Способ лечения рака, устойчивого к гефитинибу

Способ лечения рака, устойчивого к гефитинибу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники настоящего изобретения

Эпителиальноклеточные раки, например рак простаты, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак селезенки, рак яичек, рак тимуса и т.п., являются заболеваниями, характеризующимися аномальным, ускоренным ростом эпителиальных клеток. Такой ускоренный рост является первичной причиной образования опухоли. Впоследствии также может происходить метастазирование в участки других органов. Несмотря на то, что в диагностике и лечении разных раковых заболеваний произошел очевидный прогресс, указанные заболевания по-прежнему характеризуются высокой смертностью.

Рак легких лидирует среди причин смерти от рака в промышленно развитых странах. Раковые заболевания, начинающиеся в легких, подразделяют на два основных типа, немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких, в зависимости от того, как клетки выглядят под микроскопом. Немелкоклеточный рак легких (плоскоклеточный рак, аденокарцинома и крупноклеточный рак), как правило, распространяется на другие органы медленнее, чем мелкоклеточный рак легких. Приблизительно 75% случаев рака легких относятся к немелкоклеточному раку легких (например, к аденокарциномам), а остальные 25% относятся к мелкоклеточному раку легких. Немелкоклеточный рак легких (NSCLC) является основной причиной смертности от рака в Соединенных Штатах, Японии и Западной Европе. В случае запущенного заболевания химиотерапия позволяет несколько повысить выживание пациентов, однако она обладает высокой токсичностью, и поэтому существует настоятельная потребность в разработке терапевтических средств, специфично направленных на ключевые генетические нарушения, обуславливающие опухолевый рост (Schiller JH et al., N Engl J Med, 346: 92-98, 2002).

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) представляет собой мембраносвязанный белок массой 170 килодальтон (кДа), экспрессирующийся на поверхности эпителиальных клеток. EGFR является членом рецепторного семейства тирозинкиназ, молекул, регулирующих клеточный цикл. (W.J.Gullick et al., 1986, Cancer Res., 46:285-292). EGFR активируется при связывании лиганда (либо EGF, либо TGF-α) с внеклеточным доменом, которое приводит к аутофосфорилированию внутриклеточного тирозинкиназного домена рецептора (S. Cohen et al., 1980, J. Biol. Chem., 255:4834-4842; A.B. Schreiber et al., 1983, J. Biol. Chem., 258:846-853).

EGFR является белковым продуктом онкогена, стимулирующего рост, erbB или ErbBl, который, кроме одного члена семейства, а именно, семейства протоонкогенов ERBB, предположительно играет важную роль в возникновении и развитии многих раковых заболеваний человека. В частности, повышенная экспрессия EGFR наблюдается при раке молочной железы, мочевого пузыря, легких, головы, шеи и желудка, а также при глиобластомах. Семейство онкогенов ERBB кодирует четыре структурно-родственных трансмембранных рецептора, а именно EGFR, HER-2/neu (erbB2), HER-3 (erbB3) и HER-4 (erbB4). С клинической точки зрения, амплификация онкогена и/или сверхэкспрессия рецептора ERBB в опухолях коррелирует с рецидивом заболевания и плохим прогнозом для пациента, а также с чувствительностью к терапии. (L. Harris et al, 1999, Int. J. Biol. Markers, 14:8-15; and J. Mendelsohn and J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565).

EGFR состоит из трех основных доменов, а именно внеклеточного домена (ECD), который находится в гликозилированном состоянии и содержит лиганд-связывающий карман с двумя обогащенными цистеином участками; короткий трансмембранный домен, и внутриклеточный домен, обладающий собственной тирозинкиназной активностью. Трансмембранный участок соединяет лиганд-связывающий домен с внутриклеточным доменом. Анализ аминокислотной и нуклеотидной последовательностей, а также исследования негликозилированных форм EGFR позволили установить, что EGFR имеет массу 132 кДа и содержит 1186 аминокислотных остатков (A.L.Ullrich et al., 1984, Nature, 307:418-425; J. Downward et al., 1984, Nature, 307:521-527; C. R. Carlin et al., 1986, MoI. Cell. Biol., 6:257-264; and F. L. V. Mayes and M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537).

