI и TetR).

Другой аспект изобретения относится к клетке, такой как описанная выше, домен активации транскрипции (AD) химерного белка Y-AD которой выбирают из группы, состоящей из доменов активации транскрипции следующих белков: В42, VP16 и GAL4p.

Согласно предпочтительному варианту осуществления объектом изобретения является клетка, такая как указанная выше, интерференционная конструкция ДНК которой фланкирована на своих концах одним или несколькими, одно- или двудирекционными, терминаторами транскрипции.

Другой аспект изобретения относится к способу идентификации соединения, ингибирующего взаимодействие первого белка Х со вторым белком Y, включающему следующие стадии:

а) культивирование клеток, таких как указанные выше;

b) инкубация вышеуказанных клеток в присутствии тестируемого соединения;

с) сравнение экспрессии гена-репортера в присутствии и в отсутствие вышеуказанного соединения, причем увеличение экспрессии гена-репортера является указанием на то, что тестируемое соединение является ингибитором взаимодействия белка Х с белком-партнером Y, экспрессируемых культивированными клетками.

Изобретение относится, кроме того, к применению клеток, таких как указанные выше, для идентификации соединений, ингибирующих взаимодействие белок-белок.

Объектом изобретения является также применение клеток, таких как указанные выше, для скрининга банков кДНК или банков пептидов с целью идентификации пептидов или белковых факторов, специфически ликвидирующих взаимодействие белок-белок.

Другой аспект изобретения относится к набору для получения двугибридной системы, включающему:

- первую конструкцию ДНК, включающую:

- ген-репортер, находящийся под контролем первого промотора;

- один или несколько индуцируемых промоторов, выбираемый(ых) и фиксированный(ых) таким образом, что его(их) активация вызывает транскрипционную интерференцию первого промотора, приводящую к поддающемуся обнаружению уменьшению экспрессии гена-репортера;

- вторую конструкцию ДНК, кодирующую:

- первый химерный белок (Y-AD), образованный доменом активации транскрипции (AD), гибридизированным с первым партнером Y, способным взаимодействовать с белком-партнером Х;

- третью конструкцию ДНК, кодирующую:

- второй химерный белок (Х-DBD), образованный первым ДНК-связывающим доменом (DBD), гибридизированным со вторым доменом, образованным белком Х, способным взаимодействовать с белком Y, причем взаимодействие двух химерных белков X-DBD и Y-AD приводит к конструкции функционального фактора транскрипции, активирующего промотор или промоторы интерференции, когда два химерных белка экспрессируются в клетке-хозяине.

Изобретение относится также к набору, такому как указанный выше, отличающемуся тем, что промотором, регулирующим экспрессию гена-репортера, является индуцируемый промотор; белок Y способен взаимодействовать с двумя белками-партнерами Х и Z; и вышеуказанный набор включает четвертую конструкцию ДНК, кодирующую третий химерный белок (Z-DBD), образованный ДНК-связывающим доменом (DBD), гибридизированным со вторым доменом, образованным белком Z, способным взаимодействовать с белком Y, причем взаимодействие двух химерных белков Z-DBD и Y-AD приводит к конструкции функционального фактора транскрипции, активирующего экспрессию гена-репортера.

Следующий аспект изобретения относится к способу идентификации соединения, ингибирующего взаимодействие первого белка Х со вторым белком Y, но не ингибирующего или менее ингибирующего взаимодействие между белком Y и третьим белком Z, включающему следующие стадии:

а) культивирование клеток, таких как указанные выше;

b) инкубация вышеуказанных клеток в присутствии тестируемого соединения;

с) сравнение экспрессии гена-репортера в присутствии и в отсутствие вышеуказанного соединения, причем увеличение экспрессии гена-репортера является указанием на то, что тестируемое соединение является ингибитором взаимодействия белка Х с белком-партнером Y, но что этот продукт не ингибирует или менее ингибирует взаимодействие между белком Y и белком Z.

