Способ измерения резистентности или чувствительности к доцетакселу

Способ измерения резистентности или чувствительности к доцетакселу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым, полезным и до сих пор не известным способам, которые могут предсказывать или обеспечивать мониторинг реакции пациента на молекулы таксоидного семейства посредством измерения увеличения или уменьшения специфических генетических маркеров по сравнению с контролем. В настоящем изобретении также приводятся наборы, которые позволяют прогнозировать или осуществлять мониторинг реакции пациента на молекулу таксоидного семейства посредством изменения уровня нуклеиновой кислоты или белка для отдельных генетических маркеров и сопоставления их уровней с контролем или контрольными маркерами.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Доцетаксел относится к антимитотическим препаратам, широко используемым для лечения рака молочной железы, легких и яичников и в меньшей степени используемым для лечения карцином головы и шеи, а также желудка и простаты (Hong, Oncology 16:9, 2002). Доцетаксел ингибирует динамику микроканальцев, связываясь с бета-тубулином и блокируя разделение гетеродимеров альфа- и бета-тубулина, тем самым подавляя рост опухоли (Ringel and Horwitz, J Natl Cancer Inst 83:288, 1991). Противоопухолевая активность доцетаксела и родственного таксана паклитаксела возникает в результате их действия на микроканальцы митотического веретена, с тем чтобы воспрепятствовать выстраиванию и расщеплению хромосом, блокировать цикл клеточного деления и активировать пути апоптоза (Wang et al., Cancer 88:2619, 2000). Проапоптозная активность паклитаксела связывалась с фосфорилированием и инактивацией Bcl-2 через процессы передачи клеточных сигналов, которые включают p53/p21waf1/Cip1, raf/ras и митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK) (Wang et al., Cancer 88:2619, 2000). Хотя доцетаксел является более мощным противораковым препаратом, чем паклитаксел, механизмы его цитотоксичности определены менее точно (Katsumata, Br J Cancer 89:S9, 2003). Вызванный доцетакселом апоптоз наблюдался у выборочных клеточных линий по механизму, включающему фосфорилирование Bcl-2 и активацию каспазы-3 (Kolfschoten et al., Biochem Pharmacol 63:733, 2002). К другим белкам, которые модулируют индуцированное таксанами уничтожение клеток в различных культивируемых линиях, относятся Aurora-A в клетках HeLa (Anand et al., Cancer Cell 3:51, 2003), HER-2 в клетках рака молочной железы (Tanabe et al., Int J Oncol 22:875, 2003), p21waf1/Cip1 в клетках глиобластомы (Li et al., J Biol Chem 277:11352, 2002) и JNK/MKK1 в клетках рака яичников (Lee et al., J Biol Chem 273:28253, 1998).

В этой области сохраняется потребность идентифицировать белки, которые опосредуют резистентность доцетаксела и могут использоваться в качестве лекарственных препаратов, что могло бы привести к их применению для разработки лекарств, с тем чтобы найти реагенты (малые молекулы, миРНК и пр.), которые препятствуют их функции «in vivo» и потенциально сенсибилизируют клетки для противоопухолевой лекарственной химиотерапии. Сохраняется и потребность в данной области в анализе, который мог бы с высокой достоверностью, до химиотерапевтического лечения, прогнозировать, кто из пациентов будет, а кто не будет реагировать на противоопухолевую химиотерапию на основе доцетаксела. В настоящем документе заявители описывают новый анализ, который позволяет предсказывать резистентность или чувствительность к доцетакселу, и приводят методы скринингового анализа для разработки новых подходов к терапии, исключающей лекарственную резистентность при лечении рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением предоставляются полезные и до сих пор не известные способы мониторинга и/или прогнозирования реакции пациента на молекулы таксоидного семейства посредством сравнения уровней активации и/или экспрессии специфических генетических маркеров у пациентов и контрольной группы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится способ прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающий следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;

b) отбор контрольного образца;

c) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров и

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров в образце для тестирования и контрольном образце;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров, измеренного в образце для тестирования, по сравнению с контрольным образцом указывает на повышенную резистентность к молекуле таксоидного семейства.