Связывание EGF или TGF-α с EGFR активирует путь передачи сигнала и вызывает пролиферацию клеток. Димеризация, конформационные изменения и интернализация молекул EGFR инициирует внутриклеточные сигналы, регулирующие клеточный рост (G. Carpenter and S. Cohen, 1979, Ann. Rev. Biochem., 48:193-216). Генетические изменения, которые оказывают влияние на регуляцию функции рецептора факторов роста или приводят к сверхэкспрессии рецептора и/или лиганда, вызывают пролиферацию клеток. Кроме того, установлено, что EGFR участвует в дифференциации клеток, увеличении подвижности клеток, секреции белков, реваскуляризации, инвазии, метастазировании и формировании устойчивости раковых клеток к химиотерапевтическим средствам и облучению. (M.-J. Oh et al., 2000, Clin. Cancer Res., 6:4760- 4763).

Идентифицирован ряд ингибиторов EGFR, включающих в себя ингибиторы, уже прошедшие клинические испытания на применение для лечения разных раковых заболеваний. Один из последних обзоров опубликован de Bono, J. S. and Rowinsky, E.K. (2002), "The ErbB Receptor Family: A Therapeutic Target For Cancer", Trends in Molecular Medicine, 8, S 19-26.

Перспективный ряд мишеней для терапевтического вмешательства при лечении рака включает в себя членов линии HER-киназы. Повышающая регуляция данных киназ часто наблюдается в солидных эпителиальных опухолях таких органов, как, например, простата, легкие и молочная железа, а также в глиобластомных опухолях. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) является членом линии HER-киназы и представляет собой предпочтительную мишень для разработки нескольких способов лечения разных раковых заболеваний. В число данных способов лечения входит применение ингибиторов тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKI), поскольку обратимое фосфорилирование остатков тирозина необходимо для активации пути EGFR. Другими словами, EGFR-TKI блокирует клеточный поверхностный рецептор, отвечающий за инициацию и/или поддержание клеточного сигнального пути, который индуцирует рост и деление опухолевых клеток. А именно, полагают, что данные ингибиторы, называемые HER-I, препятствуют функционированию киназного домена EGFR. К наиболее перспективным EGFR-TKI относятся три ряда соединений: хиназолины, пиридопиримидины и пирролопиримидины.

Два из наиболее разработанных в клиническом отношении соединений включают в себя гефитиниб (соединение ZD 1839, разработанное AstraZeneca UK Ltd.; доступное под торговым наименованием IRESSA; далее называемое "IRESSA") и эрлотиниб (соединение OSI-774, разработанное Genentech, Inc. и OSI Pharmaceuticals, Inc.; доступное под торговым наименованием TARCEVA; далее называемое "TARCEVA"); указанные соединения дают обнадеживающие клинические результаты. Традиционный способ лечения рака с использованием как IRESSA, так и TARCEVA, включает ежедневное пероральное введение не более чем 500 мг соответствующих соединений. В мае 2003 первым из указанных продуктов на рынок Соединенных Штатов поступил IRESSA после утверждения его для лечения пациентов с запущенным немелкоклеточным раком легких.

IRESSA представляет собой хиназолин, активный после перорального введения, который функционирует путем непосредственного ингибирования фосфорилирования тирозинкиназы в молекуле EGFR. Он конкурирует за участок связывания аденозинтрифосфата (АТФ), подавляя линию HER-киназы. Точный механизм действия IRESSA полностью не известен, однако проведенные исследования позволяют предположить, что для его реализации необходимо присутствие EGFR.

Существенным ограничением при применении данных соединений является то, что у получающих их пациентов после первичного ответа на терапию может развиваться устойчивость к указанным соединениям, или такие пациенты могут совсем не отвечать на EGFR-TKI в какой-либо заметной степени. Процент отвечающих на EGFR-TKI варьирует среди разных этнических групп. На нижней границе отвечающих на EGFR-TKI находятся популяции, в которых только 10-15% пациентов с запущенным немелкоклеточным раком легких отвечают на ингибиторы киназы EGFR. Таким образом, более глубокое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе чувствительности к IRESSA и TARCEVA, является крайне важным при применении терапии к субъектам, у которых данная терапия с наибольшей вероятностью вызывает благоприятный эффект.

В данной области существует настоятельная потребность в удовлетворительном способе лечения рака, в особенности эпителиальноклеточного рака, такого как рак легких, яичников, молочной железы, мозга, толстой кишки и простаты, который включает в себя благоприятный эффект терапии TKI и преодоление устойчивости к данной терапии. Такое лечение может оказывать существенное воздействие на здоровье субъектов, особенно субъектов старшего возраста, среди которых рак встречается особенно часто.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что с помощью необратимых ингибиторов EGFR можно эффективно лечить рак у субъектов, которые больше не отвечают на лечение с использованием гефитиниба и/или эрлотиниба. Так, в одном воплощении настоящее изобретение предлагает способ лечения ракового заболевания, устойчивого к гефитинибу и/или эрлотинибу. В данном воплощении у субъекта после лечения гефитинибом и/или эрлотинибом регистрируют прогрессирование рака. Прогрессирование рака свидетельствует об устойчивости данного заболевания к лечению гефитинибом и/или эрлотинибом, и тогда субъекту вводят фармацевтическую композицию, содержащую необратимый ингибитор рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).