Изобретение относится, наконец, к вектору интеграции дрожжей, включающему два фрагмента, гомологичных областям, расположенным выше хода транскрипции и ниже по ходу транскрипции открытой рамки считывания гена URA3 S. cerevisiae, и способствующих интеграции путем гомологичной рекомбинации на уровне локуса URA3 последовательности, встраиваемой между этими двумя фрагментами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новой двугибридной системе, основанной на обеспечении умолчания гена путем транскрипционной интерференции. Двугибридная система согласно настоящему изобретению является простой, не требует добавления в среду токсических веществ и может быть использована без необходимости интеграции в геном.

Транскрипционную интерференцию определяют как пертурбацию активности первого промотора, когда второй промотор активирован. Следовательно, активность транскрипции одного промотора уменьшает транскрипцию, инициированную на уровне другого промотора. Транскрипционная интерференция описана, например, в случае дрожжей (Greger I.H. и N.J. Proudfoot, 1998; Springer C.O. и др., 1997; Peterson J.A. и A.M. Myers, 1993; Puig S. и др., 1999; Martens и др., 2004).

Первый объект изобретения относится к клеткам, несущим одну или несколько конструкций, позволяющих осуществляться экспрессии гена-репортера в отсутствие особого взаимодействия белок-белок, тогда как, когда это взаимодействие имеет место, констатируют поддающееся обнаружению уменьшение экспрессии вышеуказанного гена-репортера.

Более конкретно, клетки согласно настоящему изобретению включают одну или несколько конструкций ДНК, так называемых интерференционных конструкций, причем вышеуказанная конструкция или вышеуказанные конструкции включают:

- ген-репортер, находящийся под контролем первого промотора;

- один или несколько индуцируемый(ых) промотор(ов), так называемый(ых) промотор(ов) интерференции, выбираемый(ых) и фиксированный(ых) таким образом, что его(их) активация вызывает транскрипционную интерференцию первого промотора, приводящую к поддающемуся обнаружению уменьшению экспрессии гена-репортера;

причем вышеуказанная клетка, кроме того, экспрессирует:

- первый химерный белок (Y-AD), образованный доменом активации транскрипции (AD), гибридизированным с белком Y, способным взаимодействовать с белком-партнером Х;

- второй химерный белок (Х-DBD), образованный первым, ДНК-связывающим доменом (DBD), гибридизированным со вторым доменом, образованным белком Х, способным взаимодействовать с белком Y, причем взаимодействие двух химерных белков Х-DBD и Y-AD приводит к конструкции функционального фактора транскрипции, активирующего промотор или промоторы интерференции.

Согласно первому варианту осуществления клетки согласно настоящему изобретению представляют собой клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные с помощью конструкции ДНК, включающей ген-репортер (интерференционная конструкция), и они также трансформированы или трансфицированы двумя конструкциями ДНК, кодирующими каждый из двух химерных белков. Три конструкции может нести один и тот же вектор ДНК или они могут находиться на двух или трех различных векторах. Все комбинации предусматриваемы: три конструкции на одном и том же векторе; три конструкции на трех разных векторах; две конструкции, кодирующие два химерных белка, на одном и том же векторе, тогда как третью конструкцию несет второй вектор; конструкция, кодирующая один из двух химерных белков, и интерференционная конструкция на одном и том же векторе, тогда как конструкцию, кодирующую второй химерный белок, несет второй вектор. Согласно этому первому варианту осуществления векторы представляют собой неинтегративные векторы.

Согласно второму варианту осуществления изобретения интерференционная конструкция интегрирована в геном клеток и эти последние трансформированы или трансфицированы двумя конструкциями ДНК, кодирующими каждый из двух химерных белков. Конструкции ДНК, кодирующие химерные белки, могут находиться на одном и том же векторе ДНК или находиться на двух различных векторах, причем этот вектор или эти векторы являются неинтегративными векторами.

Согласно третьему варианту осуществления изобретения интерференционная конструкция, а также конструкции ДНК, кодирующие каждый из двух химерных белков, интегрированы в геном клеток. Также возможно, что одна из двух конструкций, кодирующих один из двух химерных белков, интегрирована в геном, а вторая конструкция находится на неинтегративном векторе. Наконец, согласно последнему варианту осуществления интерференционная конструкция и одна из двух конструкций, кодирующих один из двух химерных белков, находятся на двух неинтегративных векторах, тогда как конструкция, кодирующая второй химерный белок, интегрирована в геном клеток.

