Противовоспалительная и/или аналгетическая композиция для кишечника, содержащая разветвленные мальтодекстрины

Противовоспалительная и/или аналгетическая композиция для кишечника, содержащая разветвленные мальтодекстрины

Реферат

Изобретение относится к обогащенной волокнами противовоспалительной и/или аналгетической композиции для кишечника, отличающейся тем, что она содержит разветвленные мальтодекстрины.

Хронические воспалительные болезни кишечника (ХВБК) подразделяются, более конкретно, на два различных заболевания: язвенно-геморрагический ректоколит (ЯГР) и болезнь Крона. Эти две болезни, отличающиеся одна от другой, но в то же время родственные, характеризуются более или менее обширными воспалительными поражениями кишечника, обусловленными, в частности, состоянием гиперактивности иммунной системы кишечника, происхождение которого неизвестно.

Проявление этих заболеваний в основном связано с пищеварением, сопровождающимся диареей, брюшинными болями, исхуданием, воспалением тканей.

В последние десятилетия наблюдается рост частоты случаев ХВБК. Это частично объясняется достигнутым техническим прогрессом, позволяющим легче диагностировать болезни, но создается сильное впечатление, что в развитие этих болезней вмешивается изменение пищевых привычек, та же, как и пищевые аллергии, ожирение и другие «болезни цивилизации».

В последнее время значительный интерес привлекло сочетание применения специальных алиментарных режимов с более традиционными терапевтическими методами лечения.

С целью их введения в диетическую программу лиц, затронутых названными патологиями, были более внимательно изучены пребиотики и пробиотики, позволяющие улучшить условия жизни этих лиц и играть важную роль в профилактике названных расстройств.

Более конкретно, признано, что внесение в питание подходящих волокон оказывает на здоровье благотворное влияние, поскольку эти волокна, проявляют защитный эффект в отношении воспаления ободочной кишки.

Упомянутые волокна обычно классифицируют по двум категориям: растворимые волокна и нерастворимые волокна.

Растворимые волокна, такие как пектин и инулин, не перевариваемые ферментами человека, ферментируются кишечной бактериальной флорой. Это ферментирование высвобождает в ободочной кишке короткоцепочечные жирные кислоты, которые понижают рН ободочной кишки, следствием чего является ограничение развития патогенных бактерий.

Нерастворимые волокна, такие как целлюлоза, устойчивые крахмалы, волокна кукурузы (отходы) или сои, выполняют по существу механическую роль в желудочно-кишечном тракте. Они лишь очень слабо ферментируются кишечной флорой и способствуют уменьшению времени прохождения через кишечник с помощью балластного эффекта.

Из многочисленных исследований, целью которых было доказать важность алиментарного режима для предупреждения воспаления ободочной кишки, стало ясно, что существует связь между сложными сахарами (полисахариды, крахмал) и хорошей физиологией ободочной кишки.

При этом серьезный интерес для здоровья ободочной кишки представляют именно стойкие крахмалы, не перевариваемые в тонкой кишке.

Однако остается еще много работы, которую необходимо выполнить, для того, чтобы модифицировать композицию продуктов питания со стойкими крахмалами так, чтобы при этом не изменить ее органолептических свойств.

С 1997 года KANAUCHI et al. описывают влияние продуктов питания на основе проросшей ржи на колиты и диареи, индуцируемые лабораторным животным (в Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, 449-454, и в J. Gastroenterol. 1998, 33, 179-188).

Однако в течение этих последних лет специалисты по названным патологиям обращаются в большей степени к «ободочным продуктам питания» и, более конкретно, к пребиотикам.

Пребиотики определяются как питательная среда для благоприятных для здоровья бактерий, размножающихся в ободочной кишке.

Пребиотиками являются функциональные ингредиенты, содержащиеся во многих съедобных растениях и во многих пищевых продуктах.

Классифицируемыми классическим образом соединениями, относящимися к пребиотикам, являются фруктоолигосахариды и трансгалактоолигосахариды, а также лактулоза, изомальтоолигосахариды, экстрагированные из сои олигосахариды, ксилоолигосахариды и т.п.

Мишенями их функционального действия являются ободочная флора, которая их ферментирует и для которой они служат специфическими и селективными субстратами, желудочно-кишечная физиология и, в частности, функции, выполняемые ободочной кишкой, иммунная система, биодоступность минералов и метаболизм липидов.

Из полезной ободочной флоры, росту которой способствуют пребиотики, прежде всего следует назвать бифидобактерии и лактобациллы.