В предпочтительных воплощениях в качестве необратимого ингибитора EGFR используют EKB-569, HKI-272 или HKI-357. Альтернативно необратимый ингибитор EGFR может представлять собой любое соединение, которое связывается с остатком цистеина в положении 773 молекулы EGFR (SEQ ID NO: 1).

Прогрессирование рака можно отслеживать с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, прогрессирование рака можно отслеживать путем визуального наблюдения с использованием рентгеновского излучения, срезов КТ или ЯМР-томографии. Альтернативно, прогрессирование можно отслеживать путем детекции опухолевых биомаркеров.

В одном воплощении состояние пациента регистрируют в разные моменты времени на протяжении всего лечения рака. Например, прогрессирование рака можно отслеживать путем анализа развития рака во второй момент времени и сравнения полученных результатов с результатами анализа, проведенного в первый момент времени. Первый момент времени может находиться до или после начала лечения гефитинибом и/или эрлотинибом, а второй момент времени наступает после первого. Повышенный рост раковой опухоли указывает на прогрессирование рака.

В одном воплощении прогрессирование рака отслеживают путем анализа размера раковой опухоли. В одном воплощении размер раковой опухоли анализируют путем визуального наблюдения с использованием рентгеновского излучения, срезов КТ или ЯМР-томографии. В одном воплощении размер раковой опухоли определяют путем детекции опухолевого биомаркера.

В одном воплощении раковое заболевание представляет собой эпителиальноклеточный рак. В одном воплощении раковое заболевание представляет собой рак желудочно-кишечного тракта, рак простаты, рак яичников, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак пищевода, рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак нервной системы, рак почек, рак сетчатки, рак кожи, рак печени, рак поджелудочной железы, рак мочеполовой системы и рак мочевого пузыря.

В одном воплощении размер раковой опухоли определяют в другие моменты времени, которые находятся после второго момента времени.

В одном воплощении более поздний момент времени находится, по меньшей мере, на 2 месяца позже предшествующего момента времени. В одном воплощении более поздний момент времени находится, по меньшей мере, на 6 месяцев позже предшествующего момента времени. В одном воплощении более поздний момент времени находится, по меньшей мере, на 10 месяцев позже предшествующего момента времени. В одном воплощении более поздний момент времени находится, по меньшей мере, на год позже предшествующего момента времени.

В другом воплощении настоящее изобретение предлагает способ лечения рака, включающий в себя введение субъекту, несущему мутацию последовательности EGFR, а именно замену метионина на треонин в положении 790 (Т790М) SEQ ID. No. 1, фармацевтической композиции, содержащей необратимый ингибитор EGFR. Мутация Т790М придает устойчивость к лечению гефитинибом и/или эрлотинибом.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А-1В показаны результаты анализа последовательности EGFR из участков рецидивирующих метастатических опухолей двух пациентов NSCLC с приобретенной устойчивостью к гефитинибу. На фиг.1А показаны результаты анализа последовательности для случая 1. Мутация Т790М присутствует в EGFR при рецидивирующей опухоли печени после развития клинической устойчивости к гефитинибу. (Слева) Мутация не детектируется во время диагноза первичной опухоли печени.

(Справа) Как при первичной опухоли легкого, так и при рецидивирующей опухоли печени детектируют мутацию L858R, придающую чувствительность к гефитинибу. Следует отметить, что мутация L858R присутствует на уровне, характерном для гетерозиготной мутации как при первичном, так и при рецидивирующем заболевании, тогда как Т7 90М детектируется на низком уровне, сравнимом с аллелью дикого типа. Полиморфизм (G/A) показан в той же локализации, чтобы продемонстрировать эквивалентное представление двух аллелей в неклонированном продукте ПЦР (SEQ ID NO 3 и 4, раскрытые соответственно в порядке приведения). На фиг.1В показаны результаты анализа последовательности для случая 2. Мутация Т790М присутствует в небольшом количестве клеток, устойчивых к гефитинибу. (Слева) В данном случае мутация Т790М не детектируется путем секвенирования неклонированных продуктов ПЦР ни в первичной опухоли легкого, ни в восьми рецидивирующих опухолях печени. Гетерозиготность по смежному полиморфизму (G/A) подтверждает амплификацию обоих аллелей EGFR из данных видов. Гетерозиготная мутация L861Q, обеспечивающая чувствительность к гефитинибу, детектируется на ожидаемом уровне в первичной опухоли легкого, а также в каждой из восьми рецидивирующих опухолей печени (SEQ ID NO 3 и 5, раскрытые соответственно в порядке приведения).