Ген-репортер обычно определяют как ген, кодирующий легко поддающийся обнаружению продукт. Согласно предпочтительному варианту осуществления геном-репортером, используемым в рамках настоящего изобретения, является ген, экспрессия которого необходима для выживания клетки. Она может представлять собой, например, ген, необходимый для первичного метаболизма, клеточного деления, синтеза белков (как рибосомы), синтеза ДНК или синтеза РНК и т.д.

В качестве примера этого типа гена можно назвать все гены, описанные как необходимые для выживания дрожжей, то есть примерно 1/6 часть генов, образующих их геном (Winzeler E.F. и др., 1999).

Также он может представлять собой ген, принимающий активное участие в первичном метаболизме и необходимый для этого последнего, или ген, необходимый для клеточного деления. Более конкретно, он представляет собой ген, кодирующий фермент, участвующий в биосинтезе необходимого метаболита, который может быть добавлен в культуральную среду или удален из нее.

В качестве примера этого типа гена можно назвать гены HISS3, URA3, LEU2, LYS2, TRP1, ADE2, MET15 и ARG4, широко используемые в случае дрожжей S.cerevisiae, так как легко комплементабельны по отношению к соответствующей аминокислоте или соответствующему основанию нуклеиновой кислоты в культуральной среде дрожжей. Могут быть использованы другие маркеры, основанные на метаболизме, в качестве примера можно назвать ген HIS5 (гены дрожжей S.pombe), гены URA3 и LEU2 (гены дрожжей K.lactis), URA3 (ген дрожжей C.albicans), LEU2 (ген дрожжей A.gossypii).

Также могут быть использованы гены, принимающие активное участие в первичном метаболизме и не являющиеся необходимыми для этого последнего, или гены, не являющиеся необходимыми для клеточного деления, когда они используются индивидуально. Напротив, если их транскрипция ингибирована за счет ассоциации с одним или несколькими генами-репортерами одного и того же типа, ассоциация эффектов может приводить к ингибированию необходимой для выживания дрожжей функции. Может быть, например, использована совокупность генов, «ассоциированные» роли которых приводят к функции, необходимой для первичного метаболизма, клеточного деления, синтеза белков (как рибосомы), синтеза ДНК или синтеза РНК и т.д.

В качестве примера этого типа гена можно назвать все гены, описанные как не являющиеся необходимыми для выживания дрожжей (то есть примерно 5/6 числа генов, которые образуют их геном (Winzler E.A. и др., 1999)), которые за счет ассоциации с одним или несколькими генами одного и того же типа становятся тогда необходимыми.

Однако в рамках настоящего изобретения могут быть также использованы другие гены. В качестве примера можно назвать ген, кодирующий фермент САТ (хлорамфениколацетилтрансфераза), ген luc, кодирующий люциферазу, гены, кодирующие флуоресцирующий белок, как GFP («Green Fluorescent Protein»), CFP («Сyan Fluorescent Protein»), YFP («Yellow Fluorescent Protein») или RFP («Red Fluorescent Protein»), бета-галактозидазу, бета-лактамазу, бета-глюкуронидазу.

Также может быть использован маркер, придающий резистентность к токсичному продукту: ген kan транспозона Tn903 (придающий резистентность к генетицину (G418)), ген ble транспозона Tn5 (придающий резистентность к флеомицину), ген CYHr (придающий резистентность к циклогексимиду), pat (ген S.viridochromogenes, придающий резистентность к биалафосу), nat1 (ген S.noursei, придающий резистентность к нурзеотрицину), hph (ген E.coli, придающий резистентность к гигромицину В). Все эти гены являются функциональными, особенно у дрожжей (Gutherie и Fink, 2002).

Ген-репортер находится под контролем первого промотора. Согласно предпочтительному варианту осуществления, этот первый промотор представляет собой конститутивный промотор. Конститутивным промотором, как его обычно называют, является промотор, способствующий экспрессии, относительно независимой от окружающих условий.