Преимуществом лактобацилл является то, что, продуцируя молочную кислоту, они приводят к понижению рН среды, а это понижение рН препятствует росту патогенной флоры типа протеобактерий или энтеробактерий, агентов, вызывающих такие патологии как болезнь Крона или язвенные колиты.

Бифидобактерии описывают, в частности, как продуцирующие ферментные активности типа глюкозидаз, которые благоприятствуют высвобождению флавоноидов с антимутагенным и антиоксидантным эффектами.

Воспалительные болезни и соответствующее им лечение являются объектом активных исследований. Разработаны экспериментальные модели индуцирования колитов, такие как индуцирование колитов путем введения лабораторной крысе или мыши этанольного раствора, содержащего аллерген (тринитробензолсульфонат, TNBS).

Этанол способствует разрушению барьера, образуемого кишечной слизистой оболочкой и, таким образом, благоприятствует прониканию в стенку кишечника TNBS, который вызывает острые некрозы, часто трансмуральные, которые возможно обусловлены окислительными повреждениями.

Такая модель предусмотрена для исследования локальной сверхчувствительности ободочной кишки и является в особенности подходящей, поскольку воспаления, вызываемые этой моделью, чувствительны к медикаментам, применяемым в случае ХВБК.

Предложены и протестированы на животной модели несколько противовоспалительных композиций для кишечника.

Фруктоолигосахариды (ФОС) представляют собой короткоцепочечные полимеры со звеньями фруктозы, которые не гидролизуются в тонкой кишке человека, но разрушаются флорой, населяющей ободочную кишку.

ФОС индуцируют главным образом рост лактобацилл и эндогенных бифидобактерий кишечника человека и животных.

Кроме того, ферментация ФОС приводит к понижению рН ободочной кишки, индуцирует продукцию летучих жирных кислот, лактатов и при этом усиливает продукцию бутиратов.

В своем обзоре, опубликованном в 2003 году в American Society for Nutritional Sciences, vol.133, 21-27, C.CHERBUT et al. описывают профилактический эффект ФОС в отношении воспаления кишечника, индуцируемого у лабораторной крысы с использованием TNBS.

Защитные эффекты ФОС измеряют с помощью макроскопической оценки повреждения ободочной кишки (визуальное изучение некрозов и язв, вызванных TNBS) и измерения активности миелопероксидазы (специфического фермента гранул многоядерных нейтрофилов - маркера воспаления кишечника).

В названной статье было, таким образом, показано, что ФОС в значительной степени снижают кишечное воспаление, позволяя ограничить повреждения кишечника (некрозы и язвы), уменьшают миелопероксидазную активность и уменьшают также вызываемую TNBS потерю веса.

С другой стороны, C.CHERBUT et al. доказывают также, что ФОС действительно обладают пребиотическим эффектом, т.е. они способны стимулировать кишечный рост полезных бактерий в ободочной кишке, в частности молочнокислых и маслянокислых бактерий, что приводит к понижению рН ободочной кишки.

Защитный механизм ФОС отчетливо не объяснен.

В патентной заявке US 2004/01219157 было предложено, что ФОС должны стимулировать гомеостаз неспецифических иммунологических параметров и должны стимулировать рост подпопуляций лимфоцитов.

Было также предложено, что молочнокислые бактерии, рост которых стимулируется ФОС, являются антагонистами патогенных бактерий, развитие которых они блокируют продуцированием антимикробных веществ и понижением рН ободочной кишки.

Молочнокислые бактерии могут также прилипать к стенкам кишечника и препятствовать, таким образом, заселению этих стенок патогенными бактериями.

С другой стороны, ФОС влияют также на понижение рН ободочной кишки путем индуцированной продукции молочной и масляной кислот.

Однако такой эффект кишечного ацидоза дает не только одни преимущества.

Действительно, в международной патентной заявке WO 04/026316 указывается, что такой ацидоз, которому в особенности благоприятствует рост молочнокислых бактерий, в конечном итоге вызывает эрозию слизистой ободочной кишки, повышая риск язвенных колитов.

С другой стороны, накопление в ободочной кишке молочной кислоты может также иметь последствием выброс ее избыточных количеств в кровь, что приведет к метаболическому ацидозу.

Недостатком инулина, так же как и ФОС, является то, что они слишком быстро ферментируются в ободочной кишке и могут, таким образом, привести к неравновесности в микробной популяции, что окажет вред их защитному эффекту в отношении ободочной кишки.

