Конъюгаты антитело-лекарственное средство и способы

Конъюгаты антитело-лекарственное средство и способы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

На основании 35 USC § 119(e) по настоящей заявке, которая не является предварительной и которая была подана на основании 37 CFR § 1.53(b), испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/576517, поданной 1 июня 2004 года, и предварительной заявки США № 60/616098, поданной 5 октября 2004 года, каждая из которых приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение в основном относится к соединениям с противоопухолевой активностью, и, более конкретно, к антителам, конъюгированным с химиотерапевтическими майтанзиноидными лекарственными средствами или токсинами. Изобретение также относится к способам применения соединений-конъюгатов антитело-лекарственное средство для in vitro, in situ и in vivo диагностики или обработки клеток млекопитающих или связанных с ними патологических состояний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лечение антителами было разработано для направленного лечения пациентов со злокачественными опухолями, иммунологическими и ангиогенными нарушениями. Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), то есть иммуноконъюгатов, для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, то есть лекарственных средств, для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; патент США № 4975278) теоретически обеспечивает направленную доставку лекарственного вещества к опухолям и их накопление внутри клеток, в тех случаях, когда системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может привести к нежелательным условиям токсичности не только в опухолевых клетках, подлежащих уничтожению, но и в здоровых клетках (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,» in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506). Таким образом, необходимо получить максимальную эффективность при минимальной токсичности. Попытки создания и усовершенствования ADC были сфокусированы на селективности моноклональных антител (mAb), а также на свойствах связывания лекарственных средств и высвобождения лекарственных средств. В качестве подходящих для этих стратегий были указаны и поликлональные антитела, и моноклональные антитела (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Используемые в этих способах лекарственные средства включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат, митомицин, неокарциностатин (Takahashi et al. (1988) Cancer 61:881-888) и виндезин (Rowland et al., (1986), supra). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, токсины растений, такие как рицин (патент США № 4753894; патент США № 5629197; патент США № 4958009; патент США № 4956453), низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al. (2000) J. of the из Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), и калихимицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Токсины могут осуществлять свои цитотоксические и цитостатические эффекты посредством механизмов, в том числе связывания тубулина, связывания ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства при конъюгации с большими антителами или белковыми лигандами рецепторов, как правило, становятся неактивными или менее активными.

ЗЕВАЛИН (ZEVALIN®) (ибритумомаб тиоксетан, Biogen/Idec), одобренный для применения конъюгат антитело-радиоактивный изотоп, состоящий из моноклонального антитела IgG1 каппа мыши против антигена CD20 и радиоактивного изотопа ¹¹¹In или ⁹⁰Y, связанных посредством тиокарбамидного линкера-хелатора (Wiseman et al. (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). В 2000 году был одобрен МИЛОТАРГ (MYLOTARG™) (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из гуманизированного антитела к CD33, связанного с калихимицином, для лечения острого миелоидного лейкоза посредством инъекции (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патент США № 4970198; патент США № 5079233; патент США № 5585089; патент США № 5606040; патент США № 5693762; патент США № 5739116; патент США № 5767285; патент США № 5773001). Кантузумаб мертанзин (Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huC242, связанного посредством дисульфидного линкера SPP, связанного с майтаназоидным лекарственным веществом, DM1 (Xie et al. (2004) J. of Pharm. and Exp. Ther. 308(3):1073-1082; Tolcher et al. (2003) J. Clin. Oncology 21(2):211-222; патент США № 5208020), проходит I фазу испытаний для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих CanAg, таких как рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак желудка и другие. В процессе разработки находится MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), который представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела к специфичному для предстательной железы мембранному антигену, связанного с майтаназоидным лекарственным веществом, DM1, и который предполагают использовать для лечения опухолей предстательной железы. То же майтаназоидное лекарственное вещество, DM1, связывали с мышиным моноклональным антителом, TA.1, посредством не являющегося дисульфидным линкера, SMCC (Chari et al. (1992) Cancer Research 52:127-131). Сообщалось, что такой конъюгат в 200 раз менее эффективен, чем соответствующий конъюгат с дисульфидным линкером. Было сделано предположение, что линкер SMCC является «нерасщепляемым» (также см. патент США № 4981979). Был описан ГЕРЦЕПТИН® (HERCEPTIN®) (трастузумаб), связанный посредством SMCC с DM1 (WO 2005/037992).