К конкретным генетическим маркерам, приводимым в данном аспекте настоящего изобретения, относятся:

BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);

Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);

Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа TTK (TTK) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);

GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);

Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);

hSepharase, дополнительные полюсы веретена подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);

CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaM киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);

CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и

GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающему следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;

b) отбор контрольного образца;

c) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров и

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров в образце для тестирования и контрольном образце;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров, измеренного в образце для тестирования, по сравнению с контрольным образцом указывает на повышенную чувствительность к молекуле таксоидного семейства.

В данном аспекте изобретения один или несколько генетических маркеров могут выбираться из группы, включающей:

P21(Waf1), ингибитор циклин-зависимой киназы 1А Homo sapiens (p21, Cip1) (CDKN1A), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000389);

Pim-1, pim-1 онкоген Homo sapiens (PIM1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002648); GBP-1, гуанилат-связывающий белок 1 Homo sapiens, индуцируемый интерфероном, 67 кДа (GBP1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002053);

RXRA, ретиноид Х-рецептор Homo sapiens, альфа (RXRA), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002957);

SPF45, белок 17 с РНК-связывающим мотивом Homo sapiens (RBM17), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_032905);

Hec1, связанный с центромером 2 Homo sapiens (KNTC2), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006101);

Raf1, человеческая иРНК для онкогена raf (номер в каталоге GenBank: X03484);

Aurora A, киназа 1 семейства Аurora Homo sapiens (ARK1), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: AF008551);

TACC3, трансформирующий кислый биспиральный белок 3 Homo sapiens (TACC3), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006342);

RelB, гомолог В вирусного онкогена ретикулоэндотелиоза v-rel Homo sapiens, ядерный фактор ген-энхансера легкой цепи полипептида каппа в В-клетках 3 (птиц) (RELB), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006509);

PRKCD, протеинкиназа С Homo sapiens, дельта (PRKCD), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006254);

BRAF35, высокоподвижная группа Homo sapiens 20B (HMG20B), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006339);

HSPA1L, белок теплового шока 70 кДа 1А Homo sapiens (HSPA1A), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_005345);

STK11, серин-треонинкиназа 11 Homo sapiens (полипоз кишечника II) (STK11), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000455); и

MKK3, MAP киназа киназа 3 Homo sapiens (MKK3), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: L36719).

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающему следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;

b) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);

Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);

Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа TTK (TTK) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);

GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);

Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);

hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);

CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaM киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);

CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и

GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

c) измерение уровня одного или нескольких контрольных генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046); и

RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: BC071941);

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров и упомянутого одного или нескольких контрольных генетических маркеров в образце для тестирования;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров по сравнению с уровнем одного или нескольких контрольных генетических маркеров указывает на повышенную резистентность к молекуле таксоидного семейства.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающему следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента

b) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

P21(Waf1), ингибитор циклин-зависимой киназы 1А Homo sapiens (p21, Cip1) (CDKN1A), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000389);

Pim-1, pim-1 онкоген Homo sapiens (PIM1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002648);

GBP-1, гуанилат-связывающий белок 1 Homo sapiens, индуцируемый интерфероном, 67 кДа (GBP1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002053);

RXRA, ретиноид Х-рецептор Homo sapiens, альфа (RXRA), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002957);

SPF45, белок 17 с РНК-связывающим мотивом Homo sapiens (RBM17), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_032905);

Hec1, связанный с центромером 2 Homo sapiens (KNTC2), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006101);

Raf1, человеческая иРНК для онкогена raf (номер в каталоге GenBank: X03484);

Aurora A, киназа 1 семейства Аurora Homo sapiens (ARK1), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: AF008551);

TACC3, трансформирующий кислый биспиральный белок 3 Homo sapiens (TACC3), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006342);

RelB, гомолог В вирусного онкогена ретикулоэндотелиоза v-rel Homo sapiens, ядерный фактор ген-энхансера легкой цепи полипептида каппа в В-клетках 3 (птиц) (RELB), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006509);

PRKCD, протеинкиназа С Homo sapiens, дельта (PRKCD), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006254);

BRAF35, высокоподвижная группа Homo sapiens 20B (HMG20B), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006339);

HSPA1L, белок теплового шока 70 кДа 1А Homo sapiens (HSPA1A), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_005345);

STK11, серин-треонинкиназа 11 Homo sapiens (полипоз кишечника II) (STK11), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000455) и

MKK3, MAP киназа киназа 3 Homo sapiens (MKK3), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: L36719).

c) измерение уровня одного или нескольких контрольных генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046); и

RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: BC071941);

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров и упомянутого одного или нескольких контрольных генетических маркеров в образце для тестирования;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров по сравнению с уровнем одного или нескольких контрольных генетических маркеров указывает на повышенную чувствительность к молекуле таксоидного семейства.

Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства. Таким образом, еще одно применение настоящего изобретения включает молекулы таксоидного семейства - паклитаксел, доцетаксел XRP9881 и XRP6258.

Генетические маркеры, описанные в настоящем изобретении, могут оцениваться по измерению уровней РНК, ДНК или белка с использованием разнообразных методик, которые подробно описаны ниже. Другие применения настоящего изобретения относятся к наборам для прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства.

Упомянутые выше аспекты и другие аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут более понятны из последующих подробных описаний, рассматриваемых в совокупности с сопроводительными чертежами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена характеристика генов, снижение функциональной активности которых обеспечивает резистентность к доцетакселу. Полученные в присутствии доцетаксела кривые дозовой зависимости приводятся для клеток HCT116, трансфицированных миРНК RB1, BubR1, Mad2 и Mps1 (заштрихованные квадратики), по сравнению с контрольной миРНК (незаштрихованные квадратики). RB1 была примером миРНК, которая не дала результатов при скрининге. Жизнеспособность клеток измерялась по поглощению на 450 нМ после добавления WST-1. Минимальное отношение (MR) представляет собой значение WST-1 для гена по сравнению с контролем при 40 нМ доцетаксела.

На фиг.2 приводятся кривые дозовой зависимости для коротких РНК-шпилек BubR1 и Mps1 (заштрихованные квадратики) по сравнению с контрольной короткой РНК-шпилькой (незаштрихованные квадратики).

На фиг.3 представлены результаты анализа ПЦР TaqMan в режиме реального времени уровней иРНК BubR1 и Mps1 в клетках, содержащих короткие РНК-шпильки BubR1 и Mps1 соответственно.

На фиг.4 приводятся жизнеспособность и морфология клеток, продемонстрированные для клеток HCT116, трансфицированных миРНК Mad2, BubR1 и Mps1 при обработке доцетакселом и в его отсутствие. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки оставались необработанными (-доцетаксел) или обрабатывались 200 нМ доцетаксела (+доцетаксел) и окрашивались Calcein-AM для визуализации живых клеток через 16 и 72 часа после обработки.

На фиг.5 показаны митотические индексы для клеток HCT116, трансфицированных Mad2, BubR1, Mps1 и контрольной миРНК после обработки доцетакселом. Через двадцать четыре часа после трансфекции к клеткам добавляли 200 нМ доцетаксела на 16 и 72 часа, после чего производилась их обработка. Митотические клетки детектировали по фосфорилированным гистон Н3 антителам, которые показаны здесь красным пунктиром вокруг ядра клеток (набор для митотических индексов, Cellomics). Ядра окрашивались в голубой цвет красителем Hoechst.

На фиг.6 представлены результаты анализа ПЦР TaqMan в режиме реального времени уровней иРНК Mps1, BubR1 и Mad2 в клетках HCT116, трансфицированных миРНК Mps1, BubR1 и Mad2 соответственно.

Фиг.7 отражает анализ клеточного цикла для клеток HCT116, трансфицированных тремя миРНК митотических контрольных генов. После трансфекции миРНК Mps1, BubR1 и Mad2 клетки оставляли необработанными (-доцетаксел) или обрабатывали 200 нМ доцетаксела (+доцетаксел) в течение 24 часов. Через семьдесят два часа после добавления доцетаксела клетки инкубировали и анализировали с точки зрения клеточного цикла. Числа над пиками указывают содержание ДНК, например 2N, 4N, 8N, 16N или 32N.

На фиг.8 приводятся результаты анализа выживания клоногенных клеток с помощью стабильных клеточных линий после нокдауна. Клетки HCT116, содержащие BubR1 или векторные контрольные короткие РНК-шпильки, высевались в чашки диаметром 10 см и выдерживались в 5 нМ доцетаксела в течение 10 дней. Колонии отмывали PBS и окрашивали кристаллическим фиолетовым.