Чтобы сбалансировать этот неблагоприятный эффект, в упомянутой патентной заявке WO 04/026316 предложено добавлять к ФОС полисахарид, характеризующийся медленной ферментацией в ободочной кишке, в данном случае полидекстрозы.

Полидекстрозу синтезируют с использованием трудно протекающей полимеризации глюкозы в присутствии сорбита с подходящим кислым катализатором (таким как лимонная кислота) при высокой температуре.

Полидекстроза широко используется в питании в качестве балластного агента и в качестве низкокалорийного ингредиента. Полидекстроза не переваривается и не всасывается в тонкой кишке и большая ее часть попадает в экскременты.

То, чему уделяется особое внимание в патентной заявке WO 04/026316, - это применение полидекстрозы для ослабления эффектов ацидоза, индуцируемых неравновесностями, вызываемыми в микробной популяции в ободочной кишке, в частности эффектов, индуцируемых пребиотическими агентами, такими как инулин и ФОС.

Полидекстроза должна, таким образом, способствовать потреблению молочной кислоты особыми видами флоры, что будет компенсировать ее сверхпродукцию, индуцируемую ФОС.

Из всего сказанного выше следует, что, насколько известно фирме-заявителю, не существует единой полисахаридной композиции, которая бы удовлетворила всем требованиям для эффективной защитной композиции для кишечника.

В связи с этим задачей настоящего изобретения является преодоление трудностей предшествующего уровня техники.

Выполняя эту задачу, фирма-заявитель обнаружила, что включение разветвленных мальтодекстринов дает возможность выгодным образом примирить все цели, которые до сих пор считались непримиримыми, замыслив и разработав ценой многочисленных исследований новую противовоспалительную и/или аналгетическую композицию для ободочной кишки, обогащенную волокнами, которая соответствует всем названным выше критериям, а именно обладает защитным эффектом слизистой ободочной кишки, умеренно понижает рН ободочной кишки, способствует продуцированию пропионовокислых и маслянокислых бактерий и в определенной степени молочнокислых бактерий.

Целью изобретения являются, таким образом, разветвленные мальтодекстрины, имеющие от 15 до 35% глюкозидных связей 1→6, содержание редуцирующих сахаров ниже 20%. показатель полимолекулярности ниже 5 и среднечисленную молекулярную массу Мn, не превышающую 4500 г/моль, для их применения в способе терапевтического лечения человеческого или животного организма.

Под разветвленными мальтодекстринами в изобретении подразумеваются мальтодекстрины, описанные в патенте ЕР 1.006.128, держателем которого является фирма-заявитель.

Все описанные в патенте ЕР 1.006.128 разветвленные мальтодекстрины пригодны для приготовления противовоспалительных и/или аналгетических композиций для кишечника согласно изобретению.

Согласно одному из предпочтительных вариантов эти композиции характеризуются содержанием редуцирующих сахаров от 2 до 5% и среднечисленную молекулярную массу Мn от 2000 до 3000 г/моль.

Разветвленные мальтодекстрины характеризуются общим содержанием волокон, равным 50% (на сухой вес), определенным по методу АОАС n°2001-03 (2001).

Целью изобретения является обогащенная волокнами композиция для терапевтического лечения человеческого или животного организма, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного ингредиента разветвленные мальтодекстрины.

Обогащенная волокнами противовоспалительная и/или аналгетическая композиция согласно изобретению содержит от 0,5 до 20%, предпочтительно от 5 до 10% (на сухой вес) указанных разветвленных мальтодекстринов так, чтобы обеспечить введение волокон и удовлетворительный защитный эффект в отношении ободочной кишки.

При количестве, меньшем 0,5 вес % разветвленных мальтодекстринов, в противовоспалительной и/или аналгетической композиции, введение волокон не является достаточным для того, чтобы получить обнаруживаемый эффект.

Эти разветвленные мальтодекстрины обладают неперевариваемой природой, что является препятствием для их всасывания в тонкой кишке.

Они представляют собой источник неперевариваемых волокон, благоприятных для метаболизма и для равновесия в кишечнике.

Повышенное содержание глюкозидных связей 1-6 сообщает разветвленным мальтодекстринам эффект совершенно особых пребиотических свойств: в действительности, было выяснено, что бутирогенные, молочнокислые и маслянокислые бактерии метаболизируют эти высокоразветвленные соединения.

Эти разветвленные мальтодекстрины способствуют также развитию бифидогенных бактерий в ущерб нежелательным бактериям и, таким образом, благоприятствуют также проявлению активностей α- и β-глюкозидаз.