На фиг.2А-2С демонстрируется приобретенная устойчивость к гефитинибу в линиях клеток бронхоальвеолярного рака и стойкая чувствительность к необратимым ингибиторам семейства ERBB. На фиг.2А показано ингибирующее действие ингибиторов тирозинкиназы на пролиферацию клеточных линий бронхоальвеолярного рака, содержащих EGFR дикого типа (NCI-Hl 666), EGFR, несущий мутацию delE746-A750 (NCI-Hl 650), или два типичных гефитиниб-устойчивых субклона NCI-Hl 650 (G7 и Cl 1). Действие обратимого ингибитора гефитиниба сравнивают с действием необратимого ингибитора HKI-357. Сравнимые результаты наблюдаются в случае других необратимых ингибиторов. Число клеток определяют путем окрашивания кристаллическим фиолетовым после культивирования в 5% FCS, содержащей 100 нг/мл EGFR, в течение 7 2 ч после воздействия определенных концентраций лекарственного средства. Каждая точка соответствует среднему значению, полученному от четырех образцов. На фиг.2В приведены химические структуры гефитиниба, обратимого ингибитора EGFR; ЕКВ-569, необратимого ингибитора EGFR; и HKI-272 и HKI-357, необратимых ингибиторов EGFR и ERBB2 двойного действия. На фиг.2С показано образование устойчивых к лекарственному средству клеток NCI-HI 650 после обработки разными концентрациями гефитиниба или необратимого ингибитора ERBB EKB-569. Колонии окрашивают после 12 дней культивирования в присутствии ингибиторов.

На фиг.3A-3D показана постоянная зависимость от сигнального пути EGFR и ERBB2 в гефитиниб-устойчивых клетках, а также изменение направленной миграции рецептора. На фиг.3A показана жизнеспособность клеток после siРНК-опосредованного нокдауна генов EGFR и ERBB2 в бронхоальвеолярных клеточных линиях, содержащих EGFR дикого типа (NCI-Hl 666), по сравнению с клетками, несущими активирующую мутацию delE746-A750 в последовательности EGFR (NCI-Hl 650) и двумя гефитиниб-устойчивыми производными линиями (G7 и Cl 1). Жизнеспособные клетки считают через 72 часа после обработки двухцепочечной РНК и показывают в виде фракции, относящейся к клеткам, обработанным неспецифической siРНК, стандартное отклонение рассчитывают, используя тройные повторы образцов. На фиг.3B показано ингибирование аутофосфорилирования EGFR (Y1 068) и фосфорилирования нижестоящих эффекторов AKT и MAPK (ERK) в клетках, обработанных увеличивающимися концентрациями гефитиниба или необратимого ингибитора HKI-357, с последующим 2-ч воздействием EGF. Исходную клеточную линию NCI-Hl 650 сравнивают с типичной гефитиниб-устойчивой линией, G7. Суммарные AKT и MAPK используют в качестве контроля; тубулин используют в качестве нагружающего контроля при определении общего уровня EGFR, который в данных клетках находится на нижнем пределе детекции. На фиг.3C показано изменение интернализации EGFR в гефитиниб-устойчивых клетках NCI-H 1650 (G7), по сравнению с исходной чувствительной клеточной линией NCI-Hl 650. EGF с присоединенным родамином используют для мечения EGFR через 5 и 20 мин после добавления лиганда. Увеличение интернализации EGFR в клетках NCI-Hl 650 (G7) наиболее отчетливо наблюдается через 20 мин (микроскоп Цейса (Zeiss), увеличение ×63). На фиг.3D показаны результаты иммуноблоттинга интернализованного EGFR из исходных клеток NCI-Hl 650 и устойчивой производной линии G7 после импульсного мечения белков клеточной поверхности путем биотинилирования с мониторингом через 20 мин. Повышенный уровень внутриклеточного EGFR в клетках NCI-Hl 650 (G7) сравнивают с неизмененной интернализацией рецептора трансферрина (TR).