С целью обнаружения эффективных клеточных мишеней для диагностики и лечения злокачественных опухолей исследователями были сделаны попытки идентифицировать трансмембранные или другим образом ассоциированные с опухолями полипептиды, которые специфически экспрессированы на поверхности одного или нескольких конкретных типов клеток злокачественных опухолей по сравнению с одной или несколькими здоровыми незлокачественными клетками. Как правило, такие ассоциированные с опухолями полипептиды экспрессируются в большом количестве на поверхности клеток злокачественной опухоли по сравнению с экспрессией на поверхности незлокачественных клеток. Идентификация таких антигенных полипептидов клеточной поверхности, ассоциированных с опухолью, то есть ассоциированных с опухолями антигенов (TAA), давала возможность специфического воздействия на клетки злокачественной опухоли для их разрушения посредством терапии антителами.

Терапия моноклональными антителами была разработана для направленного лечения больных раком, иммунологическими и ангиогенными заболеваниями. Примером успешной терапии антителами является терапия ГЕРЦЕПТИНом® (HERCEPTIN®) (трастузумаб), рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом, полученным из ДНК, который обладает высокоаффинной селективностью связывания в клеточном анализе (Kd=5нМ) с внеклеточным доменом белка рецептора 2 эпидермального фактора роста человека, HER2 (ErbB2) (патент США № 5821337; патент США № 6054297; патент США № 6407213; патент США № 6639055; Coussens L, et al. (1985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al. (1989) Science 244:707-12). Трастузумаб представляет собой антитело IgG1 каппа, содержащее каркасные области человека с участками, определяющими антитела мыши (4D5), связывающееся с HER2. Трастузумаб связывается с антигеном HER2 и, таким образом, ингибирует рост злокачественных клеток. Так как трастузумаб является гуманизированным антителом, то он предельно уменьшает любой ответ HAMA у пациентов. Гуманизированное антитело против HER2 получают в суспензионной культуре клеток млекопитающих (яичника китайского хомячка, CHO). Протоонкоген HER2 (или c-erbB2) кодирует трансмембранный рецепторный белок массой 185 кДа, сходный по структуре с рецептором эпидермального фактора роста. Сверхэкспрессия белка HER2 обнаруживается в 25%-30% случаев первичного рака молочной железы и ее можно определить, используя иммуногистохимические способы оценки фиксированных образцов опухолей (Press MF, et al. (1993) Cancer Res 53:4960-70). Как в анализах in vitro, так и моделях животных было показано, что трастузумаб ингибирует пролиферацию человеческих опухолевых клеток, у которых сверхэкспрессирован HER2 (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga J, et al. (1998) Cancer Res. 58:2825-2831). Трастузумаб представляет собой медиатор антителозависимой клеточной цитотоксичности, ADCC (Hotaling TE, et al. (1996) [реферат]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al. (1997) [реферат]. Proc. Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al. (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl. 12:60-70; Yarden Y. и Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137). ГЕРЦЕПТИН® клинически эффективен у пациентов со сверхэкспрессирующим ErbB2 метастазирующим раком молочной железы, которые продолжительно получали предварительное противоопухолевое лечение (Baselga et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744). Хотя открытие герцептина является прорывом в лечении больных со сверхэкспрессирующими ErbB2 формами рака молочной железы, которые получали продолжительное предварительное противоопухолевое лечение, у большинства пациентов этой группы лечение герцептином не эффективно или слабо эффективно. Таким образом, существует значительная клиническая необходимость в разработке дополнительных способов лечения злокачественных опухолей, направленных на HER2, у пациентов со сверхэкспрессирующими HER2 опухолями или другими заболеваниями, ассоциированными с экспрессией HER2, у которых лечение герцептином не эффективно или слабо эффективно. Кроме HER2, при направленных способах лечения существует возможность использовать другие ассоциированные с опухолями антигены.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым соединениям, обладающим биологической активностью против клеток злокачественных опухолей. Соединения могут ингибировать рост опухолей у млекопитающих и могут использоваться для лечения людей, больных раком.