Противовоспалительная и/или аналгетическая композиция для кишечника согласно изобретению позволяет усиливать от 2 до 10 и преимущественно от 3 до 8 раз ферментные активности α- и β-глюкозидаз в содержимом слепой кишки и экскрементов, как это будет проиллюстрировано ниже.

Отсюда происходят свойства абсолютно благоприятные для здоровья потребителя.

С другой стороны, потребление разветвленных мальтодекстринов противовоспалительной и/или аналгетической композиции согласно изобретению микроорганизмами ободочной кишки приведет к понижению на 0,5-1 единицу рН содержимого слепой кишки, кишечника и фекалий, что отражает равновесный рост указанных микроорганизмов.

Применение противовоспалительной и/или аналгетической композиции согласно изобретению позволяет также увеличить продукцию летучих органических кислот в слепой кишке, которые (органические кислоты) выбраны из группы, состоящей из уксусной, пропионовой и масляной кислот, преимущественно из кислот пропионовой и масляной.

Защитный эффект в отношении ободочной слизистой доказан, в частности после введения TNBS животному, и выражается в замечательных результатах, как это будет показано ниже на примерах.

Животные продолжают нормально питаться и оказываются в значительной степени защищенными в отношении некротизирующего воспаления, индуцируемого TNBS, как это доказывает понижение активности миелопероксидазы (МРО), количественно определяемой в кишечном эпителии.

Действительно, эта активность МРО отражает инфильтрацию нейтрофилов в фагосомы и внеклеточное пространство и позволяет количественно оценивать процесс воспаления, с которым она непосредственно коррелируется.

В результате этого противовоспалительная и/или аналгетическая композиция для кишечника согласно изобретению позволяет понижать от 5 до 40%, преимущественно от 7 до 35%, миелопероксидазную активность кишечного эпителия.

Этот результат в существенной степени отражает защитный эффект указанных композиций против воспаления, позволяющий считать препарат противовоспалительных и/или аналгетических композиций для кишечника улучшающим самочувствие больных, как у человека, так и у животных.

С другой стороны, было обнаружено, что разветвленные мальтодекстрины согласно изобретению даже в значительных дозах не вызывают осмотические диареи.

Феномен осмотических диарей наблюдается при употреблении способных ферментироваться низкомолекулярных углеводов, таких, например, как лактулоза и фруктоолигосахариды.

Этот феномен выражается в повышении содержания воды в экскрементах в качестве реакции на повышение осмотического давления в фекальном содержимом, причем это повышение содержания воды может в конечном итоге приводить к появлению диарей. Удивительным образом и неожиданно оказалось, что разветвленные мальтодекстрины согласно изобретению не приводят к названному феномену, несмотря на то, что они способны ферментироваться.

В процессе приема пищи противовоспалительная и/или аналгетическая композиция для кишечника согласно изобретению может предлагаться в форме готовой к употреблению или в виде напитка, такого как фруктовый сок, суп, или же в форме йогуртов, или же будучи введенной в злаковые продукты для завтрака.

Указанная композиция может в то же время применяться и для животных, более конкретно для кошек, собак, свиней, кроликов или других приносящих доход животных, которые восприимчивы к воспалению кишечника в силу сниженного иммунитета.

Эта композиция может быть также предложена в качестве пищевой добавки для лиц, страдающих ФВБК, а также для лиц, страдающих синдромом раздраженного кишечника, лиц с болезнью la tourista и брюшными болями часто неясной этиологии.

В аптеке противовоспалительная и/или аналгетическая композиция для кишечника согласно изобретению может содержать разветвленные мальтодекстрины и, по меньшей мере, еще один активный ингредиент в количестве, зависящем от природы добавляемого активного ингредиента.

Этим другим активным ингредиентом преимущественно является противовоспалительный кишечный агент.

При лечении ХВБК могут быть, например, предложены два типа лечения:

- лечение с помощью медикаментов, являющихся производными салициловой кислоты, таких как сульфасалазин и его производные типа 5-аминосалицилатов (5-ASA),

- лечение на основе медикаментов из семейства кортикоидов, таких как кортизон и преднизолон.

Один из способов осуществления изобретения касается композиции, такой как описана выше, содержащей разветвленные мальтодекстрины, отличающейся тем, что она, кроме того, содержит, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбираемое из группы, состоящей из сульфасалазина и его производных и кортикоидов.

