Способ лечения опухоли у субъекта

Способ лечения опухоли у субъекта

Иллюстрации

Показать все

Реферат

СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка представляет собой предварительную заявку, поданную по 37 CFR 1,53(b)(1), по которой испрашивается приоритет согласно 35 USC 119(e) по предварительной заявке номер 60/665482, поданной 25 марта 2005 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится, главным образом, к области молекулярной биологии и регуляции посредством факторов роста. Более конкретно, это изобретение относится к модуляторам каскада передачи сигнала HGF/c-met и к применению указанных модуляторов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

HGF представляет собой плейотропный фактор мезенхимального происхождения с митогенной, мотогенной и морфогенной активностями в отношении ряда клеток различных типов. Посредником для эффектов HGF является определенная тирозинкиназа, c-met, и нарушенную экспрессию HGF и c-met часто наблюдают в различных опухолях. См., например, Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867. Регуляция каскада передачи сигнала HGF/c-Met вовлечена в прогрессирование и метастазирование опухоли. См., например, Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300).

HGF связывает внеклеточный домен тирозинкиназы рецептора Met (RTK) и регулирует различные биологические процессы, такие как распространение, пролиферация и выживание клеток. Передача сигнала HGF-Met является необходимой для нормального развития эмбриона, особенно при миграции мышечных клеток-предшественников и развитии печени и нервной системы (Bladt et al., Nature (1995), 376, 768-771.; Hamanoue et al., Faseb J (2000), 14, 399-406; Maina et al., Cell (1996), 87, 531-542; Schmidt et al., Nature (1995), 373, 699-702; Uehara et al., Nature (1995), 373, 702-705). Связанные с развитием фенотипы мышей с нокаутом Met и HGF являются очень сходными, что позволяет предположить, что HGF является лигандом, узнаваемым рецептором Met (Schmidt et al., 1995, выше; Uehara et al., 1995, выше). Также HGF-Met участвует в регенерации печени, ангиогенезе и заживлении ран (Bussolino et al., J Cell Biol (1992), 119, 629-641; Matsumoto and Nakamura, Exs (1993), 65, 225-249; Nusrat et al., J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065). Предшественник рецептора Met подвергается протеолитическому расщеплению на внеклеточную α-субъединицу и трансмембранную β-субъединицу, связанные дисульфидными связями (Tempest et al., Br J Cancer (1988), 58, 3-7). β-субъединица содержит цитоплазматический киназный домен и обладает мультисубстратным участком для связывания на C-конце, с которым связываются адапторные белки и запускают передачу сигнала (Bardelli et al., Oncogene (1997), 15, 3103-3111; Nguyen et al., J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819; Pelicci et al., Oncogene (1995), 10, 1631-1638; Ponzetto et al., Cell (1994), 77, 261-271; Weidner et al., Nature (1996), 384, 173-176). При связывании HGF, активация Met приводит к фосфорилированию тирозина и последующей передаче сигнала через опосредуемую Gabl и Grb2/Sos активацию PI3-киназы и Ras/MAPK соответственно, которая запускает двигательную активность и пролиферацию клетки (Furge et al., Oncogene (2000), 19, 5582-5589; Hartmann et al., J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939; Ponzetto et al., J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123; Royal and Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787).

Была показана трансформация Met в обработанной карциногеном клеточной линии остеосаркомы (Cooper et al., Nature (1984), 311, 29-33; Park et al., Cell (1986), 45, 895-904). Сверхэкспрессию или амплификацию гена Met наблюдали во множестве злокачественных опухолей. Например, при злокачественных опухолях ободочной и прямой кишки происходит по меньшей мере 5-кратная сверхэкспрессия Met, и описано, что в метастазах в печени происходит амплификация его гена (Di Renzo et al., Clin Cancer Res (1995), 1, 147-154; Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185). Также описана сверхэкспрессия белка Met при плоскоклеточной карциноме полости рта, печеночно-клеточной карциноме, почечно-клеточном раке, карциноме молочной железы и карциноме легкого (Jin et al., Cancer (1997), 79, 749-760; Morello et al., J Cell Physiol (2001), 189, 285-290; Natali et al., Int J Cancer (1996), 69, 212-217; Olivero et al., Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868; Suzuki et al., Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868). Кроме того, сверхэкспрессию мРНК выявили при печеночно-клеточной карциноме, карциноме желудка и карциноме ободочной и прямой кишки (Boix et al., Hepatology (1994), 19, 88-91; Kuniyasu et al., Int J Cancer (1993), 55, 72-75; Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185).