Настоящее изобретение относится к доставке, транспорту в клетки, накоплению и задержке в клетках терапевтических соединений-конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Изобретение, в частности, относится к получению высоких концентраций молекул активных метаболитов в клетках злокачественных опухолей. Внутриклеточное нацеливание может быть достигнуто способами и соединениями, делающими возможным накопление и удержание биологически активных средств внутри клеток. Такое эффективное нацеливание может использоваться в целом ряде терапевтических композиций и процедур.

Было сделано неожиданное открытие, что конъюгаты антитело-лекарственное средство со стабильными линкерными группами, не являющимися дисульфидными, связывающими майтаназоидное лекарственное вещество с антителом, обуславливают увеличенную активность in vitro и эффективность in vivo. Кроме того, было показано, что конъюгаты антитело-лекарственное средство обладают неожиданным результатом, заключающимся в большей безопасности in vivo относительно известных конъюгатов с дисульфидными линкерами.

Соединения-конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) содержат антитело, ковалентно связанное линкером с одним или несколькими майтаназоидными лекарственными веществами. ADC можно представить в виде формулы I:

Ab-(L-D) p

I

где одно или несколько майтаназоидных лекарственных веществ (D) ковалентно связаны с помощью L антителом (Ab). Ab представляет собой антитело, связывающееся с рецептором ErbB или связывающееся с одним или несколькими ассоциированными с опухолями антигенами или рецепторами на клеточной поверхности. Линкер L может быть стабильным вне клетки, то есть внеклеточно. Линкер L, майтаназоидное лекарственное средство D или линкер и майтаназоидное лекарственное средство, взятые вместе (L-D), не содержат дисульфидной группы.

В одном из вариантов осуществления существенное количество лекарственного вещества не отщепляется от антитела до тех пор, пока конъюгат антитело-лекарственное средство не попадет в клетку через рецептор на клеточной поверхности, специфичный для данного антитела конъюгата антитело-лекарственное средство, и когда конъюгат антитело-лекарственное средство попадает в клетку, лекарственное вещество отщепляется от антитела.

В другом варианте осуществления ADC специфически связывается с рецептором, кодируемым геном ErbB, таким как EGFR, HER2, HER3 и HER4. ADC может специфически связываться с внеклеточным доменом рецептора HER2. ADC может ингибировать рост опухолевых клеток со сверхэкспрессией рецептора HER2.

В другом варианте осуществления, антитело (Ab) формулы I представляет собой гуманизированное антитело, такое как huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 или huMAb4D5-8 (трастузумаб).

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I или ее фармацевтически приемлемые соль или сольват и фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель или эксципиент.

Другой аспект относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I и второе соединение с противоопухолевыми свойствами или другими терапевтическими эффектами.

Еще один аспект относится к диагностическим и терапевтическим применениям соединений и композиций, описанных в данном документе.

Другой аспект относится к способу уничтожения или ингибирования пролиферации опухолевых клеток или клеток злокачественных опухолей, включающему обработку клеток таким количеством конъюгата антитело-лекарственное средство, или его фармацевтически приемлемых соли или сольвата, которое эффективно для уничтожения или ингибирования пролиферации опухолевых клеток или раковых клеток.

Другой аспект относится к способам лечения рака, включающим введение пациенту композиции соединения формулы I. Один из способов предназначен для лечения рака у млекопитающего, где рак отличается сверхэкспрессией рецептора ErbB. Лечение неконъюгированным антителом против ErbB у млекопитающего, необязательно, может быть не эффективно или слабо эффективно. Способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство.

Другой аспект относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток, сверхэкспрессирующих рецептор фактора роста, выбранный из группы, состоящей из рецептора HER2 и рецептора EGF, где способ включает введение пациенту соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство, специфически связывающегося с указанным рецептором фактора роста и химиотерапевтического средства, где указанный конъюгат антитело-лекарственное средство и указанное химиотерапевтическое средство вводят в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток у пациента.