Согласно одному из особых способов осуществления изобретение относится к композиции, такой как описана выше, содержащей разветвленные мальтодекстрины и, кроме того, содержащей, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбираемый из группы, состоящей из сульфасалазина и его производных, отличающейся тем, что отношение веса разветвленных мальтодекстринов к весу сульфасалазина или одного из его производных составляет от 2 до 30.

Один из способов осуществления изобретения касается композиции, такой как описана выше, содержащей разветвленные мальтодекстрины и, кроме того, содержащей, по меньшей мере, один активный ингредиент, выбираемый из группы, состоящей из кортикоидов, отличающейся тем, что отношение веса разветвленных мальтодекстринов к весу кортикоида составляет от 2 до 250.

Как правило, композиция согласно изобретению может предлагаться в форме жидкости, в виде порошка, в виде сиропа, в виде таблетки или в виде лепешки.

Один из способов осуществления изобретения касается набора (кита) для терапевтического лечения организма человека или животного, включающий:

a) первую композицию, такую как описана выше, содержащую разветвленные мальтодекстрины; и

b) вторую композицию, содержащую какой-либо кишечный противовоспалительный агент.

Одним из способов осуществления изобретения является способ лечения или предупреждения воспалений кишечника и/или ослабления болей в области кишечника, включающий введение индивидууму достаточного терапевтического количества разветвленных мальтодекстринов.

Одним из особых способов осуществления изобретения является способ лечения или предупреждения воспалений кишечника и/или ослабления болей в области кишечника, включающий введение индивидууму или животному композиции, такой как описана выше, содержащей разветвленные мальтодекстрины.

Описанные выше композиции, содержащие разветвленные мальтодекстрины, могут с успехом вводиться индивидууму или животному в сочетании со второй композицией, содержащей какой-либо кишечный противовоспалительный агент.Во время лечения обе композиции могут вводиться одновременно или через временной промежуток. Способ введения второй композиции зависит от используемого кишечного противовоспалительного агента.

Одним из особых способов осуществления изобретения является способ лечения или предупреждения воспалений кишечника и/или ослабления болей в области кишечника, включающий одновременное или разделенное промежутком времени введение обеих описанных композиций, входящих в описанный выше набор.

Одним из особых способов осуществления изобретения является использование разветвленных мальтодекстринов для приготовления композиции или набора для лечения или предупреждения воспалений кишечника и/или ослабления болей в области кишечника.

Из болезней и болей, которые можно лечить или предупреждать, можно назвать хроническую воспалительную болезнь кишечника, синдром раздраженного кишечника, tourista, или брюшинные боли. Из хронических воспалительных болезней кишечника можно назвать язвенно-геморрагический ректоколит и болезнь Крона.

Что касается аналгетической роли композиции изобретения, она оценивается по экспрессии рецепторов PRAR γ и MOR.

Рецепторы PRAR γ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ) являются частью семейства ядерных рецепторов. Они активируются, в частности, жирными кислотами и вовлечены в трансдукцию метаболических и питательных сигналов в виде транскрипционных ответов. Им принадлежит основная роль в поддержании целостности кишечной слизистой.

Специалистам известно, что рецепторы PRAR γ в сильной степени вовлечены в регуляцию воспаления ободочной кишки. Они экспрессируются также в случае раков ободочной кишки и их активация ингибирует клеточный рост и клеточную дифференциацию.

Рецепторы MOR (µ Opioid Receptor) находится в центральной и периферической нервной системе и могут, в частности, присутствовать в ободочной кишке. Основной функцией MOR является аналгетическая функция. Другой их функцией является ингибирование моторики кишечника. MOR вовлечены также в регуляцию воспаления кишечника.

Как это будет подтверждено приведенными ниже примерами, существенно отметить, что композиция изобретения позволяет повысить от 1,2 до 3 раз, преимущественно от 1,6 до 2 раз активность рецептора Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ(PRARγ).

Таким же образом композиция изобретения позволяет повысить фактор усиления рецептора µ Opioid Receptor (MOR) от 1,2 до 10, преимущественно от 2,5 до 7,5 и еще более предпочтительно от 4 до 5.

Кроме всего прочего указанная композиция является особенно подходящей для стрессовых субъектов, стресс которых проявляется в сфере пищеварения.

Изобретение станет более понятным при знакомстве с приведенными ниже примерами, целью которых является проиллюстрировать, но не ограничить изобретение.