На фиг.9 приводится несколько кривых дозовой зависимости для генов, снижение функциональной активности которых обеспечивает повышенную чувствительность к доцетакселу. Полученные в присутствии доцетаксела кривые дозовой зависимости приводятся для клеток HCT116, трансфицированных миРНК RB1, Pim-1, p21, Aurora A и TACC3 (заштрихованные квадратики), по сравнению с контрольной миРНК (незаштрихованные квадратики). Минимальное отношение (MR) представляет собой значение WST-1 для гена по сравнению с контролем при 40 нМ доцетаксела. Отношение IC50 (IR) представляет собой отношение IC50 для гена по сравнению с контролем.

На фиг.10 приводятся кривые дозовой зависимости для коротких РНК-шпилек Aurora A (заштрихованные квадратики) по сравнению с векторным контролем (незаштрихованные квадратики).

На фиг.11 представлены результаты анализа ПЦР TaqMan в режиме реального времени уровней иРНК Aurora A в клетках, содержащих короткие РНК-шпильки Aurora A.

На фиг.12 приводятся различия в пролиферации клеток HCT116, трансфицированных миРНК Pim-1 и TACC3 (заштрихованные квадратики), по сравнению с контрольной миРНК (незаштрихованные квадратики). Число клеток, сохраняющихся в 6-ячеечных планшетах в различные моменты времени после трансфекции Pim-1, TACC3 и контрольной миРНК.

На фиг.13 отражены результаты анализа TaqMan уровней Pim-1 и TACC3 иРНК после трансфекции миРНК.

На фиг.14 приводятся уровни активной каспазы-3 в клетках HCT116, трансфицированных миРНК Pim-1 и BubR1. Уровни активной каспазы-3 отображаются как интенсивность флуоресценции, измеряемая с помощью набора для анализа активной каспазы-3 на колонке с гранулами (Upstate). Анализировались три концентрации доцетаксела, 0, 5 и 40 нМ, и три точки по времени, 24, 48 и 72 часа после добавления доцетаксела.

На фиг.15 приводятся уровни фосфорилирования АКТ в клетках HCT116, трансфицированных миРНК Pim-1 и BubR1. Отношение уровней фосфорилированного и суммарного АКТ определялось с использованием анализа на колонке с гранулами (Biosource). Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки оставляли необработанными или обрабатывали 5 и 40 нМ доцетаксела. Через сорок восемь часов после обработки доцетакселом анализировались лизаты клеток. Уровень фосфорилирования рассчитывался как отношение фосфорилированного AKT (p-AKT) к суммарной АКТ (t-AKT).

На фиг.16 приводится вестерн-блоттинг, демонстрирующий сниженные уровни Pim-1 и BubR1 через 48 часов после трансфекции.

ПОЛНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в общем основано на идентификации заявителями генных маркеров, которые могут предсказывать, является ли проверяемый объект резистентным или чувствительным к лекарствам таксоидного семейства. С использованием клеточного скрининга интерференции РНК (РНКи) заявители установили, что лекарственная резистентность или чувствительность к доцетакселу была связана с конкретными генными маркерами.

Отмечается, что различные термины и ключевые фразы используются в подробном описании и формуле изобретения. Определения этих терминов и ключевых фраз приводятся ниже.

Используемый в настоящем документе термин «прогноз» относится к предсказанию или к вероятности связанной с раком смерти или прогрессии, в том числе лекарственной резистентности, а также рецидивов, распространения метастазов и неопластического заболевания.

Используемый в настоящем документе термин «прогнозирование» относится к вероятности того, что пациент будет благоприятно или неблагоприятно реагировать на лекарство или набор лекарств, а также масштабы таких реакций, например выживет ли пациент после хирургического удаления первичной опухоли и/или химиотерапии в течение определенного периода времени без рецидива онкологии. Способы прогнозирования, представленные в настоящем изобретении, могут быть клинически использованы для принятия решений о лечении посредством выбора наиболее подходящих терапевтических подходов для любого конкретного пациента, в частности химиотерапии таксоидным семейством. Способы прогнозирования настоящего изобретения представляют собой важные инструменты для предсказания вероятности благоприятной реакции пациента на схему лечения, например химиотерапии с использованием конкретного препарата или сочетания препаратов, и/или радиационную терапию, или же насколько вероятна долгосрочная выживаемость пациента после прекращения химиотерапии или лечения другими методами.