При папиллярной карциноме почки в киназном домене Met выявлен ряд мутаций, которые приводят к постоянной активации рецептора (Olivero et al., Int J Cancer (1999), 82, 640-643; Schmidt et al., Nat Genet (1997), 16, 68-73; Schmidt et al., Oncogene (1999), 18, 2343-2350). Эти активирующие мутации обеспечивают конститутивное фосфорилирование тирозина Met и приводят к активации MAPK, формированию очага и образованию опухоли (Jeffers et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1997), 94, 11445-11450). Кроме того, эти мутации усиливают подвижность и инвазию клеток (Giordano et al., Faseb J (2000), 14, 399-406; Lorenzato et al., Cancer Res (2002), 62, 7025-7030). HGF-зависимая активация Met в трансформированных клетках опосредует повышенную подвижность, распространение и миграцию, что в итоге приводит к инвазивному росту опухоли и метастазированию (Jeffers et al., Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125; Meiners et al., Oncogene (1998), 16, 9-20).

Было показано, что Met взаимодействует с другими белками, которые запускают активацию рецептора, трансформацию и инвазию. Описано, что в клетках новообразования Met взаимодействует с α6β4-интегрином, рецептором для компонентов внеклеточного матрикса (ECM), таких как ламинины, и способствует HGF-зависимому инвазивному росту (Trusolino et al, Cell (2001), 107, 643-654). Кроме того, было показано, что внеклеточный домен Met взаимодействует с членом семейства семафорина, плексином B1, и усиливает инвазивный рост (Giordano et al., Nat Cell Biol (2002), 4, 720-724). Более того, также описано, что CD44v6, который вовлечен в образование опухоли и метастазирование, образует комплекс с Met и HGF и приводит к активации рецептора Met (Orian-Rousseau et al., Genes Dev (2002), 16, 3074-3086).

Met является членом подсемейства рецепторных тирозинкиназ (RTK), которое включает в себя Ron и Sea (Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59). Предсказание структуры внеклеточного домена Met позволяет предположить наличие общей гомологии с семафоринами и плексинами. N-конец Met содержит домен Sema приблизительно из 500 аминокислот, который является консервативным для всех семафоринов и плексинов. Семафорины и плексины принадлежат большому семейству секретируемых и мембраносвязанных белков, впервые описанному с точки зрения их участия в развитии нервов (Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999),1 9, R201-204). Однако позднее была показана корреляция сверхэкспрессии семафорина с инвазией и метастазированием опухоли. Богатый цистеином домен PSI (также обозначаемый как домен связанной с Met последовательности), обнаруженный в плексинах, семафоринах и интегринах, примыкает к домену Sema, за которым следуют четыре повтора IPT, которые представляют собой подобные иммуноглобулину участки, обнаруженные в плексинах и факторах транскрипции. Последние исследования показывают, что домен Sema в Met является достаточным для связывания HGF и гепарина (Gherardi et al., Proc Natl Acad Sci USA (2003), 100(21): 12039-44).

Как указано выше, рецепторную тирозинкиназу Met активирует узнаваемый ею лиганд HGF и фосфорилирование рецептора активирует последующие каскады MAPK, киназы PI-3 и PLC-γ (1, 2). Фосфорилирование Y1234/Y1235 в киназном домене является важным для активации киназы Met, в то время как Y1349 и Y1356 в мультисубстратном участке для связывания являются важными для связывания белков с src-гомологичным доменом 2 (SH2), связывающим фосфотирозин доменом (PTB) и связывающим Met доменом (MBD) (3-5), для обеспечения активации последующих каскадов передачи сигнала. Дополнительный околомембранный участок фосфорилирования Y1003 хорошо охарактеризован вследствие его связывания со связывающим тирозинкиназу (TKB) доменом Cb1 E3-лигазы (6, 7). Описано, что связывание Cb1 запускает опосредуемый эндофилином эндоцитоз рецептора, убиквитинилирование и последующую деградацию рецептора (8). Этот механизм отрицательной регуляции рецептора был описан ранее для семейства EGFR, который также содержит аналогичный участок для связывания Cb1 (9-11).