Пример 1

На лабораторной крысе изучают влияние скармливания композиций, содержащих разветвленные мальтодекстрины (РМД) изобретения или глюкозу (контроль), ассоциированных с нерастворимыми волокнами (кукурузными отходами или целлюлозой), на защиту их ободочной слизистой после ввода TNBS.

Ассоциация нерастворимых волокон (в данном случае кукурузных отходов) с РМД изобретения осуществляется таким образом, чтобы имитировать поступление волокон злаковых продуктов при питании согласно рекомендациям санитарных органов.

Кроме того, кукурузные отходы были выбраны потому, что они богаты каротиноидами и полифенолами (в частности, фенольной и феруловой кислотами).

Выбранные в этом примере разветвленные мальтодекстрины изобретения имеют от 15 до 35% глюкозидных связей 1→6, содержание редуцирующих сахаров от 2 до 5%, показатель полимолекулярности ниже 5 и среднечисленную молекулярную массу Мn от 2000 до 3000 г/моль:

Редуцирующие сахара	2,3
Мn (г/моль)	2480
Mw (г/моль)	5160
Связи 1,2(%)	10
Связи 1,3 (%)	12
Связи 1,4(%)	49
Связи 1,6 (%)	29

Кроме того, суммарное содержание волокон в разветвленных мальтодекстринах, определенное метолом АОАС (n° 2001-03), составляет 90% (на сухой вес).

64 крысы OFA линии Sprague Dawley разделены на 8 групп, каждая из которых имеет в своем питании и питье особый режим, состав которого дается в приведенной ниже таблице I.

Глюкоза и разветвленные мальтодекстрины содержатся в питье пищевого рациона в количестве 5 вес %. Целлюлоза и кукурузные отходы содержатся в пище пищевого рациона в количестве 5 вес %.

Таблица I
Группа	Тестируемый продукт в питье	Тестируемый продукт в пище	Внутриректальная инъекция
1	Глюкоза	Целлюлоза	NaCl
2	РМД	Целлюлоза	NaCl
3	Глюкоза	Кукурузные отходы	NaCl
4	РМД	Кукурузные отходы	NaCl
5	Глюкоза	Целлюлоза	TNBS
6	РМД	Целлюлоза	TNBS
7	Глюкоза	Кукурузные отходы	TNBS
8	РМД	Кукурузные отходы	TNBS

После недельного карантина, в течение которого животные получают стандартное питание и питьевую воду, крысы получают в течение 20 дней пищу и питье согласно режиму питания, представленному в таблице I.

После этого крысы не получают пищу в течение 24 часов.

На 21-й день животным проводят интраректальную инъекцию продуктов, рекомендуемых в таблице I.

Животным групп 5-8 проводят внутриректальную инъекцию 500 µл TNBS, разбавленного 40%-ным (по Гей-Люссаку) этанолом, в то время как группам 1-4 проводят интраректальную инъекцию 500 µл 0,9%-ного NaCl.

TNBS инъецируют в дозе 10 мг/кг веса тела в сутки.

Известно, что эта доза вызывает тяжелую, но обратимую воспалительную реакцию.

Изменение веса животных прослеживают в течение 3 дней после инъекции.

На 24-й день животных усыпляют методом асфиксии в СО₂.

Животных взвешивают, затем вскрывают, забирают ободочную кишку, опорожняют ее и взвешивают.

После этого проводят визуальный осмотр ободочной кишки и оценивают с помощью оценок Уоллиса.

Кроме этого в кишечном эпителии количественно определяют миелопероксидазную (МРО) активность.

Эта активность отражает инфильтрацию нейтрофилов в фагосомы и межклеточное пространство и позволяет количественно оценивать воспалительный процесс, с которым она непосредственно связана.

Оценка Уоллиса устанавливается с использованием шкалы Уоллиса, которая представлена в приведенной ниже таблице II.

Таблица II
Оценка	Макроскопические наблюдения
0	Никаких поражений
1	Гиперемия. Изъязвлений нет.
2	Гиперемия и уплотнение слизистой. Изъязвлений нет.
3	Язва без уплотнения слизистой.
4	2 или несколько очагов изъязвления или воспаления.
5	2 или несколько очагов изъязвления или воспаления или один очаг изъязвления/воспаления на протяжении более 1 см по длине ободочной кишки.
6 и выше	Если поражения покрывают более 2 см по длине ободочной кишки, оценка повышается на 1 на каждый дополнительно поврежденный см.

Что касается количественного определения МРО-активности, для нее необходимо препарирование ободочной кишки согласно следующему протоколу.