Фиг.4A-4B демонстрируют, что необратимые ингибиторы ERBB подавляют образование мутации T790M в EGFR. На фиг.4A приведены результаты сравнения способности гефитиниба и двух необратимых ингибиторов, HKI-357 и HKI-272, подавлять аутофосфорилирование EGFR (Yl 068) и фосфорилирование нижестоящих эффекторов AKT и MAPK (ERK) в бронхоальвеолярной клеточной линии NCI-Hl 975, несущей как мутацию, придающую чувствительность (L858R), так и мутацию, связанную с устойчивостью (T790M). Суммарные EGFR, AKT и MAPK показаны как нагружающие контроли. На фиг.4B показано подавление пролиферации в клетках NCI-Hl 975, несущих мутации L858R и T790M, под действием трех необратимых ингибиторов семейства ERBB, по сравнению с гефитинибом.

На фиг.5 показаны нуклеотидная (SEQ ID NO: 2) и аминокислотная последовательности (SEQ ID NO: 1) EGFR.

На фиг.6 показано, что, подобно гефитинибу, HKI 357 и EKB 569 (меченные "Wyeth") обладают повышенной способностью убивать клетки NSCLC, несущие мутацию EGFR, однако клоны, устойчивые к данным лекарственным средствам, образуются in vitro не так легко, как клоны, устойчивые к гефитинибу, и указанные соединения сохраняют способность эффективно подавлять гефитиниб-устойчивые клоны.

Подробное описание изобретения

Раковые заболевания, устойчивые к гефитинибу и эрлотинибу

Гефитиниб (соединение ZDl 839, разработанное AstraZeneca UK Ltd.; доступное под торговым наименованием IRESSA) и эрлотиниб (соединение OSI-774, разработанное Genentech, Inc. and OSI Pharmaceuticals, Inc.; доступное под торговым наименованием TARCEVA) вызывают интенсивные клинические ответы в случаях немелкоклеточного рака легких (NSCLC), несущего мутации, приводящие к активации рецептора EGF (EGFR) (1-3), на который и направлены данные конкурентные ингибиторы связывания АТФ (4, 5). Эффективность указанных ингибиторов тирозинкиназ может быть обусловлена как изменениями в расщеплении АТФ, связанными с данными мутациями, которые приводят к усилению ингибирования мутантных киназ под действием указанных соединений, так и биологической зависимостью раковых клеток от повышенных уровней сигналов выживания, передаваемых мутантными рецепторами, явлением, описанным как "зависимость от онкогена" (6, 7).

Хотя терапевтические ответы на гефитиниб и эрлотиниб могут продолжаться до 2-3 лет, средняя продолжительность ответа в большинстве случаев NSCLC составляет только 6-8 месяцев (8-10). Механизмы, лежащие в основе приобретенной устойчивости к лекарственным средствам, полностью не ясны. По аналогии с иматинибом (GLEEVEC), который ингибирует киназу BCR-ABL, участвующую в развитии хронических миелоидных лейкозов (CML), киназу C-KIT, участвующую в развитии желудочно-кишечных стромальных опухолей (GIST), и киназу FIP1L1-PDGFR-α, участвующую в развитии идиопатического синдрома гиперэозинофилии (HES), мутации во втором киназном домене потенциально могут подавлять связывание лекарственного средства (11-16). Однако при рецидивирующем NSCLC взятие образцов для биопсии затруднено; следовательно, для анализа доступно только ограниченное количество образцов. Недавно было обнаружено, что в трех из шести случаев рецидивирующего заболевания после лечения гефитинибом или эрлотинибом в киназном домене EGFR присутствует вторая одиночная мутация, T790M (17, 18). Кодон 315 BCR-ABL, аналогичный кодону 790 EGFR, часто мутирует при иматиниб-устойчивом CML (11, 12), а мутация соответствующего остатка в C-XJr (кодон 670) и FIP1L1-PDGFR-α(кодон 674) связана с иматиниб-устойчивыми GIST и HES соответственно (15, 16). Ранняя модель устойчивости к ингибиторам EGFR in vitro показывает, что мутация кодона 790 в рецепторе дикого типа подобным образом подавляет ингибирование под действием ингибитора тирозинкиназы EGFR (19). В последнее время было показано, что трансфицированные белки EGFR, содержащие активирующие мутации наряду с заменой T790M, меньше подвержены ингибированию под действием гефитиниба и эрлотиниба (17, 18). Хотя мутация T790M, судя по всему, участвует в приобретении устойчивости в некоторых случаях NSCLC, механизмы, лежащие в основе неудачного лечения при отсутствии вторичных мутаций EGFR, остаются невыясненными.