Нарушение регуляции Met и HGF описано для многих опухолей. Запускаемая лигандом активация Met была выявлена при нескольких злокачественных опухолях. Повышение уровня HGF в сыворотке и внутри опухоли выявлено при раке легкого, раке молочной железы и множественной миеломе (12-15). Сверхэкспрессия Met и/или HGF, амплификация или мутация Met были описаны при различных злокачественных опухолях, таких как рак ободочной и прямой кишки, рак легкого, рак желудка и рак почки, и полагают, что они запускают независимую от лиганда активацию рецептора (2, 16). Кроме того, индуцибельная сверхэкспрессия Met в печени в модели на мышах приводит к развитию почечно-клеточной карциномы, демонстрируя, что сверхэкспрессия рецептора запускает независимое от лиганда образование опухоли (17). Наиболее убедительное доказательство участия Met в злокачественной опухоли описано для пациентов с наследственной и спорадической почечной папиллярной карциномой (RPC). При RPC выявлены мутации в киназном домене Met, в виде зародышевых и соматических мутаций, которые приводят к конститутивной активации рецептора (18). Внесение этих мутаций в моделях на трансгенных мышах приводит к образованию опухоли и метастазированию (19).

Несмотря на то что роль киназного домена Met подробно исследована и было предположено, что повышенные уровни экспрессии HGF/c-met, вероятно, лежат в основе развития некоторых злокачественных опухолей, отсутствуют прямые доказательства биологической роли некиназных доменов c-met. Действительно, несмотря на участие в этиологии многих онкологических состояний каскад HGF/-c-met является сложным каскадом для терапевтического воздействия. В связи с этим работе в значительной степени препятствует отсутствие понимания механизмов действия, посредством которых нарушение регуляции HGF/c-met приводит к образованию опухоли. Таким образом, очевидна высокая необходимость в большем понимании связанных с c-met онкогенных механизмов действия. Это изобретение, представленное в настоящем описании, удовлетворяет эту потребность и обеспечивает другие преимущества.

Все приведенные в настоящем описании ссылки, включая патентные заявки и публикации, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В основе этого изобретения по меньшей мере частично лежит новое открытие, что определенные опухоли человека экспрессируют мутантный белок c-met, который демонстрирует сниженные уровни внутриклеточной отрицательной регуляции, но, тем не менее, способен к передаче сигнала в клетке. Было обнаружено, что эти "гиперстабилизированные" белки c-met обладают повышенной онкогенной активностью по сравнению с c-met дикого типа. Как показано в настоящем описании, эти опухоли можно ингибировать ингибиторами, направленными против c-met. Ингибирование активности гиперстабилизированных c-met обеспечивает ряд терапевтических преимуществ. Например, поскольку эти мутантные формы c-met являются особенно онкогенными, можно ожидать, что направленное на них ингибирование снизит образование опухолей, запускаемых этими мутантами. Более того, поскольку c-met обнаруживается во многих типах клеток, включая нормальные клетки, способность специфично направлять воздействие на опухолеспецифичные мутантные формы c-met может быть особенно предпочтительной, например, в отношении снижения побочных эффектов терапии с ингибированием c-met. Это изобретение относится к способам и композициям, в основе которых лежат описанные в настоящем описании открытия и которые являются пригодными для воздействия на опухоли и/или лечения опухолей, обладающих гиперстабилизированным c-met.

В одном аспекте это изобретение относится к веществу, способному специфично связываться с гиперстабилизированным c-met. В одном варианте осуществления вещество обладает ингибиторной активностью в отношении биологической активности, связанной с гиперстабилизированным c-met. В другом варианте осуществления вещество обладает способностью специфично связывать гиперстабилизированный c-met. В одном варианте осуществления вещество связывается с гиперстабилизированным c-met и ингибирует активность c-met. В одном варианте осуществления вещество связывается с гиперстабилизированным c-met без существенного ингибирования активности c-met. Эти вещества найдут множество применений, например, в качестве молекул для нацеливания лекарственных средств на клетку, экспрессирующую гиперстабилизированный c-met. Лекарственные средства включают в себя любое вещество, описанное в настоящем описании, например токсины. Вещества могут находиться в любой пригодной форме, включая форму конъюгатов антитело-лекарственное средство и слитых полипептидов.