Фрагменты ободочной кишки суспендируют в 6 мл гексадецил(триметил)аммоний-бромидного буфера (0,5% бромида гексадецил(триметил)аммония (НТАВ) в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,0). Обработанные таким образом фрагменты размалывают и гомогенизируют в течение 10 сек с помощью POLYTRON. На каждый образец воздействуют ультразвуком с помощью устройства марки VIBRA CELL 500 Watts фирмы Sonics and Materials Inc., Дэнбьюри, Коннектикут, США (мощность на преобразователе 500 Вт, мощность, рассеянная на зонде 30%, т.е. 150 Вт/см², пульсатор в положении 2, т.е. 66% секунды).

Облученные образцы подвергают затем трем циклам замораживания-размораживания, после чего снова облучают ультразвуком в тех же условиях. Образцы после этого центрифугируют в течение 15 мин при скорости 10000 g и 4°С.

Забирают супернатант для определения МРО. Определение МРО-активности основано на окислении искусственного донора водорода, окисляющегося пероксидом водорода (гваякола), который в окисленной форме приобретает оранжевый цвет.

Прослеживание кажущейся оптической плотности при 470 нм и 30°С дает значения активности (выраженные в единицах поглощения в 1 мин на 1 г ободочной кишки). Все полученные при этом результаты представлены в приведенных ниже таблицах III и IV (значения выражены как среднее значение результатов измерений, произведенных на 8 животных каждой группы±стандартное отклонение).

Таблица III
Партия	День 0	День 7	День 14	День 20	День 21	День 22	День 23	День 24
1	140,5±7,4	199,6±13,6	259,0±19,6	308,2±14,9	275,3±15,4	301,5±15,8	306,6±15,8	316,6±16,6
2	141,3±4,9	204,1±14,2	263,3±14,1	313,2±10,9	294,4±45,4	301,7±12,7	310,7±13	320,9±12,1
3	139,0±7,1	199,2±14,6	257±17,7	312,6±19,9	280,8±18,8	310,1±18,5	316,9±18,6	327,1±20,9
4	138,9±4,6	199,1±14,5	258,9±17,2	305,6±17,8	274,5±16,7	299,2±15,0	305,1±16,0	315,3±16,0
5	140,2±10,3	200,6±13,4	259,4±14,5	305,8±15,4	274,7±14,8	275,9±14,4	270,0±13,0	276,8±20,9
6	147,2±9,3	211,4±19,4	270,6±23,8	317,3±22,7	280,9±22,1	288,5±22,0	287,4±26,6	296,6±28,6
7	145,9±14,6	208,8±24,2	266,1±31,7	314,7±34,0	281,9±31,2	285,4±37,0	275,0±38,8	286,7±40,7
8	144,6±13,7	208,1±19,4	266,6±18,2	319,1±11,1	286,0±13,6	297,3±14,3	301,8±15,0	312,5±12,5

Изменение веса показывает, что на 20-й день все животные имеют один и тот же вес. На 21-й день все животные худеют, так как перед интраректальной инъекцией не получали пищи.

На 22-й день животные, которые получали интраректальную инъекцию 0,9%-ного NaCl, значительно прибавляют в весе.

Группа 8 является единственной группой, которой было проведено введение, вызывающее воспаление в результате действия TNBS и у которой увеличение веса начинается с 22-го дня.

Увеличение веса у животных групп 5, 6 и 7 начинается умеренно только с 23-го и 24-го дня.

Кривая веса животных группы 8, будучи идентичной кривой для животных, не получавших TNBS, указывает на то, что эти животные начали питаться с 21-го дня. Таким образом, эти животные были защищены от индуцируемого TNBS некротизирующего воспаления.

Таблица IV
Партия	Оценки по Уоллису	Вес опорожненной ободочной кишки (г)	МРО-активность (единицы оптического поглощения/мин/г)
1	0,0±0,0	2,04±0,30	0,126±0,072
2	0,0±0,0	2,19±0,21	0,126±0,072
3	0,0±0,0	1,96±0,26	0,126±0,072
4	0,0±0,0	1,96±0,26	0,126±0,072
5	5,8±1,0	2,82±0,48	3,152±1,244
6	5,9±2,0	2,90±0,43	2,908±1,330
7	6,5±1,9	2,99±0,73	2,685±0,650
8	3,9±2,7	2,76±0,37	2,114±1,639

Этот результат подтверждается определением оценки по Уоллису. Действительно, животные, получавшие композиции согласно изобретению с кукурузными отходами и TNBS, имеют оценку по Уоллису 3,9 в сравнении со средними оценками 5,8, 5,9 и 6,5, полученными другими группами, получившими TNBS.