В противоположность цитоплазматической киназе BCR-ABL мембраносвязанный EGFR опосредует сигнальный путь, представляющий собой сложный каскад, который включает в себя связывание лиганда, гомодимеризацию рецептора и гетеродимерзацию с ERBB2 и другими членами семейства с последующими интернализацией и утилизацией связанного с лигандом рецептора или опосредованной убихитином деградацией рецептора (20). Полагают, что EGF-зависимый сигнальный путь в значительной мере осуществляется в процессе интернализации, которая связана с диссоциацией комплексов EGFR при низком значении рН, присутствующем во внутриклеточных везикулах. По существу, несколько факторов модулируют силу и качество сигнала, передаваемого рецептором, а изменения в направленной миграции EGFR тесно связаны с регуляцией EGF-зависимых клеточных ответов (20).

В основе настоящего изобретения лежит открытие, заключающееся в том, что устойчивые к гефитинибу раковые заболевания включают в себя заболевания, при которых EGFR, содержащий мутацию T790M, присутствует только в некоторых устойчивых опухолевых клетках, а также заболевания, при которых мутация T790M отсутствует, но наблюдается повышенная интернализация EGFR. Данное изобретение также основано на открытии, заключающемся в том, что необратимые ингибиторы EGFR, которые образуют ковалентные поперечные связи с рецептором, эффективно подавляют развитие раковых заболеваний, при которых присутствует мутация T790M, а также раковых заболеваний, при которых происходит изменение направленной миграции EGFR, что придает таким заболеваниям устойчивость к гефитинибу и/или эрлотинибу. Соответственно, настоящее изобретение предлагает способ лечения раковых заболеваний, устойчивых к гефитинибу и/или эрлотинибу, включающий в себя введение необратимых ингибиторов EGFR.

Способ лечения пациента

В одном воплощении настоящее изобретение предлагает способ лечения рака, устойчивого к гефитинибу/эрлотинибу. Данный способ включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества определенных необратимых ингибиторов EGFR, включающих в себя EKB-569 (4-анилинохинолин-3-карбонитрил; Greenberger et al., 11^th NCI-EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Amsterdam, November 7-10, 2000, abstract 388; Wyeth), HKI-357 (производное 4-анилинохинолин-3-карбонитрила; Tsou et al. J. Med. Chem. 2005, 48: 1107-1131; Wyeth) и/или HKI-272 (производное 4-анилинохинолин-3-карбонитрила; Rabindran et al., Cancer Res. 2004, 64, 3958-3965; Wyeth). В одном предпочтительном воплощении данное изобретение предлагает способ, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества EKB-569. В другом предпочтительном воплощении данное изобретение предлагает способ, включающий в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества HKI-357.

В данном способе лечения можно использовать сочетание разных средств, включающее в себя, без ограничения, сочетание ингибитора тирозинкиназы с другими ингибиторами тирозинкиназ, химиотерапевтическими средствами, лучевой терапией и др.

Раковые заболевания изначально могут быть диагностированы как чувствительные к гефитинибу/эрлотинибу, или предположительно имеющие чувствительность к гефитинибу/эрлотинибу, с помощью способов, описанных в Lynch et al., 2004; 350:2129-2139. Чувствительность к гефитинибу/эрлотинибу можно предсказать на основе присутствия в опухоли мутаций EGFR, включающих в себя, например, делецию остатков 747 (лизин) - 749 (глутаминовая кислота) в сочетании с мутацией в положении 750 (аланин), делецию остатков 747 (лизин) - 750 (аланин), замену аргинина на лейцин в положении 858, замену глутамина на лейцин в положении 861.