В одном аспекте это изобретение относится к антагонистам c-met, которые нарушают передачу сигнала HGF/c-met, обусловленную гиперстабилизированным белком c-met. В одном варианте осуществления это изобретение относится к антагонисту, который ингибирует активность гиперстабилизированного полипептида c-met человека в отношении передачи сигнала c-met, где гиперстабилизированный полипептид c-met содержит такую делецию по меньшей мере части 14 экзона, при которой скорость деградации в клетке уменьшается по сравнению с c-met дикого типа, и где гиперстабилизированный полипептид c-met обладает активностью в отношении передачи сигнала c-met.

Антагонист по этому изобретению может находиться в любой форме, способной специфично ингибировать активность гиперстабилизированной молекулы c-met, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления антагонист по этому изобретению включает в себя антитело. В одном варианте осуществления антитело по этому изобретению специфично связывается с эпитопом, образованным посредством сплайсинга в рамке считывания экзона 13 и экзона 15 c-met. В одном варианте осуществления по меньшей мере часть экзона 14 удалена в результате указанного сплайсинга в рамке считывания. В другом аспекте антагонист по этому изобретению включает в себя аптамер. В одном варианте осуществления аптамер по этому изобретению специфично связывается с эпитопом, образованным посредством сплайсинга в рамке считывания экзона 13 и экзона 15 c-met. В одном варианте осуществления по меньшей мере часть экзона 14 удалена в результате указанного сплайсинга в рамке считывания. В одном аспекте антагонист по этому изобретению содержит ингибиторную РНК, которая предпочтительно/селективно ингибирует экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант по сплайсингу (сплайсированный вариант) c-met, где экзон 13 сплайсирован с экзоном 15. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует гиперстабилизированный c-met, в котором по меньшей мере часть экзона 14 удалена в результате измененного сплайсинга. В одном аспекте это изобретение относится к антагонисту, содержащему антисмысловой олигонуклеотид, который предпочтительно/селективно ингибирует молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант по сплайсингу c-met, где экзон 13 сплайсирован с экзоном 15. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует гиперстабилизированный c-met, в котором по меньшей мере часть экзона 14 удалена в результате измененного сплайсинга.

Ингибирование активности c-met можно обеспечивать любым из ряда способов, известных в данной области, при условии снижения биологической активности гиперстабилизированного c-met в клетке. Например, в одном варианте осуществления ингибирование активности c-met антагонистом по этому изобретению включает в себя усиление клеточной деградации гиперстабилизированного белка c-met. В другом варианте осуществления ингибирование активности c-met антагонистом по этому изобретению включает в себя ингибирование фосфорилирования гиперстабилизированного белка c-met. В другом варианте осуществления ингибирование активности c-met антагонистом по этому изобретению включает в себя ингибирование фосфорилирования члена каскада передачи сигнала HGF/c-met посредством гиперстабилизированного c-met. Ингибирование активности c-met антагонистом по этому изобретению также можно обеспечивать посредством снижения уровней гиперстабилизированного полипептида c-met в клетке. Таким образом, например, в одном варианте осуществления ингибирование активности c-met антагонистом по этому изобретению включает в себя ингибирование экспрессии гиперстабилизированного белка c-met, например транскрипции и/или трансляции с полинуклеотида, кодирующего гиперстабилизированный полипептид c-met. В другом варианте осуществления ингибирование активности c-met антагонистом по этому изобретению включает в себя гибель клетки, обусловленную цитотоксином, связанным с молекулой (например, конъюгат антитело-лекарственное средство), которая специфично связывается с гиперстабилизированным c-met в клетке.

В одном варианте осуществления антагонист по этому изобретению представляет собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека, полиспецифичное антитело или одноцепочечное антитело. Антагонисты, используемые в способах по этому изобретению, необязательно могут быть конъюгированными с ингибирующим рост веществом или цитотоксическим веществом, таким как токсин, в том числе, например, с майтанзиноидом или калихеамицином, с антибиотиком, с радиоактивным изотопом, ферментом нуклеолизиса или со сходными с ними. В некоторых вариантах осуществления способов по этому изобретению субъекту также вводят химиотерапевтическое средство.