Используемый в настоящем документе термин «опухоль» относится ко всем формам роста и пролиферации неопластических клеток как злокачественных, так и доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей.

Используемый в настоящем документе термин «рак» и «раковый» относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака, среди прочего, включают: рак молочной железы; рак толстой кишки; рак легких; рак простаты; гепатоцеллюлярный рак; рак желудка; рак поджелудочной железы; рак матки и яичников; рак печени; рак мочевого пузыря; рак мочевыводящих путей; карцинома; меланома; рак мозга, в том числе глиобластомы и медуллобластомы; рак желчных путей; хориокарцинома; рак пищевода; рак желудка; гематологические неоплазмы, включая острую лимфоцитарную и миелогенную лейкемию; множественную миелому; связанную со СПИДом лейкемию и лейкемию/лимфому зрелых Т-клеток; внутриэпителиальные неоплазмы, включая чечевицеобразный дискоидный дискератоз и болезнь Педжета; лимфомы, в том числе болезнь Ходжкина и лимфоцитарные лимфомы; нейробластомы; рак полости рта, в том числе плоскоклеточная карцинома, саркомы, в том числе лейомиосаркома, рабдомиосаркома, липосаркома, фибросаркома и остеосаркома; рак кожи, в том числе меланома, саркома Капоши, базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак; рак яичек, в том числе герминомы, например семинома, несперматогениомальные опухоли (тератомы, хориокарциномы), стромальные опухоли и гоноцитомы; рак щитовидной железы, в том числе аденокарцинома щитовидной железы и медуллярная карцинома; и рак почек, в том числе аденокарцинома и опухоль Вильмса.

Использованный в настоящем документе термин «пациент», предпочтительно, относится к человеку, но может также включать нечеловекообразных приматов, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Предпочтительным объектом является человек либо с подозрением на рак, либо с поставленным диагнозом рака, либо относящийся к категории высокого риска развития рака, например, имеющий семейную историю заболевания раком. В предпочтительном применении изобретения под раком понимается рак молочной железы. Методы идентификации пациентов, предположительно страдающих раком, могут включать мануальное обследование, биопсию, историю болезней семьи пациента, историю болезней пациента или ряд методов медицинской визуализации, например маммография, магнито-резонансная томография, спектроскопия магнитного резонанса или позитронная эмиссионная томография. Методы диагностики рака и клинические описания диагнозов рака хорошо известны специалистам в области медицинских наук.

Используемый в настоящем документе термин «образец» представляет собой ткань, полученную методами, которые хорошо известны специалистам в смежных медицинских науках. Такие методы, как биопсия, включают общее разделение массы, микродиссекцию, лазерную микродиссекцию или другие известные в данной области методы разделения клеток. По причине вариабельности клеточных типов в пораженном заболеванием биоптате тканей и вариабельности в чувствительности используемых диагностических методов размер образца, необходимого для анализа, может составлять от 1, 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 5000, 10000 до 50000 или более клеток. Подходящий размер образца можно определить на основании клеточной структуры и условий биопсии, а стандартная препаративная процедура для его определения и последующего выделения нуклеиновой кислоты для применения в изобретении хорошо известна специалистам в данной области. Например, биоптата может быть достаточно для оценки экспрессии РНК без амплификации. Напротив, недостаток необходимого количества клеток в малой области биопсии может требовать использования методов конверсии и/или амплификации РНК или других методов, улучшающих разделение молекул нуклеиновых кислот. Такие методы, которые позволяют использовать ограниченный объем биоптатов, хорошо известны специалистам в данной области. Некоторые примеры, среди прочих, включают прямую амплификацию РНК, обратную транскрипцию РНК в кДНК, амплификацию кДНК или генерацию радиоактивно-меченных нуклеиновых кислот.