Раковые заболевания можно диагностировать как чувствительные к гефитинибу/эрлотинибу после начала лечения гефитинибом и/или эрлотинибом. Альтернативно, раковые заболевания можно диагностировать как чувствительные к гефитинибу/эрлотинибу перед началом лечения данными соединениями. Устойчивость опухоли к гефитинибу и/или эрлотинибу может начаться, например, через 6 месяцев после лечения гефитинибом и/или эрлотинибом, или позже. Альтернативно, устойчивость опухоли к гефитинибу и/или эрлотинибу можно диагностировать менее чем через 6 месяцев после начала лечения гефитинибом и/или эрлотинибом. Диагностирование устойчивости к гефитинибу и/или эрлотинибу можно проводить путем отслеживания развития опухоли в процессе лечения гефитинибом и/или эрлотинибом. Развитие опухоли можно детектировать путем сравнения состояния опухоли в момент времени после начала лечения и в момент времени до начала лечения гефитинибом и/или эрлотинибом. Развитие опухоли можно отслеживать в процессе лечения гефитинибом и/или эрлотинибом визуально, например, с помощью радиографических методов, таких как обследование с помощью рентгеновских лучей и компьютерная томография, или с помощью других методов наблюдения, известных специалистам в данной области, которые включают в себя пальпацию раковой опухоли или методы определения уровней опухолевых биомаркеров. Прогрессирование ракового заболевания в процессе лечения гефитинибом и/или эрлотинибом указывает на устойчивость к гефитинибу и/или эрлотинибу. Увеличение уровня опухолевых биомаркеров указывает на прогрессирование опухоли. Таким образом, увеличение уровней опухолевых биомаркеров в процессе лечения гефитинибом и/или эрлотинибом свидетельствует об устойчивости к гефитинибу и/или эрлотинибу. Наличие новых опухолей или метастазов также указывает на прогрессирование опухоли. Прекращение уменьшения опухоли свидетельствует о прогрессировании опухоли. Рост раковой опухоли определяют, например, по увеличению размера опухоли, наличию метастазов или новой раковой опухоли, и/или по повышению уровней опухолевых биомаркеров.

Развитие устойчивости к гефитинибу и/или эрлотинибу можно отслеживать путем тестирования опухолевых клеток, циркулирующих в кровотоке, на присутствие мутации, ассоциированной с устойчивостью к гефитинибу и/или эрлотинибу, указанные клетки можно получить из крови или других биологических жидкостей организма субъекта. Присутствие мутаций, ассоциированных с гефитинибом и/или эрлотинибом, в опухолевых клетках субъекта свидетельствует о том, что опухоль является устойчивой к гефитинибу и/или эрлотинибу.

В одном воплощении опухоль субъекта несет мутации, указывающие на чувствительность к гефитинибу и/или эрлотинибу, хотя при этом она является устойчивой к лечению гефитинибом и/или эрлотинибом. В одном воплощении опухоль субъекта несет мутации, указывающие на чувствительность к гефитинибу и/или эрлотинибу, и мутации, указывающие на устойчивость к гефитинибу и/или эрлотинибу, например мутацию T790M, то есть замену природного остатка треонина на метионин, в EGFR, например, приводящую к увеличению интернализации EGFR. В одном воплощении опухоль субъекта не несет мутации, указывающие на чувствительность к гефитинибу и/или эрлотинибу, и не несет мутации, указывающие на устойчивость к гефитинибу и/или эрлотинибу, такие как мутация T790M в EGFR, например, приводящая к увеличению интернализации EGFR.

В связи с введением лекарственного средства термин "эффективное количество" обозначает количество, которое, по меньшей мере, у статистически значимой группы пациентов вызывает благоприятный эффект, такой как улучшение симптомов, излечение, уменьшение тяжести заболевания, уменьшение массы опухоли или числа опухолевых клеток, увеличение продолжительности жизни, улучшение качества жизни, или другой эффект, который врачи, хорошо знакомые со способами лечения конкретного типа заболевания или состояния, обычно считают положительным.

Используемая эффективная доза активного ингредиента может варьировать в зависимости от конкретного используемого соединения, способа введения и тяжести состояния, подлежащего лечению. Опытному специалисту известно, что эффективная доза для каждого пациента может варьировать в зависимости от тяжести заболевания, индивидуальных генетических вариаций или скорости метаболизма. Однако, как правило, удовлетворительные результаты получают при использовании суточной дозы соединений данного изобретения, составляющей приблизительно от 0,5 до 1000 мг/кг массы тела, необязательно разделенной на два-четыре приема в день, или находящейся в виде формы, обеспечивающей замедленное высвобождение. Общая дневная доза может составлять приблизительно от 1 до 1000 мг, предпочтительно приблизительно от 2 до 500 мг. Лекарственные формы, подходящие для внутреннего применения, включают в себя приблизительно от 0,5 до 1000 мг активного соединения в однородной смеси с твердым или жидким фармацевтически приемлемым носителем. Данный дозировочный режим можно регулировать с получением оптимального терапевтического ответа. Например, можно вводить дозу, разделенную на несколько приемов в день, или дозу можно пропорционально уменьшить в зависимости от конкретной терапевтической ситуации.

Можно использовать внутривенный (I.V.), внутримышечный (I.M.), подкожный (S.C), внутрикожный (I.D.), внутрибрюшинный (I.P.), интратекальный (I.T.), внутриплевральный, внутриматочный, ректальный, вагинальный, местный, внутриопухолевый и т.п.способ введения. Соединения данного изобретения можно вводить парентерально путем инъекции или путем непрерывной инфузии в течение некоторого времени, кроме того, они могут доставляться с помощью перистальтических средств.