Другой аспект относится к способу лечения человека, восприимчивого к заболеванию, отличительным признаком которого является сверхэкспрессия рецептора ErbB2, или у которого диагностировано такое заболевание, включающему введение сочетания соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство формулы I и химиотерапевтического средства.

Другой аспект относится к способу обнаружения раковых клеток, включающему воздействие на клетки соединением-конъюгатом антитело-лекарственное средство и определение степени связывания соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство с клетками.

Другой аспект относится к способам скрининга вероятных лекарственных средств ADC для лечения заболевания или нарушения, отличительным признаком заболевания или нарушения является сверхэкспрессия HER2.

Другой аспект относится к готовым изделиям, то есть наборам, содержащим конъюгат антитело-лекарственное средство, контейнер и листовку-вкладыш или этикетку с информацией о лечении.

Другой аспект относится к способам лечения заболевания или нарушения, отличительным признаком которого является сверхэкспрессия HER2, у пациента соединениями-конъюгатами антитело-лекарственное средство.

Другой аспект относится к способам получения, способам изготовления, способам синтеза, способам конъюгации и способам очистки соединений-конъюгатов антитело-лекарственное средство и промежуточных соединений для изготовления, синтеза и конъюгации соединений-конъюгатов антитело-лекарственное средство.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показан анализ пролиферации клеток in vitro на клетках SK-BR-3, обработанных конъюгатами антитело-лекарственное средство: - □-трастузумаб-SPP-DM1, -Δ-трастузумаб-SPDP-DM1 и -o-трастузумаб-SMCC-DM1.

На фиг.2 показан анализ пролиферации клеток in vitro на клетках BT-474, обработанных конъюгатами антитело-лекарственное средство: -□-трастузумаб-SPP-DM1, -Δ-трастузумаб-SPDP-DM1 и -o-трастузумаб-SMCC-DM1.

На фиг.3 показан анализ пролиферации клеток in vitro на клетках MCF7, обработанных конъюгатами антитело-лекарственное средство: -□-трастузумаб-SPP-DM1, -Δ-трастузумаб-SPDP-DM1 и -o-трастузумаб-SMCC-DM1.

На фиг.4 показан анализ пролиферации клеток in vitro на клетках MDA-MB-468, обработанных конъюгатами антитело-лекарственное средство: -□-трастузумаб-SPP-DM1, -Δ-трастузумаб-SPDP-DM1 и -o-трастузумаб-SMCC-DM1.

На фиг.5 показан сывороточный клиренс трастузумаба-SMCC-DM1 по сравнению с трастузумабом-SPP-DM1 у «голых» мышей с врожденным отсутствием NK-клеток, путем измерения сывороточной концентрации конъюгата и общей сывороточной концентрации антител в шести временных точках (5 минут, 1 час, 6 часов, 24 часа, 72, 168 часов после введения дозы) в течение 7 суток.

На фиг.6 показана стабильность конъюгатов: трастузумаб-SPDP-DM1, трастузумаб-SPP-DM1, трастузумаб-SPP-DM3, трастузумаб-SPP-DM4 и трастузумаб-SMCC-DM1, в динамике по времени у «голых» мышей без опухолей путем измерения сывороточной концентрации в шести временных точках (5 минут, 1 час, 6 часов, 24 часа, 72, 168 часов после введения дозы) в течение 7 суток.

На фиг.7 показаны размеры сывороточных концентраций общего трастузумаба/трастузумаба-SMCC-DM1 и общего трастузумаба/трастузумаба-SPP-DM1 у мышей с опухолями и без через 7 суток после введения.

На фиг.8 представлен анализ клиренса плазматической концентрации после введения 10 мг/кг трастузумаба-SPP-DM1 4 особям крыс. Измеряли общую концентрацию антител и концентрацию трастузумаба-SPP-DM1 (tr=трастузумаб).

На фиг.9 представлен анализ клиренса плазматической концентрации после введения 10 мг/кг трастузумаба-SMCC-DM1 4 особям крыс. Измеряли общую концентрацию антител и концентрацию трастузумаба-SMCC-DM1.