В качестве примера в случае дрожжей ген-репортер может быть экспрессирован под контролем мутантного конститутивного промотора ADH1(700) (мутированный промотор гена ADH1 (Padh1)) (Ruohonen и др., 1995). Однако в рамках настоящего изобретения могут быть использованы другие конститутивные промоторы дрожжей. В качестве примера можно назвать промотор TPI (Alber и Kawasaki, 1982), TEF1, TDH3, KEX2 (Nacken и др., 1996) и АСТ1 (Ernst, 1986).

В том, что касается клеток млекопитающих, в качестве примера можно назвать промотор CMV (предранний энхансер/промотор человеческого цитомегаловируса (CMV)) (Foecking и Hofstetter, 1986) (Kronman и др., 1992), промотор EF-1α (Mizushima и Nagata, 1990), промотор SV40 (ранний энхансер/промотор вируса обезьян 40) (Das и др., 1985), промотор UB (промотор человеческого гена убикитина С (hUbC)) (Nenoi и др., 1996; Schorpp и др., 1996), промотор RSV LTR (длинный концевой повтор на концах ДНК-копии генома вируса саркомы Рауса) (Yamamoto и др., 1980).

Промотор или промоторы, так называемый(ые) «промотор(ы) интерференции» представляют собой индуцируемые промоторы. Этот промотор или эти промоторы выбирают и фиксируют таким образом, что их активация вызывает транскрипционную интерференцию первого промотора, приводящую к поддающемуся обнаружению уменьшению экспрессии гена-репортера.

Промоторы интерференции, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, представляют собой индуцируемые промоторы, активация которых индуцируется фактором транскрипции, взаимодействующим через ДНК-связывающий домен (DBD) с последовательностью вышеуказанного промотора (последовательность ДНК, связанная с помощью DBD), причем вышеуказанный фактор транскрипции способен инициировать транскрипцию, управляемую промотором. Так, промоторами интерференции, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, являются все промоторы, пригодные для получения двугибридной системы в случае рассматриваемого организма.

Предпочтительно промоторы интерференции согласно настоящему изобретению включают последовательность, способную взаимодействовать с белком, обладающим ДНК-связывающим доменом (DBD) (последовательность ДНК, связанная с помощью DBD (UAS)). Более конкретно, индуцируемый промотор или индуцируемые промоторы интерференции включает(ют) последовательность, способную взаимодействовать с ДНК-связывающим доменом (DBD) химерного белка (Х-DBD).

Речь может идти, например, о промоторах Pgal1, Pgal10, Pgal5, Pgal80, Pmel1, Pgal2, Pgal7, Pgal3, Pgcyl, Plth1, Ppcl10 и Pfur4 (Ren и др., 2000; Svetlov и Cooher, 1995), индуцируемых фактором транскрипции GAL4p (в клетке дикого типа фактор транскрипции GAL4p принимает участие, в частности, в экспрессии генов, индуцируемых галактозой). Предпочтительно используемым индуцируемым промотором является промотор Pgal1.

Однако согласно другим вариантам осуществления изобретения в рамки настоящего изобретения также входит использование других систем индуцируемой экспрессии. В таблице 1 представлено некоторое количество индуцируемых систем, уже использованных в двугибридных системах. Индуцируемые промоторы этих систем, описанных в литературе, представляют собой также промоторы интерференции в смысле настоящего изобретения. С целью получения функциональной двугибридной системы предусматриваемыми являются все возможные комбинации между DBDs и Ads, представленные в таблице 1.

Таблица 1
Последовательность ДНК, связанная с помощью DBD (UAS, оператор)	ДНК-связывающий домен (DBD)	Домен активации транскрипции (AD)	Библиографическая ссылка
LexAop	LexA	B42	(Gyuris и др., 1993)
LexAop	LexA	VP16	(Vojtek и Hollenberg, 1995)
GAL4 UAS	GAL4	GAL4	(Elledge и Spottswood, 1991; Fields и Song, 1989)
CIop	CI	B42	(Serebriiskii и др., 1999)
TetRop	TetR	B42	(Xu и др.,1997)

Индуцируемый промотор или индуцируемые промоторы интерференции фиксированы таким образом, что их активация вызывает транскрипционную интерференцию первого промотора, приводящую к поддающемуся обнаружению уменьшению экспрессии гена-репортера.