Как правило, эффективные антагонисты c-met включают в себя ингибиторы c-met, которые препятствуют связыванию лиганда, такого как HGF, с гиперстабилизированным c-met. Например, ингибитор c-met может связываться с гиперстабилизированным c-met, так что происходит ингибирование связывания HGF с c-met. В одном варианте осуществления антитело-антагонист представляет собой химерное антитело, например антитело, содержащее антигенсвязывающие последовательности из не относящегося к человеку донора, пересаженные в гетерологичную не являющуюся человеческой, человеческую или гуманизированную последовательность (например, последовательности каркасной области и/или константного домена). В одном варианте осуществления не относящийся к человеку донор представляет собой мышь. В одном варианте осуществления антигенсвязывающая последовательность является синтетической, например полученной посредством мутагенеза (например, скрининга посредством фагового дисплея и т.д.). В одном варианте осуществления химерное антитело по этому изобретению обладает V-участками мыши и C-участком человека. В одном варианте осуществления V-участок легкой цепи мыши является слитым с легкой цепью каппа человека. В одном варианте осуществления V-участок тяжелой цепи мыши является слитым с C-участком IgG1 человека. В одном варианте осуществления антигенсвязывающие последовательности содержат по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три CDR легкой и/или тяжелой цепи. В одном варианте осуществления антигенсвязывающие последовательности содержат CDR3 тяжелой цепи. В одном варианте осуществления антигенсвязывающие последовательности содержат часть из последовательностей или все последовательности CDR и/или вариабельного домена моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6). В одном варианте осуществления антигенсвязывающие последовательности содержат по меньшей мере CDR3 тяжелой цепи моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией 1A3.3.13 или 5D5.11.6. Гуманизированные антитела по этому изобретению включают в себя антитела, которые обладают аминокислотными заменами в FR, и варианты, полученные посредством созревания аффинности, с изменениями в пересаженных CDR. Замещенные аминокислоты в CDR или FR не ограничиваются аминокислотами, представленными в донорном или реципиентном антителе. В других вариантах осуществления антитела по этому изобретению дополнительно включают в себя изменения аминокислотных остатков в Fc-участке, которые приводят к улучшению эффекторной функции, включая усиление функции в отношении CDC и/или ADCC и уничтожения посредством B-клеток. Другие антитела по этому изобретению включают в себя антитела, обладающие определенными изменениями, которые повышают стабильность. Антитела по этому изобретению также включают в себя в дефицитные по фукозе варианты, обладающие усиленной функцией в отношении ADCC in vivo.

В одном варианте осуществления фрагмент антитела по этому изобретению содержит антигенсвязывающую часть, содержащую тяжелую цепь, содержащую меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из SYWLH (SEQ ID NO:1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:2) и YGSYVSPLDY (SEQ ID NO:3). В одном варианте осуществления антигенсвязывающая часть содержит CDR-H1 тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью SYWLH. В одном варианте осуществления антигенсвязывающая часть содержит CDR-H2 тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью MIDPSNSDTRFNPNFKD. В одном варианте осуществления антигенсвязывающая часть содержит CDR-H3 тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью YGSYVSPLDY. В одном варианте осуществления фрагмент антитела по этому изобретению содержит антигенсвязывающую часть, содержащую легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4), WASTRES (SEQ ID NO:5) и QQYYAYPWT (SEQ ID NO:6). В одном варианте осуществления антигенсвязывающая часть содержит CDR-L1 тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью KSSQSLLYTSSQKNYLA. В одном варианте осуществления антигенсвязывающая часть содержит CDR-L2 тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью WASTRES. В одном варианте осуществления антигенсвязывающая часть содержит CDR-L3 тяжелой цепи, обладающий аминокислотной последовательностью QQYYAYPWT. В одном варианте осуществления фрагмент антитела по этому изобретению содержит антигенсвязывающую часть, содержащую тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из SYWLH (SEQ ID NO:1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:2) и YGSYVSPLDY (SEQ ID NO:3), и легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR, выбранные из группы, состоящей из KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4), WASTRES (SEQ ID NO:5) и QQYYAYPWT (SEQ ID NO:6).

Это изобретение относится к гуманизированному антителу-антагонисту, которое связывает гиперстабилизированный c-met человека, или к его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело является эффективным в отношении ингибирования активности гиперстабилизированного HGF/c-met человека in vivo, и антитело содержит в вариабельном участке H-цепи (V_H) по меньшей мере последовательность CDR3 моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6), и по существу человеческую консенсусную последовательность (например, остатки по существу человеческого каркасного участка (FR) тяжелой цепи человека подгруппы III (V_HIII)). В одном варианте осуществления антитело дополнительно содержит последовательность CDR1 и/или последовательность CDR2 H-цепи моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6). В другом варианте осуществления указанное выше антитело содержит последовательность CDR1, последовательность CDR2 и/или последовательность CDR3 L-цепи моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6) с по существу человеческим остатками консенсусного каркасного участка (FR) легкой цепи человека κ подгруппы I (VκI).