На фиг.10 показано среднее изменение размера опухоли в динамике по времени у мышей при введении дозы: носителя (PBS, pH 6,5), трастузумаба-SPP-DM1 (370 мкг DM1/м²) и трастузумаба-SMCC-DM1 (330 мкг DM1/м²), где доза является дозой вводимого DM1.

На фиг.11 показано среднее изменение размера опухоли в динамике по времени у бестимусных «голых» мышей с аллотрансплантатами опухоли Fo5 при введении на 0 день дозы: носителя (PBS, pH 6,5), 10 мг/кг трастузумаба-SIAB-DM1 (3,4 DM1/Ab; 168 мкг DM1/кг) и 10 мг/кг трастузумаба-SMCC-DM1 (3,2 DM1/Ab; 158 мкг DM1/кг), где дозой является доза вводимого конъюгата антитело-лекарственное средство.

На фиг.12 показано среднее изменение размера опухоли в динамике по времени у «голых» мышей с врожденным отсутствием NK-клеток MMTV-Her2 Fo 5 (по семь в каждой группе, все с опухолями, Ti=7) при однократной инъекции носителя (PBS, pH 6,5), 10 мг/кг трастузумаба-SPP-DM1, 10 мг/кг трастузумаба-SPP-DM4, 10 мг/кг трастузумаба-SPP-DM3 и 10 мг/кг трастузумаба-SMCC-DM1.

На фиг.13 показано время до удвоения объема опухоли и log-анализ клеточной гибели для носителя (PBS, pH 6,5), трастузумаба-SPP-DM1, трастузумаба-SPP-DM4, трастузумаба-SPP-DM3 и трастузумаба-SMCC-DM1 в опухолях HER2-Fo5.

На фиг.14 показано изменение массы тела крыс в динамике по времени при введении дозы: носителя (10 мМ сукцинат натрия, 100 мг/мл сахароза, 0,1% Tween 20, pH 5,0), трастузумаба-SPP-DM1 (1860 мкг DM1/м²), трастузумаба-SMCC-DM1 (1860 мкг DM1/м²), трастузумаба-SMCC-DM1 (3260 мкг DM1/м²) и свободного DM1 (650 мкг/м²).

На фиг.15 показан функциональный анализ печени в единицах AST на литр в динамике по времени на модели крысы при введении дозы: носителя (10 мМ сукцинат натрия, 100 мг/мл сахароза, 0,1% Tween 20, pH 5,0), трастузумаба-SPP-DM1 (22,3 мг/кг), трастузумаба-SMCC-DM1 (10 мг/кг), трастузумаба-SMCC-DM1 (25 мг/кг), трастузумаба-SMCC-DM1 (50 мг/кг) и свободного DM1.

На фиг.16 показаны показатели безопасности в единицах PLT в клетках на литр в динамике по времени на модели крысы с введением дозы: носителя (10 мМ сукцинат натрия, 100 мг/мл сахароза, 0,1% Tween 20, pH 5,0), трастузумаба-SPP-DM1 (22,3 мг/кг), трастузумаба-SMCC-DM1 (10 мг/кг), трастузумаба-SMCC-DM1 (25 мг/кг), трастузумаба-SMCC-DM1 (50 мг/кг) и свободного DM1.

На фиг.17 показан анализ пролиферации клеток in vitro на клетках HT1080EphB2 (C8), обработанных конъюгатами антитело-лекарственное средство: -▲- antiEphB2R 2H9-SPP-DM1 и -▼- antiEphB2R 2H9-SMCC-DM1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Теперь будет сделано подробное указание на конкретные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы сопровождающимися структурами и формулами. Хотя изобретение будет описано в отношении перечисленных вариантов осуществления, понятно, что эти варианты осуществления не ограничивают настоящее изобретение. Напротив, изобретение включает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые можно включить в объем настоящего изобретения, определенный формулой изобретения.

Специалисту в данной области известно множество способов и веществ, сходных или эквивалентных описанным в настоящем документе способам и веществам, которые можно использовать в практике настоящего изобретения. Настоящее изобретение абсолютно не ограничено описанными способами и веществами.