Промотор или промоторы интерференции также могут быть фиксированы ниже по ходу транскрипции первого промотора и гена-репортера, тогда речь идет об интерференции в прямом направлении, так как активация промотора интерференции, расположенного ниже по ходу транскрипции, интерферирует с активностью первого промотора, расположенного выше хода транскрипции.

В рамках интерференции в прямом направлении промотор интерференции, однако, может иметь две возможные ориентации. Первая ориентация соответствует ориентации, конвергентной по отношению к первому промотору; эта конфигурация была названа как интерференция в прямом направлении (или DI, «Downstream Interference»). Промотор интерференции также может иметь ориентацию, тандемную по отношению в первому промотору; эта вторая конфигурация была названа как несмысловая интерференция в прямом направлении (или nDI, «non-sense Downstream Interfere-nce»), которая показывает также ингибирование экспрессии гена-репортера (см. относящуюся к примеру часть).

Промотор или промоторы интерференции также могут быть фиксированы выше хода транскрипции первого промотора и гена-репортера; тогда речь идет об интерференции против хода транскрипции, так как активация промотора интерференции, расположенного выше хода транскрипции, интерферирует с активностью первого промотора, расположенного ниже по ходу транскрипции. Промотор интерференции тогда имеет ориентацию, идентичную таковой первого промотора (оба промотора, следовательно, имеют тандемную конфигурацию); эта конфигурация была названа как интерференция против хода транскрипции (или UI, «Upstream Interference»).

Другой возможной конфигурацией является комбинация двух вышеуказанных конфигураций (система UI и DI). В этом случае по меньшей мере один индуцируемый промотор интерференции фиксирован с той и другой стороны первым промотором и геном-репортером. Речь идет тогда об интерференции в прямом-обратном направлении, так как активация промотора(ов) интерференции, расположенного(ных) выше хода транскрипции, интерферирует с активностью первого промотора, расположенного ниже по ходу транскрипции, и активация промотора или промоторов интерференции, расположенного(ных) ниже по ходу транскрипции, интерферирует с активностью первого промотора, расположенного выше хода транскрипции.

Промотор или промоторы интерференции, расположенный(ые) ниже по ходу транскрипции первого промотора и гена-репортера, имеют ориентацию, конвергентную по отношению к первому промотору (см. система DI выше). Промотор или промоторы интерференции, фиксированный(ые) выше хода транскрипции первого промотора и гена-репортера, обладает(ют) ориентацией, идентичной таковой первого промотора (оба промотора, следовательно, имеют тандемную конфигурацию) (см. система UI выше).

Эта конфигурация была названа интерференцией в прямом-обратном направлении (или UDI, «Upstream-Downstream Interfere-nce».

Другой возможной конфигурацией является комбинация двух вышеуказанных конфигураций (система UI и nDI). В этом случае по меньшей мере один индуцируемый промотор интерференции фиксирован с той и другой стороны первым промотором и геном-репортером. Речь идет тогда об интерференции в прямом-обратном направлении, так как активация промотора или промоторов интерференции, расположенного(ных) выше хода транскрипции, интерферирует с активностью первого промотора, расположенного ниже по ходу транскрипции, и активация промотора или промоторов интерференции, расположенного(ных) ниже по ходу транскрипции, интерферирует с активностью первого промотора, расположенного выше хода транскрипции.

Промотор или промоторы интерференций, расположенные ниже по ходу транскрипции первого промотора и гена-репортера, имеют ориентацию, тандемную по отношению к первому промотору (см. система nDI выше). Промотор или промоторы интерференции, фиксированный(ые) выше хода транскрипции первого промотора и гена-репортера, имеет(имеют) ориентацию, идентичную таковой первого промотора (см. система UI выше), следовательно, три промотора имеют тандемную конфигурацию.

Эта конфигурация была названа как несмысловая в прямом-обратном направлении интерференция (