В одном варианте осуществления фрагмент антитела по этому изобретению содержит антигенсвязывающую часть, содержащую вариабельный домен тяжелой цепи, обладающий последовательностью:

QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:7)

В одном варианте осуществления фрагмент антитела по этому изобретению содержит антигенсвязывающую часть, содержащую вариабельный домен легкой цепи, обладающий последовательностью:

DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:8)

В других примерах может быть преимущественным антагонист c-met, который не препятствует связыванию лиганда (такого как HGF) с c-met. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антагонист по этому изобретению не связывает связывающий лиганд (такой как HGF) участок на c-met. В другом варианте осуществления антагонист по этому изобретению по существу не ингибирует связывание лиганда (например, HGF) с c-met. В одном варианте осуществления антагонист по этому изобретению по существу не конкурирует с лигандом (например, HGF) за связывание с c-met. В одном примере антагонист по этому изобретению можно использовать совместно с одним или несколькими другими антагонистами, где антагонисты нацелены на различные процессы и/или функции в системе HGF/c-met. Таким образом, в одном варианте осуществления антагонист c-met по этому изобретению связывается с эпитопом на c-met, отличным от эпитопа, с которым связывается другой антагонист c-met, такой как Fab-фрагмент моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6). В другом варианте осуществления антагонист c-met по этому изобретению отличается от (т.е. не представляет собой) Fab-фрагмента моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6). В одном варианте осуществления антагонист c-met по этому изобретению не содержит связывающей c-met последовательности антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией, доступной под регистрационным номером Американской коллекции типовых культур ATCC HB-11894 (гибридома 1A3.3.13) или HB-11895 (гибридома 5D5.11.6). В одном варианте осуществления антагонист по этому изобретению ингибирует активность c-met, но не связывается с околомембранным доменом c-met дикого типа.

В одном варианте осуществления антагониста c-met по этому изобретению связывание антагониста с c-met ингибирует активацию c-met посредством HGF. В одном варианте осуществления антагониста c-met по этому изобретению связывание антагониста с c-met в клетке ингибирует пролиферацию, распространение, морфогенез и/или подвижность клетки. В одном варианте осуществления антагонист c-met по этому изобретению связывается с гиперстабилизированным c-met в клетке, вызывая гибель клетки. Например, в одном варианте осуществления антагонист связан с токсином, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления антагонист c-met по этому изобретению представляет собой или содержит пептид (например, олигопептид), антитело, фрагмент антитела, аптамер, олигонуклеотид (например, антисмысловой олигонуклеотид), ингибиторную РНК или их сочетание.

В некоторых вариантах осуществления антагонист c-met по этому изобретению получают посредством способа скрининга или идентификации по этому изобретению, описанному в настоящем описании.

В другом аспекте это изобретение относится к способам скрининга или идентификации антагониста c-met. В одном примере указанные способы включают в себя контактирование вещества-кандидата с молекулой-мишенью, содержащей по меньшей мере часть гиперстабилизированного c-met, посредством чего отбирают вещество, которое специфично связывает указанную молекулу-мишень (в качестве антагониста c-met). В одном варианте осуществления способы дополнительно включают в себя определение наличия специфичного связывания отобранного вещества-кандидата с мутантным участком гиперстабилизированного c-met. Например, если молекула-мишень содержит полипептид, то выбранное вещество-кандидат должно специфично связываться с эпитопом, содержащим мутировавшее положение (или участок) гиперстабилизированного c-met. В другом примере, если молекула-мишень содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере часть гиперстабилизированного c-met, выбранное вещество-кандидат должно специфично ингибировать экспрессию гиперстабилизированного белка c-met с нуклеиновой кислоты, кодирующей гиперстабилизированный c-met. В некоторых вариантах осуществления способы скрининга по этому изобретению дополнительно включают в себя контактирование выбранного вещества с клеткой, экспрессирующей гиперстабилизированный c-met, где оценивают ингибирование активности c-met в клетке (например, где выявляют или количественно определяют уровень последующей передачи сигнала c-met (например, фосфорилирование MAPK)). Ингибирование активности в отношении передачи сигнала c-met можно оценивать множеством способов, известных в данной области и исходя из любого из множества критериев, известных в данной области, некоторые из которых описаны в настоящем описании более подробно. Например, ингибирование активности в отношении передачи сигнала c-met можно показать по снижению уровня активации c-met, которое в свою очередь можно показать, например, по уровню обусловленной c-met передачи сигнала в клетке. Передачу сигнала клетке можно оценивать множеством способов и исходя из различных критериев, которые известны в данной области, некоторые из которых описаны в настоящем описании. Например, частоту передачи сигнала в клетке посредством каскада HGF/c-met можно определить биологически по изменению фосфорилирования молекул-мишеней в каскаде передачи сигнала. Таким образом, например, можно измерять уровень фосфорилирования белка, обусловленного одной или несколькими известными мишенями для фосфорилирования в каскаде HGF/c-met. Примеры таких мишеней для фосфорилирования включают в себя сам c-met и активируемую митогеном протеинкиназу (MAPK).