Если не определено иначе, технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, известные специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение, и согласуются с Singleton et al., (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY и Janeway, C., Travers, P., Wal.port, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иначе, следующие термины и фразы, используемые в данном документе, имеют следующие значения:

Если в данном документе используют товарные знаки, то заявители независимо охватывают композицию товарного знака, основное лекарственное средство и активный фармацевтический(-ие) ингредиент(ы) продукта товарного знака.

Термин «антитело» в данном документе используют в широком смысле, и, конкретно, он охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, полиспецифичные антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желательную биологическую активность (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов. Антитело представляет собой белок, вырабатываемый иммунной системой, способный распознать и связывать специфический антиген (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Как правило, мишеневый антиген несет множество сайтов связывания, также называемых эпитопами, распознаваемых CDR различных антител. Каждое антитело, специфически связывающееся с различным эпитопом, отличается своей структурой. Таким образом, у одного антигена может быть более одного соответствующего антитела. Антитело включает полноразмерную молекулу иммуноглобулина или иммунологически активную часть полноразмерной молекулы иммуноглобулина, то есть молекулу, которая содержит антигенсвязывающий сайт, иммуноспецифически связывающийся с мишеневым антигеном или его частью, где такие мишени включают в качестве неограничивающих примеров раковые клетки или клетки, продуцирующие аутоиммунные антитела, ассоциированные с аутоиммунным заболеванием. Описанный в данном документе иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулинов. Иммуноглобулины можно получать из любых видов. Однако в одном из аспектов иммуноглобулины являются человеческого, мышиного или кроличьего происхождения.

«Фрагменты антител» содержат часть полноразмерного антитела, как правило, его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, и Fv; димерные антитела; линейные антитела; фрагменты, получаемые с помощью экспрессионной библиотеки Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела, CDR (определяющая комплементарность область) и фрагменты, связывающие эпитопы, любого из указанного выше, которые специфически связываются с антигенами раковых клеток, вирусными антигенами или антигенами микроорганизмов, молекулы одноцепочечных антител; полиспецифические антитела, образуемые из фрагментов антител.

Как используется в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, то есть к отдельным антителам, составляющим популяцию, которые идентичны, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены к одному антигенному сайту. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, включающих в себя различные антитела, направленные к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело направлено к одной детерминанте антигена. Кроме их специфичности, преимуществом моноклональных антител является возможность их синтеза без загрязнения другими антителами. Определение «моноклональное» означает свойство антитела как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител и не предназначено как указание на конкретный способ получения антитела. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить способом гибридом, впервые описанном Kohler et al. (1975) Nature 256:495, или их можно получить способами рекомбинантных ДНК (см., патент США № 4816567). Моноклональные антитела также можно выделять из фаговых библиотек антител, используя способы, описанные, например, Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597.

В частности, моноклональные антитела в данном документе включают «химерные» антитела, у которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как остаток цепи(-ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они обладают желаемой биологической активностью (патент США № 4816567; и Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). В данном документе интересующие химерные антитела включают «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученного из примата, не являющегося человеком (например, старосветская мартышка или человекообразная обезьяна), и последовательности константной области человека.

В данном документе «интактное антитело» представляет собой антитело, содержащее домены VL и VH, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелых цепей, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут быть константными доменами с природной последовательностью (например, константные домены человека с природной последовательностью) или вариантами их аминокислотной последовательности. Интактное антитело может обладать одной или несколькими «эффекторными функциями», которые относятся к видам биологической активности, присущей Fc-области (Fc-область с природной последовательностью или вариант аминокислотной последовательности Fc-области) антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз и отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности, таких как рецептор B-клеток и BCR.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена своих тяжелых цепей интактные антитела можно отнести к различным «классам». Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно разделить на «подклассы» (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, обозначают α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структура субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Рецептор ErbB» представляет собой рецепторный белок тирозинкиназу, принадлежащий семейству рецепторов ErbB, являющихся важными медиаторами клеточного роста, дифференцировки и выживаемости. Семейство рецепторов ErbB включает четыре отличных друг от друга представителя, включая рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 или p185^neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2). Группа антител против ErbB2 охарактеризована с помощью линии опухолевых клеток рака молочной железы человека SKBR3 (Hudziak et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172). Максимальное ингибирование наблюдали у антитела, обозначенного как 4D5, которое ингибировало 56% клеточной пролиферации. Другие антитела в группе снижали клеточную пролиферацию в этом анализе в меньшей степени. Кроме того, было обнаружено, что антитело 4D5 повышает чувствительность линии опухолевых клеток рака молочной железы, сверхэкспрессирующих ErbB2, к цитотоксическим эффектам TNF-α (патент США № 5677171). Антитела против ErbB2, описанные Hudziak et al., дополнительно охарактеризованы Fendly et al. (1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. (1991) J. Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465; и Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394.