Используемый в настоящем документе термин «тест» в отношении образца означает образец, взятый из пораженной раком области организма или из области организма, которая демонстрирует определенную стадию или характеристики рака. Используемый в настоящем документе термин «контроль» в отношении образца означает образцы, которые применяются в целях сопоставления. Предпочтительно, такие образцы представляют собой «контроль» с той точки зрения, что образцы не проявляют или считаются не проявляющими никаких признаков какой-либо болезни или заболевания, которые могли бы повлиять на экспрессию генов, особенно в отношении заболевания, в связи с которым их предполагается использовать в качестве стандарта. В альтернативном случае, очевидно, что есть возможность сопоставлять различные стадии заболевания или состояния здоровья, и в таких случаях «контрольный» образец соответствует наиболее ранней стадии заболевания или состояния здоровья. Например, контрольным может быть образец, взятый с не пораженного раком, но сопоставимого участка организма. Кроме того, контрольным образцом может быть сопоставимый участок организма у того же пациента или не пораженный раком участок организма у второго пациента, который по существу подобен первому (те же или близкие виды, возраст, вес, пол и пр.). Наконец, контрольный образец также может быть взят из пораженного раком участка у второго пациента, который эффективно реагирует на лечение с использованием молекулы таксоидного семейства.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к фосфоэфирной полимерной форме рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; «молекулы РНК») или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; «молекулы ДНК») или к их любым фосфоэфирным аналогам, например фосфоротиоатам и тиоэфирам как в одноцепочечной форме, так и в двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные спирали ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» и, в частности, молекула ДНК или РНК относится только к первичной или вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, данный термин распространяется на двухцепочечную ДНК, которая, кроме всего прочего, также присутствует в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, фрагменты рестрикции), плазмидах и хромосомах. При обсуждении структуры конкретных двухцепочечных молекул ДНК для описания последовательностей в настоящем документе используется стандартная договоренность, в соответствии с которой указывается только последовательность в направлении от 5' до 3' по нетранскрибированной цепочке ДНК (то есть цепочке, имеющей последовательность, гомологичную иРНК). «Молекулой рекомбинантной ДНК» называют молекулу ДНК, которая была обработана в соответствии с принципами молекулярной биологии.

Используемый в настоящем документе термин «часть» выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный белок, относится к части или фрагменту выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая включает достаточное число последовательных нуклеотидов, которые кодируют пептид или полипептид. Естественно, «часть» выделенной молекулы нуклеиновой кислоты больше одного нуклеотида, и пептид или полипептид, кодируемый такой частью, содержит множество аминокислотных остатков, как это указано ниже в определении пептида или полипептида. Используемый в настоящем документе термин «пептид» относится к двум или более аминокислотам, ковалентно связанным пептидными связями. В конкретном осуществлении пептид включает по крайней мере 10, предпочтительно, по крайней мере 20, и еще более предпочтительно, по крайней мере 30, и даже еще более предпочтительно, по крайней мере 40, а наиболее предпочтительно, 50 или более аминокислот.

Используемый в настоящем документе термин «полипептид» относится к линейному полимеру, состоящему из множества последовательно связанных аминокислот. В частности, полипептид может иметь молекулярный вес более 100 кДа.

Используемый в настоящем документе термин «генетический маркер» относится к физиологическому составу, для которого измеренный уровень РНК, ДНК или белка в образце служит для прогнозирования резистентности или чувствительности испытуемого к препаратам таксоидного семейства. Более того, генетический маркер может кодировать конкретный белок или, в качестве альтернативы, может служить «суррогатным» маркером для белка, активность которого связана с уровнем генетического маркера во взятом в организме образце. Такая взаимосвязь может быть прямой, при которой снижение уровня активности белка соответствует снижению уровня генетического маркера, или, в альтернативном случае, отношение может быть обратным, при этом снижение уровня активности белка соответствует увеличению уровня генетического маркера. К подобным физиологическим составам, среди прочих, относятся клеточные белки (например, стволовых клеток-предшественников), полипептиды, ДНК, РНК, углеводы или жирные кислоты. В конкретном применении настоящего изобретения измеренные уровни определенных генных маркеров могут предсказывать, является ли испытуемый резистентным или чувствительным к препаратам таксоидного семейства. Примеры таких генетических маркеров, среди прочих, включают:

BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);

Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);

Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа TTK (TTK) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);

GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);

Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, не ингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);

hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);

CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaM киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);

CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и

GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

P21(Waf1), ингибитор циклин-зависимой киназы 1А Homo sapiens (p21, Cip1) (CDKN1A), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000389);

Pim-1, pim-1 онкоген Homo sapiens (PIM1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002648);