Эта средняя оценка 3,9 указывает на значительно более низкий уровень воспаления у животных группы 8.

Результаты измерения веса ободочных кишок показывают прежде всего то, что у животных, получивших инъекцию, вес ободочной кишки превосходит вес ободочной кишки животных, которые не получали TNBS.

Этот феномен обусловлен, в частности, отеком, который наполняет слизистую воспаленных ободочных кишок.

Средний вес ободочной кишки животных группы 8 остается повышенным по сравнению со средним весом ободочных кишок животных групп, не получивших TNBS, но остается самым низким из всех групп животных, получивших TNBS.

Что касается измерений МРО-активностей, явно слабых у животных групп, не получивших TNBS, то отсюда еще раз явствует, что именно группа 8 обладает самыми низкими МРО-активностями по сравнению с другими группами животных, получивших TNBS.

Таким образом, животные группы 8 в значительной степени защищены от вызываемого TNBS некротизирующего воспаления.

Пример 2

На лабораторной крысе изучают влияние разветвленных мальтодекстринов изобретения (идентичных разветвленным мальтодекстринам из примера 1) и декстрозы (контроль) на раздражение ободочной кишки, вызываемое введением TNBS крысам-самцам WISTAR, и их когнитивные способности в тесте на выработку условного рефлекса избегать неприятного светового раздражителя.

В этом тесте используется отвращение крысы к сильно освещенному окружению. Принцип состоит в том, что животное, которое испытывает страдание, является животным, которое наименее быстро обучается в тесте на выработку условного рефлекса.

Вначале крыса выучивается устранять неприятное для нее световое окружение при проведении теста на выработку условного рефлекса: животное выучивается нажимать на активный рычаг (АР) для получения 30-секундных периодов темноты в качестве положительного подкрепления.

Устройство включает в себя также и другой рычаг, который при приведении его в действие не позволяет получить свет: неактивный рычаг (HP).

Число активных и неактивных нажатий позволяет оценить уровень манипуляционной активности крыс.

Приобретение опыта (различение двух рычагов) оценивается путем сравнения чисел нажатий на каждый из двух рычагов в фазе «свет» (отношение АР к HP).

48 крыс-самцов WISTAR/AF EOPS распределяют по 4 группам, которые получают питание в режиме, составленном так, как показано в приведенной ниже таблице V.

Таблица V
Группа	Режим питания	Характер воздействия на 17-й день
1	Декстроза (5%)	Этанол (20%)
2	Декстроза (5%)	TNBS-спирт (20%)
3	MDB (5%)	Этанол (20%)
4	MDB (5%)	TNBS - спирт (20%)

После карантинного периода, в течение которого животные получают стандартное питание и питьевую воду, животные в течение 15 дней принимают пищу с добавлением либо 5% разветвленных мальтодекстринов изобретения, либо 5% декстрозы.

На 15-й день крыс лишают питания на 48 часов.

На 16-й день крыс анестезируют и двум группам из четырех (группам 2 и 4) вводят в ободочную кишку по 500 µл TNBS в 20%-ном (по Гей-Люссаку) этаноле в расчете 3 мг на 1 кг веса тела (т.е. 1 мг на крысу - признано, что эта доза вызывает боль, обусловленную небольшим раздражением кишечника).

С 17-го по 23-й день животные продолжают получать режимы, дополненные РМД или декстрозой.

На 22-й день проводится когнитивный тест: тест на устранение неприятного светового раздражителя (ТУНСР).

В приведенных ниже таблицах VI и VII показан результат теста ТУНСР, проведенного на животных разных групп. В таблице VII представлено общее число нажатий во время теста.

Таблица VI
Группы	1	2	3	4
ANOVA F(3,41)=0,77	39,33±8,63	35,20±9,43	40,08±7,43	53,27±9,72

В таблице VII представлено число нажатий на АР и HP.

Хотя результаты в значительной степени не различаются, таблица VII показывает, что крысы, получившие вместе с пищей РМД изобретения, чаще нажимают на рычаги и, более конкретно, группа 4 чаще по сравнению с группой 2.

Таблица VII
Группы	1	2	3	4
Нажатие на АР	10,50±1,79	9.60±2.13	10,25±1,45	53,27±9,72
Нажатие на HP	9,00±2,20	8,20±2,02	6,42±1,19	7.64 1,07
Парный тес