Введение можно осуществлять через слизистую оболочку или через кожу. В состав композиции для введения через слизистую оболочку или через кожу вводят вещества, облегчающие проникновение через соответствующий барьер (пенетранты). Такие пенетранты широко известны в данной области и включают в себя, например, соли желчных кислот для введения через слизистую оболочку и производные фусидовой кислоты. Для облегчения проникновения также можно использовать детергенты. Введение через слизистую оболочку можно осуществлять, например, с использованием назальных спреев или суппозиториев. Композиции соединений данного изобретения для перорального введения получают в виде традиционных форм, таких как капсулы, таблетки и тоники.

Для местного введения фармацевтическую композицию (ингибитора киназной активности) получают в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, широко известных в данной области.

Терапевтические композиции данного изобретения, например необратимых ингибиторов EGFR, обычно вводят внутривенно, например, путем инъекции однократной дозы. Термин "однократная доза" в применении к терапевтической композиции настоящего изобретения относится к физически дискретным формам, подходящим для однократного введения субъекту, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного вещества, рассчитанное так, чтобы получить желательный терапевтический эффект, в сочетании с необходимыми разбавителями, например носителем или средой для лекарства.

Композиции вводят с помощью способа, соответствующего составу композиции, в терапевтически эффективном количестве. Вводимое количество и время введения зависят от субъекта, подлежащего лечению, способности организма субъекта утилизировать активный ингредиент и желательного уровня терапевтического эффекта. Точное количество вводимого активного ингредиента устанавливает лечащий врач индивидуально для каждого пациента.

В данном документе описывается терапевтическая композиция, используемая для осуществления способов настоящего изобретения, например, содержащая необратимые ингибиторы EGFR. Специалистам в данной области известно, что для доставки композиций или лекарственных средств можно использовать любые системы, содержащие активные ингредиенты, которые подходят для предполагаемого применения. Фармацевтически приемлемые носители, подходящие для перорального, ректального, местного или парентерального (в том числе ингаляционного, подкожного, внутрибрюшинного, внутримышечного и внутривенного) введения известны специалистам в данной области. Фармацевтически приемлемым является носитель, совместимый с другими ингредиентами композиции и не оказывающий вредного воздействия на реципиента.

В данном описании термины "фармацевтически приемлемый", "физиологически допустимый", а также их грамматические вариации в применении к композициям, носителям, разбавителям и реагентам используются как взаимозаменяемые и означают, что вещества при введении млекопитающему не вызывают нежелательных физиологических эффектов.

Композиции, подходящие для парентерального введения, как правило, включают в себя стерильные водные препараты активного соединения, которые предпочтительно являются изотоническими по отношению к крови реципиента. Такие композиции обычно содержат дистиллированную воду, 5% раствор декстрозы в дистиллированной воде или физиологическом растворе. Также можно использовать композиции, которые включают в себя концентрированные растворы или твердые вещества, содержащие активное соединение, которые после разбавления подходящим растворителем дают раствор, пригодный для указанного выше парентерального введения.

Для кишечного введения можно использовать дискретные формы, такие как капсулы, облатки, таблетки или пастилки, каждая из которых содержит инертный носитель и предварительно определенное количество активного соединения; в виде порошка или гранул; или в виде суспензии или раствора в водной или не водной жидкости, например в виде сиропа, эликсира, эмульсии или экстракта. Подходящими носителями, включающими в себя смазывающие средства, ароматизаторы, связующие средства и т.п., могут являться крахмалы или сахара.

Таблетки можно получить путем прессования или формования, необязательно с использованием одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Прессованные таблетки можно получить путем прессования в подходящей машине активного соединения в свободнотекучем виде, например в виде порошка или гранул, необязательно смешанного со вспомогательными ингредиентами, например, связующими средствами, смазывающими средствами, инертными разбавителями, поверхностно-активными или диспергирующими средствами. Формованные таблетки можно получить путем формования в подходящей машине смеси порошкообразного активного соединения и любого подходящего носителя.

Сироп или суспензию можно получить путем добавления активного соединения к концентрированному водному раствору сахара, например, сахарозы, к которому также могут быть добавлены любые вспомогательные ингредиенты. Такие вспомогательные ингредиенты могут включать в себя ароматизатор, средство, замедляющее кристаллизацию сахара, или средство, увеличивающее растворимость какого-либо другого ингредиента, такое как многоатомный спирт, например глицерин или сорбит.

Препаративные формы для ректального введения могут быть получен