GBP-1, гуанилат-связывающий белок 1 Homo sapiens, индуцируемый интерфероном, 67 кДа (GBP1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002053);

RXRA, ретиноид Х-рецептор Homo sapiens, альфа (RXRA), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002957);

SPF45, белок 17 с РНК-связывающим мотивом Homo sapiens (RBM17), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_032905);

Hec1, связанный с центромером 2 Homo sapiens (KNTC2), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006101);

Raf1, человеческая иРНК для онкогена raf (номер в каталоге GenBank: X03484);

Aurora A, киназа 1 семейства Аurora Homo sapiens (ARK1), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: AF008551);

TACC3, трансформирующий кислый биспиральный белок 3 Homo sapiens (TACC3), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006342);

RelB, гомолог В вирусного онкогена ретикулоэндотелиоза v-rel Homo sapiens, ядерный фактор ген-энхансера легкой цепи полипептида каппа в В-клетках 3 (птиц) (RELB), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006509);

PRKCD, протеинкиназа С Homo sapiens, дельта (PRKCD), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006254); BRAF35, высокоподвижная группа Homo sapiens 20B (HMG20B), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006339);

HSPA1L, белок теплового шока 70 кДа 1А Homo sapiens (HSPA1A), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_005345);

STK11, серин-треонинкиназа 11 Homo sapiens (полипоз кишечника II) (STK11), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000455) и

MKK3, MAP киназа киназа 3 Homo sapiens (MKK3), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: L36719).

Используемый в настоящем документе термин «контрольный генетический маркер» относится к физиологическому составу, для которого измеренный уровень РНК, ДНК или белка в образце остается неизменным до, в течение или после воздействия препаратов таксоидного семейства. «Контрольные генетические маркеры» называются облигатными генами. К ним относятся гены, которые выбираются на основе сравнительно неизменных уровней экспрессии в анализируемой системе, например, при конкретном заболевании таком, как рак. Облигатные гены используются для нормализации результатов экспрессии. Примеры таких генетических маркеров, среди прочих, включают:

GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046) и

RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: BC071941).

Используемый в настоящем документе термин «молекула таксоидного семейства» относится к классу химиотерапевтических соединений, принадлежащих к таксоидному семейству. Отдельными представителями таксоидного семейства, среди прочих, являются паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер) и их аналоги (т.е. XRP9881 и XRP6258; см. Ojima and Geney, Curr Opin Investig Drugs 4:737, 2004). Поскольку данный класс молекул связывает бета-тубулин и стабилизирует полимерную форму микроканальцев, подобно доцетакселу, ожидается, что клиническая экспрессия биомаркера, описанная в настоящем документе, будет отражать похожие состояния ответной реакции на данные лекарства.

Использованные в настоящем документе термины «молекула», «соединение» или «агент» обозначают любой состав, который известен в настоящий момент или будет открыт в будущем. К примерам соединений или агентов, применяемых в настоящем изобретении, относятся органические соединения (например, искусственного или природного происхождения и оптически активные), пептиды (искусственного или природного происхождения и оптически активные, то есть D или L аминокислоты), углеводы, молекулы нуклеиновых кислот и пр.

Используемый в настоящем документе термин «жесткость гибридизации» или «гибридизация в жестких условиях» относится к условиям, которые без труда определит специалист в данной области и которые обычно зависят от эмпирических расчетов с учетом длины образца, температуры промывки и концентрации солей. Как правило, более длинные образцы требуют более высоких температур для надлежащей ренатурации, тогда как более коротким образцам необходимы более низкие температуры. Гибридизация обычно зависит от способности денатурированной ДНК к повторной ренатурации при наличии комплементарных цепочек в среде с температурой ниже их температуры плавления. Чем выше степень желаемой гомологии между образцом и гибридизуемой последовательностью, тем выше относительная температура, которая может быть использована. В результате, можно сделать вывод, что более высокие относительные температуры обычно будут определять более жесткие условия реакции, а более низкие - менее жесткие. Дополнительную информацию и пояснения в отношении жесткости реакций гибридизации см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Использованный в настоящем документе термин «жесткие условия» или «условия с высокой жесткостью» относятся к таким условиям, при которых: (1) используется низкая ионная сила и высокая температура отмывки, например, 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) в процессе гибридизации используется денатурирующий