Другие антитела против ErbB2 с различными свойствами описаны Franklin et al. (2004) Cancer Cell 5:317-328; Tagliabue et al. (1991) Int. J. Cancer 47:933-937; McKenzie et al. (1989) Oncogene 4:543-548; Maier et al. (1991) Cancer Res. 51:5361-5369; Bacus et al. (1990) Molecular Carcinogenesis 3:350-362; Stancovski et al. (1991) PNAS (USA) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cancer Research 52:2580-2589; Xu et al. (1993) Int. J. Cancer 53:401-408; WO 94/00136; Kasprzyk et al. (1992) Cancer Research 52:2771-2776; Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Shawver et al. (1994) Cancer Res. 54:1367-1373; Arteaga et al. (1994) Cancer Res. 54:3758-3765; Harwerth et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15160-15167; патент США № 5783186; и Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109.

Скрининг идентичности последовательностей привел к идентификации двух других представителей семейства рецепторов ErbB; ErbB3 (патент США № 5183884; патент США № 5480968; Kraus et al. (1989) PNAS (USA) 86:9193-9197) и ErbB4 (EP 599274; Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750; и Plowman et al. (1993) Nature 366:473-475). Оба этих рецептора проявляли повышенную экспрессию по меньшей мере в некоторых линиях опухолевых клеток рака молочной железы.

Как правило, рецептор ErbB содержит внеклеточный домен, который может связываться с лигандом ErbB; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен и C-концевой сигнальный домен, несущий несколько тирозиновых остатков, которые могут быть фосфорилированы. Рецептор ErbB может представлять собой рецептор ErbB с «природной последовательностью» или его «вариант аминокислотной последовательности». Рецептор ErbB может представлять собой природную последовательность рецептора ErbB человека. Таким образом, «представителем семейства рецепторов ErbB» является EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 или любой другой рецептор ErbB, известный в настоящее время или который будет идентифицирован в будущем.

Термины «ErbB1», «рецептор эпидермального фактора роста», «EGFR» и «HER1» в данном документе применяются взаимозаменяемо и относятся к EGFR, как описано, например, у Carpenter et al. (1987) Ann. Rev. BioChem. 56:881-914, включая природные мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, как у Humphrey et al., (1990) PNAS (USA), 87:4207-4211). Термин erbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт EGFR. Антитела против HER1 описаны, например, Murthy et al. (1987) Arch. BioChem. Biophys., 252:549-560 и в WO 95/25167.

Термин «ERRP», «белок рецептора EGF», «EGFR белок» и «белок рецептора эпидермального фактора роста белок» в данном документе используются взаимозаменяемо и относятся к ERRP, как описано, например, в патенте США № 6399743 и патенте США № 2003/0096373.

Выражения «ErbB2» и «HER2» в данном документе используются взаимозаменяемо и относятся к белку HER2 человека, описанному, например, Semba et al. (1985) PNAS (USA), 82:6497-6501 и Yamamoto et al. (1986) Nature, 319:230-234 (инвентарный номер Genbank X03363). Термин «erbB2» относится к гену, кодирующему ErbB2 человека, а «neu» относится к гену, кодирующему p185neu крысы.

«ErbB3» и «HER3» относятся к рецепторному полипептиду, описанному, например, в патенте США № 5183884; патенте США № 5480968; Kraus et al. (1989) PNAS (USA) 86:9193-9197. Антитела против ErbB3 известны в данной области (патент США № 5183884; патент США № 5480968; WO 97/35885).