В одном аспекте это изобретение относится к композиции, содержащий один или несколько антагонистов по этому изобретению и носитель. В одном варианте осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном аспекте это изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антагонист c-met по этому изобретению. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по этому изобретению кодирует антагонист c-met, который представляет собой или содержит полипептид (например, олигопептид). В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по этому изобретению кодирует антагонист c-met, который представляет собой или содержит антитело или его фрагмент. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по этому изобретению представляет собой аптамер. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по этому изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по этому изобретению представляет собой ингибиторную РНК (например, малую интерферирующую РНК).

В одном аспекте это изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по этому изобретению.

В одном аспекте это изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по этому изобретению. Вектор может представлять собой вектор любого типа, например, рекомбинантный вектор, такой как экспрессирующий вектор. Можно использовать любую из множества клеток-хозяев. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, например E. coli. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомяка (CHO).

В одном аспекте это изобретение относится к способам получения антагониста по этому изобретению. Например, это изобретение относится к способу получения антагониста c-met, который представляет собой или содержит антитело (или его фрагмент), где указанный способ включает в себя экспрессию в пригодной клетке-хозяине рекомбинантного вектора по этому изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела. В другом примере это изобретение относится к способу получения антагониста c-met, который представляет собой или содержит полипептид (такой как олигопептид), где указанный способ включает в себя экспрессию в пригодной клетке-хозяине рекомбинантного вектора по этому изобретению, кодирующего указанный полипептид (такой как олигопептид), и выделение указанного полипептида (такого как олигопептид).

В одном аспекте это изобретение относится к изделию, содержащему контейнер, и композиции, содержащейся в контейнере, где композиция содержит один или несколько антагонистов c-met по этому изобретению. В одном варианте осуществления композиция содержит нуклеиновую кислоту по этому изобретению. В одном варианте осуществления композиция, содержащая антагонист, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления изделие по этому изобретению дополнительно содержит инструкции по введению композиции (например, антагониста) субъекту.

В одном аспекте это изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую один или несколько антагонистов c-met по этому изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном варианте осуществления буфер является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления композиция, содержащая антагонист, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции по введению композиции (например, антагониста) субъекту.

В одном аспекте это изобретение относится к применению антагониста c-met по этому изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, новообразование, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное (такое как аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ангиогенезом нарушение. Антагонист c-met может находиться в любой форме, описанной в настоящем описании, включая антитело, фрагмент антитела, полипептид (например, олигопептид), нуклеиновую кислоту (например, олигонуклеотид, такой как антисмысловой олигонуклеотид, ингибиторная РНК), аптамер или их сочетание.

В одном аспекте это изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты по этому изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, новообразование, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное (такое как аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ангиогенезом нарушение.

В одном аспекте это изобретение относится к применению экспрессирующего вектора по этому изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, новообразование, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное (такое как аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ангиогенезом нарушение.

В одном аспекте это изобретение относится к применению клетки-хозяина по этому изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, новообразование, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное (такое как аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ангиогенезом нарушение.

В одном аспекте это изобретение относится к применению изделия по этому изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, новообразование, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное (такое как аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ангиогенезом нарушение.

В одном аспекте это изобретение относится к применению набора по этому изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, новообразование, клеточно-пролиферативное нарушение, иммунное (такое как аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ан