Термины «ErbB4» и «HER4» в данном документе относятся к рецепторному полипептиду, описанному, например, в Европейской патентной заявке № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) и Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), включая их изоформы, например, описанные в WO 99/19488. Антитела против HER4 описаны, например, в WO 02/18444.

Антитела против рецепторов ErbB коммерчески доступны из ряда источников, в том числе, например, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.

Под «лигандом ErbB» понимают белок, который связывается и/или активирует рецептор ErbB. Лиганд ErbB может представлять собой природную последовательность лиганда ErbB человека, такого как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage et al. (1972) J. Biol. Chem., 247:7612-7621); трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) (Marquardt et al. (1984) Science 223:1079-1082); амфирегулин, также известный как аутокринный фактор роста шванном или кератиноцитов (Shoyab et al. (1989) Science 243:1074-1076; Kimura et al. (1990) Nature 348:257-260; и Cook et al. (1991) Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557); бетацеллюлин (Shing et al. (1993) Science 259:1604-1607 и Sasada et al. (1993) BioChem. Biophys. Res. Commun. 190:1173); гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama et al. (1991) Science 251:936-939); эпирегулин (Toyoda et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7495-7500 и Komurasaki et al. (1997) Oncogene 15:2841-2848); херегулин (смотри ниже); нейрегулин-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); нейрегулин-3 (NRG-3) (Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567); нейрегулин-4 (NRG-4) (Harari et al. (1999) Oncogene, 18:2681-89) или крипто (CR-1) (Kannan et al. (1997) J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335). Лиганды ErbB, связывающие EGFR, включают EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллюлин, HB-EGF и эпирегулин. Лиганды ErbB, связывающие ErbB3, включают херегулины. Лиганды ErbB, способные связывать ErbB4, включают бетацеллюлин, эпирегулин, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и херегулины. Лиганд ErbB также может быть синтетическим лигандом ErbB. Синтетический лиганд может быть специфичным к конкретному рецептору ErbB или может распознавать конкретные рецепторные комплексы ErbB. Пример синтетического лиганда представляет собой синтетический химерный бирегулин херегулин/EGF (см., например, Jones et al. (1999) FEBS Letters, 447:227-231, приведенный в данном документе в качестве ссылки).

«Херегулин» (HRG) относится к полипептидному продукту, кодируемому геном херегулина, как описано в патенте США № 5641869 или Marchionni et al. (1993) Nature 362:312-318. Примеры херегулинов включают херегулин-α, херегулин-β1, херегулин-β2 и херегулин-β3 (Holmes et al. (1992) Science 256:1205-1210 и патент США № 5641869); фактор дифференцировки neu (NDF) (Peles et al. (1992) Cell 69: 205-216); индуктор активности ацетилхолинового рецептора (ARIA) (Falls et al. (1993) Cell 72:801-815); глиальные факторы роста (GGF) (Marchionni et al. (1993) Nature, 362:312-318); фактор, полученный из чувствительных и двигательных нейронов (SMDF) (Ho et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:14523-14532); γ-херегулин (Schaefer et al. (1997) Oncogene, 15:1385-1394). Термин включает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотной последовательности природной последовательности полипептида HRG, такие как фрагмент их EGF-подобный домена (например, HRGβ1177-244).

«Гетероолигомер ErbB» представляет собой нековалентно связанный олигомер, содержащий по меньшей мере два различных рецептора ErbB. «Димер ErbB» представляет собой нековалентно связанный олигомер, содержащий два различных рецептора ErbB. Такие комплексы могут образовываться при воздействии на клетку, экспрессирующую два или более рецепторов ErbB, лиганда ErbB. Олигомеры ErbB, такие как димеры ErbB, можно выделять с помощью иммунопреципитации и анализировать с помощью SDS-PAGE, например, как описано у Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665. Примеры таких гетероолигомеров ErbB включают комплексы EGFR-ErbB2 (также называемый HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) и ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4). Кроме того, гетероолигомер ErbB